1、紫杉醇對人樹突狀細胞生物活性影響摘要目的探討常用化療藥物紫杉醇（tax）對 人樹突狀細胞（dc）生物活性的影響及作用機制，為化療聯 合生物免疫治療抗腫瘤提供理論基礎。方法體外實驗：分 別在紫杉醇 5 ng/ml （b 組）、10 ng/ml （c 組）、20 ng/ml （d組）、40 ng/ml （e組）的濃度下及不加紫杉醇的條件下 （a組）培養dc細胞，檢測各組dc細胞的存活率、細胞成 熟標志物及細胞因子分泌量，探究紫杉醇對人樹突狀細胞生 物活性的影響，同時通過乳酸脫氫酶釋放法（ldh）測定與 紫杉醇處理的樹突細胞共培養的細胞因子誘導的殺傷細胞（cik）對肺癌a549細胞株的殺傷作用，測定

2、紫杉醇對樹突 細胞抗原呈遞作用的影響。體內實驗：采用人肺癌細胞株 a549的腫瘤組織塊，皮下接種于裸鼠腋下，建立裸鼠肺癌模 型。2 d后將30只裸鼠隨機分成5組，分別為a組（對照組）: 細胞株a549+鹽水（ns）； b組:細胞株a549+dc+cik； c組: 細胞株a549+cik+tax； d組：細胞株a549+tax； e組：細胞 株a549+tax+dc+cik。每3天檢測1次腫瘤大小、裸鼠存活 時間。結果 體外實驗：在共培養6 d的前提下，b、c組第 6天存活率與第0天存活率比較，差異無統計學意義（p > 0.05）, d、e組第6天存活率與第0天存活率比較，差異有 高度統計

3、學意義（p 0. 05） between the cell survivalrates in group b and group c on the day 6 and that on day 0 after cocuitured 6 days there was significant statistical difference ( pkey wordspaclitaxel ； human dendritic cells ； biological activity； lung cancer惡性腫瘤在我國居民疾病致死原因中位列第三，其中肺 癌的致死率逐年上升。最近的研究數據顯示，肺癌已經超過

4、胃癌，成為所有癌癥中每年致死人數最多的腫瘤1。目前 腫瘤主要的治療方法為外科手術切除，化療、放療。但腫瘤 患者經過手術、常規化療、放療達到臨床治愈后，體內仍殘 留腫瘤細胞，停止治療后，殘留的腫瘤細胞又開始增殖，經 若干時間后會達到109個細胞，出現臨床復發，這是治療失 敗的主要原因之一。生物免疫治療作為新的治療方法最近得 到了廣泛的關注，其具有靶向殺傷、特異性高、不良反應小 以及可以殺傷對化療耐藥的腫瘤細胞等優勢2-3 o目前在 國內、外得到廣泛應用的免疫細胞治療是樹突狀細胞 (dendrite cell, dc)和細胞因子誘導的殺傷細胞(cytokine induced killer cel

5、ls, cik)兩種細胞聯合治療腫瘤，但 傳統治療理念認為化療藥物可以殺死免疫細胞，所以生物免 疫治療經常在化療間歇期進行，筆者查閱了一些國外的文 獻，認為只要掌握好化療藥物的劑量，在化療期間也可應用 免疫細胞治療，本實驗通過體外和體內兩種途徑，探究化療 藥物紫杉醇對免疫細胞dc、cik生物活性的影響和對抑制腫 瘤能力的調控，為化療期間同時應用免疫細胞治療提供基礎 理論依據。1材料與方法1.1材料1. 1. 1腫瘤細胞株肺癌a549細胞株來源于中國醫科大 學腫瘤研究所，由遼寧省人民醫院生物治療中心實驗室體外 傳代培養。1.1.2藥品及試劑 基因重組人il-2 （北京雙鷺藥業股 份有限公司）、抗

6、-cd3單抗（cd3mcab）、淋巴細胞分離液 （ficoll paque plus 公司）、triton x-100 （德國 applichem 公司）、基因重組人ifn-y （上海凱茂生物醫藥有限公司）、 白細胞介素t （il-1）、rpmi medium 1640培養基（美國 gibc0）、胎牛血清（美國gibco）、pbs緩沖液、紫杉醇注射 液、酶聯免疫檢測儀、全自動血細胞分析儀、24及96孔板、 復方枸椽酸鈉保存液、流式細胞檢測抗體anti-cd86-fitc、 anti-cd40-pe、anti-mhcii-pe、anti-ilt2-pe 均來自 bd 公司。ldh elisa試劑

7、盒。1. 1. 3實驗動物30只spf級balb/c裸鼠，購于北京華 阜康科技股份有限公司，（許可證號:scxk （京）2009-004）, 由沈陽中海生物技術開發有限公司動物中心飼養，雌性，鼠 齡68周，體重1822 go1. 2方法1.2. 1凍融法制備肺癌a549細胞抗原消化收集對數生 長期的a549細胞，用pbs液離心洗滌兩次，再用pbs液重 懸為1x1010個/l,封裝入凍存管。置-8（tc冰箱冷凍10 min, 重復3次，然后，以10 000 r/min離心30 min,取上清液 -20°c保存備用。1.2.2 dc細胞誘導、擴增 機采健康人外周血35 ml, 用fico

