1、一、比色分析一、比色分析1 1比色分析理論比色分析理論Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律 A = lgA = lg（I I0 0/I/I）KCL KCL 或或 I II I0 01010- -KCLKCL I I0 0：入射光強(qiáng)度：入射光強(qiáng)度 I I：透過(guò)光強(qiáng)度：透過(guò)光強(qiáng)度 K K：常數(shù)：常數(shù) C C：溶液濃度：溶液濃度 L L：溶液的厚度：溶液的厚度第1頁(yè)/共96頁(yè)（1 1）郎伯定律）郎伯定律 I0 It l L -dIIdl， -dIaIdl， dI/I=-adl 積分 It L dI/I -a dl 得： ln(I0 / It)-aL I0 0 將ln改為lg，

2、則為：lg（ I0 / It）-0.434aLKL 令lg（ I0 / It） A，則A KL第2頁(yè)/共96頁(yè)（2 2）比爾定律）比爾定律 A AK K”C C（3 3）郎伯）郎伯- -比爾定律比爾定律 A AKLCKLC第3頁(yè)/共96頁(yè)透光率（透光率（transmittancetransmittance，T T，透射率），透射率） T TI / II / I0 0吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A）光密度（光密度（eptical densityeptical density，D D或或ODOD） A Alg Ilg I0 0/I/I-lgT-lgT T T101

3、0-A-A1010-KCL-KCL A AKCLKCL當(dāng)當(dāng)L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示，則表示，則K K即稱(chēng)之為摩爾吸光系數(shù)，用即稱(chēng)之為摩爾吸光系數(shù)，用表示。表示。當(dāng)當(dāng)C C1mol/L1mol/L，L L1cm1cm，則，則A A。第4頁(yè)/共96頁(yè)T T與與A A的關(guān)系的關(guān)系 透光率（T） 吸光度（A） 1 0.000 0.75 0.125 0.5 0.301 0.25 0.602 0.17 0.770 0.1 1.000 0.05 1.301 0.01 2.000 0.001 3.000第5頁(yè)/共96頁(yè)2 2影響因素影響因素（1 1）化學(xué)因素的影響）化學(xué)因素的影響

4、 溶液中溶質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合，與溶劑間的作用等原溶液中溶質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合，與溶劑間的作用等原因而出現(xiàn)偏離比爾定律的現(xiàn)象。由化學(xué)因素引起的偏離，有時(shí)可控制溶液因而出現(xiàn)偏離比爾定律的現(xiàn)象。由化學(xué)因素引起的偏離，有時(shí)可控制溶液條件設(shè)法減免。此外，能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)也可導(dǎo)致偏離比爾定律。條件設(shè)法減免。此外，能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)也可導(dǎo)致偏離比爾定律。第6頁(yè)/共96頁(yè)（2 2）非單色光的影響）非單色光的影響 比爾定律的一個(gè)重要條件是單色光，但在比色分析中常有不同波長(zhǎng)的比爾定律的一個(gè)重要條件是單色光，但在比色分析中常有不同波長(zhǎng)的光同時(shí)存在。這就使吸光度發(fā)生改變，從而偏離比爾定律。光同

5、時(shí)存在。這就使吸光度發(fā)生改變，從而偏離比爾定律。第7頁(yè)/共96頁(yè)波長(zhǎng)的選擇波長(zhǎng)的選擇可見(jiàn)綠色帶黃深黃桔紅深紅深紫青紫紫藍(lán)藍(lán)色帶綠綠色帶藍(lán)深綠Ultra-violet紫外200400深紫深紅桔紅深黃綠色帶黃暗綠綠色帶藍(lán)藍(lán)色帶綠紫藍(lán)青紫被測(cè)溶液顏色顏色750800610750595610560580580595500560490500480490435480400435波長(zhǎng)(nm)第8頁(yè)/共96頁(yè)（3 3）光學(xué)因素的影響）光學(xué)因素的影響 散射是向空間各個(gè)方向，而使透射光減弱。反射可使光能損失，當(dāng)光散射是向空間各個(gè)方向，而使透射光減弱。反射可使光能損失，當(dāng)光線(xiàn)通過(guò)兩種不同介質(zhì)時(shí)，則發(fā)生反射。當(dāng)樣本溶

6、液與空白溶液的折射率有線(xiàn)通過(guò)兩種不同介質(zhì)時(shí)，則發(fā)生反射。當(dāng)樣本溶液與空白溶液的折射率有較大差異時(shí)，導(dǎo)致吸收值的偏差。較大差異時(shí)，導(dǎo)致吸收值的偏差。（4 4）非平行光通過(guò)吸收池時(shí)，由于光線(xiàn)的傾斜使厚度）非平行光通過(guò)吸收池時(shí)，由于光線(xiàn)的傾斜使厚度L L增大而影響測(cè)量值。增大而影響測(cè)量值。第9頁(yè)/共96頁(yè)3 3比色法的誤差比色法的誤差（1 1）儀器誤差）儀器誤差 濾光片，狹縫過(guò)寬，光電池疲濾光片，狹縫過(guò)寬，光電池疲勞，儀器結(jié)構(gòu)，散熱不良。勞，儀器結(jié)構(gòu)，散熱不良。（2 2）方法誤差）方法誤差 （3 3）操作誤差）操作誤差第10頁(yè)/共96頁(yè)比色法舉例比色法舉例1. 1. 總蛋白總蛋白(TP)(TP)蛋白

7、質(zhì)中的肽鍵+Cu 2+ 堿性條件 紫紅色絡(luò)合物引起在波長(zhǎng)540560nm范圍內(nèi)吸光度的上升, 與總蛋白含量成正比2. 2. 白蛋白白蛋白(ALB)(ALB)白蛋白+溴甲酚綠 pH4.2 白蛋白溴甲酚綠復(fù)合物引起在波長(zhǎng)630nm范圍內(nèi)吸光度的上升, 與白蛋白含量成正比第11頁(yè)/共96頁(yè)二、分光光度計(jì)二、分光光度計(jì)1 1光源光源熱光源熱光源: : 鎢燈、鹵鎢燈（鎢燈、鹵鎢燈（3203202500nm2500nm）氣體放電光源：氣體放電光源： 氫燈、氘燈（氫燈、氘燈（185185375nm375nm）。）。 氘燈發(fā)光強(qiáng)度比氫燈強(qiáng)氘燈發(fā)光強(qiáng)度比氫燈強(qiáng)3 35 5倍，是目前紫外光區(qū)常用光源。倍，是目前紫

8、外光區(qū)常用光源。 第12頁(yè)/共96頁(yè) 2. 2. 單色器單色器 單色器是一種用來(lái)把光源發(fā)出的復(fù)合光分解成單色光，并能任意改變所需波長(zhǎng)單色器是一種用來(lái)把光源發(fā)出的復(fù)合光分解成單色光，并能任意改變所需波長(zhǎng)的裝置。的裝置。 (1)(1)棱鏡棱鏡 玻璃棱鏡的折射率大、色散能力也大，因而分辨本領(lǐng)高。但它吸收紫外光，因玻璃棱鏡的折射率大、色散能力也大，因而分辨本領(lǐng)高。但它吸收紫外光，因此只適用于此只適用于3503503000nm3000nm的波長(zhǎng)范圍。的波長(zhǎng)范圍。 石英棱鏡對(duì)紫外光吸收少，適用于石英棱鏡對(duì)紫外光吸收少，適用于195-4000nm195-4000nm間分光。但由于石英棱鏡折射間分光。但由于石

9、英棱鏡折射率低于玻璃，因而色散能力差。率低于玻璃，因而色散能力差。第13頁(yè)/共96頁(yè) (2)(2)光柵光柵 光柵是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光柵在質(zhì)量上，光柵是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光柵在質(zhì)量上，成本上都大大優(yōu)于機(jī)械光柵。因光柵分光在紫外和可見(jiàn)光區(qū)均適用，且色散力強(qiáng)、成本上都大大優(yōu)于機(jī)械光柵。因光柵分光在紫外和可見(jiàn)光區(qū)均適用，且色散力強(qiáng)、分辨率高，故近年生產(chǎn)的分光光度計(jì)大都采用光柵作單色器。分辨率高，故近年生產(chǎn)的分光光度計(jì)大都采用光柵作單色器。第14頁(yè)/共96頁(yè)3 3比色杯比色杯 比色杯可由玻璃和石英等材料制成，比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻

10、璃適用于玻璃適用于350nm350nm以上光區(qū)，而石英以上光區(qū)，而石英杯則適用于紫外和可見(jiàn)光區(qū)。杯則適用于紫外和可見(jiàn)光區(qū)。第15頁(yè)/共96頁(yè)4 4檢測(cè)器檢測(cè)器 在分光光度計(jì)中，把光信號(hào)轉(zhuǎn)變?cè)诜止夤舛扔?jì)中，把光信號(hào)轉(zhuǎn)變成電信號(hào)輸出的裝置稱(chēng)檢測(cè)器。成電信號(hào)輸出的裝置稱(chēng)檢測(cè)器。 光電池光電池 光電管光電管 光電倍增管光電倍增管 第16頁(yè)/共96頁(yè)雙波長(zhǎng)分光光度計(jì) 來(lái)自光源的光被兩個(gè)單色器分別分離出波長(zhǎng)為來(lái)自光源的光被兩個(gè)單色器分別分離出波長(zhǎng)為1 1和和2 2的兩束單色光。經(jīng)過(guò)的兩束單色光。經(jīng)過(guò)折波器后，兩束波長(zhǎng)不同的單色光交替地照射于同一樣品杯。樣品杯背后的光折波器后，兩束波長(zhǎng)不同的單色光交替地照射