8、ll密度梯度離心，分離單個核細胞。用pbs洗滌2 次并計數。離心并將細胞重懸浮于rpmi 1640培養基中，置 37°c. 5% c02培養箱培養2 ho收集非黏附性細胞于50 ml 離心管中，用于誘導cik細胞。在留有貼壁細胞的培養瓶中 加入含有 1000 u/ml rhgm-csf 和 1000 u/ml rhil-4 的 10% 胎牛血清rpmi-1640培養液100 ml,分5組培養，分別在紫 杉醇 5 ng/ml （b 組）、10 ng/ml （c 組）、20 ng/ml （d 組）、 40 ng/ml （e組）的濃度下及不加紫杉醇的條件下（a組） 培養dc細胞，每3天半量

9、換液，同時補足上述rhgm-csf及 rhil-4,置于37°c. 5% c02培養箱培養，于dc培養第5天 加入10 ul/ml肺癌a549細胞凍融抗原，第6天加入1000 u/ml腫瘤壞死因子，分別收集培養第7天的各組dc細胞， 檢測各組dc細胞的存活率，并用于其他實驗。1.2.3各組dc細胞表型、細胞因子檢測各組dc細胞 上清培養液用于il-12的流式細胞檢驗。沉淀的細胞用facs 緩沖溶液(hbss, 2% fbs, 0. 05% naazide)洗滌，并用含 有符合流式儀器要求的anti-cd86-pe、anti-cd40-pe、 anti-mhcii-pe抗體的facs重

10、懸浮，在4°c下培養30 min。 用facs緩沖溶液洗滌兩遍，用流式細胞儀分析，所得數據 用facsdiva軟件分析(美國bd公司)。1. 2. 4 cik細胞的誘導和擴增 將上述誘導dc時收集的 非貼壁細胞，調整細胞密度至1x106個/ml,用于cik細胞 培養。當天加入ifn-y (1000 u/ml), 24 h后加入cd3單 抗(50 ng/ml)、 il-2 (300 u/ml)、 il-1a (100 u/ml), 置于37°c, 5% co2培養箱中，第3天以后視培養情況補液 或傳代，連續培養14 d,用于實驗。1. 2. 5裸鼠肺癌腫瘤模型的建立 收集對數

11、生長期的 a549人肺癌細胞，離心棄上清，將細胞濃度調整為 5x107/ml,取混勻的細胞懸液接種于裸鼠右側腋下皮下， 待腫瘤體積達到500 mm3以上時，將腫瘤切成2mmxl mmxl mni大小的瘤塊，接種于新購裸鼠右側腋下皮下，體內傳3代 后進行分組給藥。1.2.6乳酸脫氫酶釋放法(ldh)測定dc抗原傳遞能力 按文獻14所建立的方法進行殺傷實驗。取a549肺癌細胞 株處于生長對數期的細胞，調整濃度至1x105a1l作為靶細 胞置于37°c. 5% c02的培養箱中培養4 h。4 h后分別取紫 杉醇處理 的dc(c組)和正常培養的dc細胞(a組)5x105/ml與培養第14天的

12、cik細胞1 x 107/ml共培養3 d作為效應 細胞，進行殺傷實驗：分別按照效靶比5、10、20 （效應細 胞數量按照ix 107/ml計算）將效應細胞與靶細胞混合，500 r/min離心5 min,共同孵育于37°c、5% c02的培養箱6 h 之后，離心1500 r/min離心10 min,取上清按照試劑盒說 明在用酶標儀在450 nm處測量吸光值，計算殺傷活性：殺 傷活性（）=（實驗組a值-總自然釋放a值）/ （最大釋 放組a值-總自然釋放a值）x100%。總自然釋放a值二靶 細胞自然釋放a值+效應細胞自然釋放a值。1.2.7動物實驗分組給藥及檢測指標按照上述方法建立裸鼠肺

13、癌 模型，2d后將30只裸鼠隨機分成5組，分別為a組（對照 組）：細胞株a549+鹽水（ns）； b組:細胞株a549+dc+cik； c 組：細胞株 a549+cik+tax； d 組：細胞株 a549+tax； e 組： 細胞株a549+tax+dc+cik。各組具體用藥情況見表1。每3 天檢測1次腫瘤大小，裸鼠存活時間，紫杉醇（tax）按每 只裸鼠20 mg/kg腹腔注射，cik細胞為培養14 d之后的成 熟細胞，dc細胞按文中方法培養并激活，將各組細胞配成 1x107/0.2 ml,尾部靜脈注射連續5 d, ns為生理鹽水對 照。瘤體積（v） =0.5x長徑x短徑的平方，計算每組裸鼠 平均存活時間。表1各組用藥情況注：ns：鹽水；dc：樹突狀細胞；cik：細胞因子誘導的殺傷細胞；tax：紫杉醇1. 3統計學方法本實驗所收集數據用spss 17.0軟件進行統計學分析。 計量資料采用均數土標準差（x±s）表示，組間比較采用t 檢驗，計數資料采用百分率表示，組間比較采用x2檢驗。 以p 0. 05）,說明dc細胞對于10 ng/ml以下的紫杉醇具有 較好的耐受能力。濃度在10 ng/ml以上的紫杉醇會顯著降