11、于同一樣品杯。樣品杯背后的光電倍增管交替地接收到兩種波長(zhǎng)照射吸收池后所產(chǎn)生的信號(hào)。此信號(hào)經(jīng)電子電電倍增管交替地接收到兩種波長(zhǎng)照射吸收池后所產(chǎn)生的信號(hào)。此信號(hào)經(jīng)電子電路轉(zhuǎn)化為兩個(gè)吸光度之差路轉(zhuǎn)化為兩個(gè)吸光度之差A(yù) A。第17頁(yè)/共96頁(yè)三、酶法分析三、酶法分析 酶法分析包括兩方面的內(nèi)容：酶法分析包括兩方面的內(nèi)容： 借助酶來(lái)測(cè)定某一化合物的濃借助酶來(lái)測(cè)定某一化合物的濃度，如測(cè)定體液中的葡萄糖、甘油三度，如測(cè)定體液中的葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、尿素、尿酸、肌酐等。酯、膽固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 借助酶來(lái)測(cè)定另一種酶的活性，借助酶來(lái)測(cè)定另一種酶的活性，實(shí)際上是用酶來(lái)測(cè)定待測(cè)酶的產(chǎn)物，實(shí)際上是用酶來(lái)測(cè)

12、定待測(cè)酶的產(chǎn)物，如轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。如轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。第18頁(yè)/共96頁(yè)葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林 過(guò)氧化物酶 醌亞胺H2O尿素尿素尿素H2O 脲酶 2NH4+CO2NH4+-酮戊二酸NADH 谷氨酸脫氫酶 谷氨酸NAD+H2O第19頁(yè)/共96頁(yè)肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADH

13、H+ LDH 乳酸NAD+H2O第20頁(yè)/共96頁(yè)酶催化特點(diǎn)酶催化特點(diǎn)高度的特異性高催化效率作用條件溫和第21頁(yè)/共96頁(yè)酶的活性部位酶的活性部位底物結(jié)合部位催化部位第22頁(yè)/共96頁(yè)酶的輔助因子酶的輔助因子金屬離子輔基和輔酶NAD ，NADP第23頁(yè)/共96頁(yè)酶的分類(lèi)酶的分類(lèi)1. 氧化還原酶2. 轉(zhuǎn)移酶3. 水解酶4. 裂合酶5. 異構(gòu)酶6. 合成酶第24頁(yè)/共96頁(yè)酶的系統(tǒng)命名酶的系統(tǒng)命名應(yīng)將酶的一種或兩種底物以及催化反應(yīng)的性質(zhì)明確標(biāo)明。乳酸脫氫酶 L-乳酸：NAD+氧化還原酶肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶第25頁(yè)/共96頁(yè)酶的活性單位酶的活性單位一國(guó)際單位為在一分鐘內(nèi)催化轉(zhuǎn)變1個(gè)微摩爾

14、的反應(yīng)物的酶量.IUU U/L1Katal為每秒鐘轉(zhuǎn)化1mole底物的酶量1國(guó)際單位=16.67nKatal1Katal=6107國(guó)際單位第26頁(yè)/共96頁(yè)酶活性測(cè)定酶活性測(cè)定影響酶活性測(cè)定：底物、激活劑、抑制劑、緩沖液、pH、溫度、酶濃度。在最適條件下以求達(dá)到最大的反應(yīng)速度。但由于底物的溶解度低，或售價(jià)太高，或需連鎖的酶反應(yīng)，則必須對(duì)測(cè)定條件作修正。第27頁(yè)/共96頁(yè)酶活性測(cè)定的最適條件酶活性測(cè)定的最適條件1. 1.合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類(lèi)和濃度2. 2.指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度指示酶和輔助酶的種類(lèi)和濃度3. 3.反應(yīng)混合液的最

15、適反應(yīng)混合液的最適pHpH，緩沖液種類(lèi)和濃度，緩沖液種類(lèi)和濃度4. 4.去除各種抑制劑去除各種抑制劑第28頁(yè)/共96頁(yè)酶促反應(yīng)的兩個(gè)階段酶促反應(yīng)的兩個(gè)階段 反應(yīng)級(jí)數(shù) 0級(jí) 1級(jí) P 1.可逆反應(yīng)可逆反應(yīng) 2.產(chǎn)物抑制產(chǎn)物抑制 3.酶變性失活酶變性失活 v=dP/dt 4.底物不飽和底物不飽和 S 時(shí)間 t第29頁(yè)/共96頁(yè)酶反應(yīng)進(jìn)程和酶濃度曲線(xiàn)酶反應(yīng)進(jìn)程和酶濃度曲線(xiàn) 酶量E 40 1.E越大，線(xiàn)性反 產(chǎn) 應(yīng)期越短 物 2.E相同，S越小， P 20 線(xiàn)性反應(yīng)期越短 10 5 0 5 10 15 20 時(shí)間(min)第30頁(yè)/共96頁(yè)酶反應(yīng)時(shí)間曲線(xiàn)酶反應(yīng)時(shí)間曲線(xiàn) 時(shí)間(min) 5(t0) 反應(yīng)

16、時(shí)間越短， 10(t1) 線(xiàn)性范圍越大 15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量E第31頁(yè)/共96頁(yè)米氏方程米氏方程E + SESE + Pkkkk+1+2-2-1v=VSKm+SvV2S Km第32頁(yè)/共96頁(yè)米氏曲線(xiàn)米氏曲線(xiàn)SVVmaxKmVmax 2KmKm第33頁(yè)/共96頁(yè)米氏常數(shù)米氏常數(shù)米米- -孟氏公式：孟氏公式：v vVmS/(KmVmS/(KmS)S)當(dāng)當(dāng)SKmSKmSKm時(shí)，則時(shí)，則v vVmVm，即反，即反應(yīng)速度是一個(gè)常數(shù)，為零級(jí)反應(yīng)速度是一個(gè)常數(shù)，為零級(jí)反應(yīng)。應(yīng)。如如SSKmKm時(shí)，混合級(jí)反應(yīng)時(shí)，混合級(jí)反應(yīng)。第34頁(yè)/共96頁(yè)米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的意

17、義 如如v v0.5Vm0.5Vm，則，則KmKmSS，KmKm值等于酶促反應(yīng)的初速度為最大速度的一半時(shí)所值等于酶促反應(yīng)的初速度為最大速度的一半時(shí)所需的底物濃度。需的底物濃度。 KmKm等于等于ESES的解離常數(shù)；而的解離常數(shù)；而KmKm的倒數(shù)可代表酶和底物的親和力。的倒數(shù)可代表酶和底物的親和力。 KmKm是酶的特征性常數(shù)，當(dāng)是酶的特征性常數(shù)，當(dāng)pHpH、溫度和離子強(qiáng)度恒定時(shí)，、溫度和離子強(qiáng)度恒定時(shí)，KmKm只和酶及底物的性質(zhì)只和酶及底物的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。有關(guān)，而與酶濃度無(wú)關(guān)。 純度不同的同一種酶，如雜質(zhì)中沒(méi)有可使底物發(fā)生旁反應(yīng)的其它酶或酶的激活純度不同的同一種酶，如雜質(zhì)中沒(méi)有可使底

18、物發(fā)生旁反應(yīng)的其它酶或酶的激活劑和抑制劑，則劑和抑制劑，則KmKm的變化不大。的變化不大。第35頁(yè)/共96頁(yè)米氏常數(shù)的應(yīng)用米氏常數(shù)的應(yīng)用（1 1）如已知酶的）如已知酶的KmKm，可計(jì)算某一底，可計(jì)算某一底物濃度時(shí)的物濃度時(shí)的v/Vmv/Vm。（2 2）如要求）如要求v v占占VmVm一定的百分比，一定的百分比，也可算出所需底物濃度為其也可算出所需底物濃度為其KmKm的多的多少倍。少倍。（3 3）利用工具酶來(lái)測(cè)定某一底物的）利用工具酶來(lái)測(cè)定某一底物的濃度時(shí)，可計(jì)算工具酶的用量。濃度時(shí)，可計(jì)算工具酶的用量。第36頁(yè)/共96頁(yè)（4 4）測(cè)定幾個(gè)同工酶對(duì)同一底物）測(cè)定幾個(gè)同工酶對(duì)同一底物的的KmKm，

19、可估計(jì)是原級(jí)（，可估計(jì)是原級(jí)（ KmKm常有差常有差異）還是次生性同工酶（異）還是次生性同工酶（ KmKm接近接近或相同）。或相同）。（5 5）測(cè)定正逆方向底物的）測(cè)定正逆方向底物的KmKm，可，可大體知道該酶催化哪一方向?yàn)橹鳌４篌w知道該酶催化哪一方向?yàn)橹鳌＃? 6）如已知一組酶中各酶的）如已知一組酶中各酶的KmKm及及其相應(yīng)底物的濃度，有助于尋找其相應(yīng)底物的濃度，有助于尋找限速步驟。限速步驟。第37頁(yè)/共96頁(yè)KmKm的求取的求取 Lineweaver-Burk作圖法 1/v(Km/Vm)(1/S)1/Vm Eadie-Hofstee作圖法 vVmKm(v/S) Eisenthal和Corn

20、ish-Bowden作圖法 設(shè)Y軸和X軸分別為求取Vm及Km的座標(biāo)，將不同S濃度點(diǎn)在X軸的負(fù)側(cè)；相應(yīng)的反應(yīng)速度點(diǎn)在Y軸上，連接各線(xiàn)，交點(diǎn)在Y軸上的座標(biāo)為Vm，在X軸上的座標(biāo)為Km。第38頁(yè)/共96頁(yè)酶活性測(cè)定的基本知識(shí)酶活性測(cè)定的基本知識(shí) 酶活性是通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程酶活性是通過(guò)測(cè)定酶促反應(yīng)過(guò)程中單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的中單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，即測(cè)定酶促反應(yīng)的速率來(lái)獲生成量，即測(cè)定酶促反應(yīng)的速率來(lái)獲得的。得的。第39頁(yè)/共96頁(yè)（1 1）定時(shí)法）定時(shí)法 測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始后某一時(shí)間內(nèi)（測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始后某一時(shí)間內(nèi)（t t1 1到到t t2 2）產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來(lái)求取）產(chǎn)

21、物或底物濃度的總變化量來(lái)求取酶反應(yīng)初速度的方法稱(chēng)為定時(shí)法。酶反應(yīng)初速度的方法稱(chēng)為定時(shí)法。 產(chǎn)產(chǎn) 2 2 物物 3 3 生生 1 1 成成 t t1 1 t t2 2 第40頁(yè)/共96頁(yè)（2 2）連續(xù)監(jiān)測(cè)法）連續(xù)監(jiān)測(cè)法 連續(xù)測(cè)定（每連續(xù)測(cè)定（每15s15s1min1min監(jiān)測(cè)一次）酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的監(jiān)測(cè)一次）酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化來(lái)求出酶反應(yīng)初速度的方法稱(chēng)為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，又稱(chēng)動(dòng)力學(xué)法濃度隨時(shí)間的變化來(lái)求出酶反應(yīng)初速度的方法稱(chēng)為連續(xù)監(jiān)測(cè)法，又稱(chēng)動(dòng)力學(xué)法或速率法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)果連接成線(xiàn)，很易找到成直線(xiàn)或速率法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可將多點(diǎn)的測(cè)定結(jié)

22、果連接成線(xiàn)，很易找到成直線(xiàn)的區(qū)段，來(lái)計(jì)算酶活性。此法較為準(zhǔn)確。的區(qū)段，來(lái)計(jì)算酶活性。此法較為準(zhǔn)確。 分為直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法和間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法。分為直接連續(xù)監(jiān)測(cè)法和間接連續(xù)監(jiān)測(cè)法。 法法. .第41頁(yè)/共96頁(yè)連續(xù)監(jiān)測(cè)法的測(cè)定時(shí)間連續(xù)監(jiān)測(cè)法的測(cè)定時(shí)間 吸 光 度 A3 A2 A1 t1 t2 t3 t4 時(shí)間第42頁(yè)/共96頁(yè)（3 3）平衡法）平衡法 通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始至反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量來(lái)求出酶活性的方法稱(chēng)為平衡底物濃度總變化量來(lái)求出酶活性的方法稱(chēng)為平衡法。用平衡法測(cè)定時(shí)，因產(chǎn)物的增加或底物的減法。用平衡法測(cè)定時(shí)，因產(chǎn)物的增加或底物的減少與反

23、應(yīng)時(shí)間不成線(xiàn)性，故不能把少與反應(yīng)時(shí)間不成線(xiàn)性，故不能把PP或或SS的總的總變化量除以變化量除以t t來(lái)代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化。來(lái)代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化。另外，平衡法也會(huì)受到產(chǎn)物抑制、可逆反應(yīng)等因另外，平衡法也會(huì)受到產(chǎn)物抑制、可逆反應(yīng)等因素的影響，由于反應(yīng)時(shí)間較定時(shí)法長(zhǎng)，故這種影素的影響，由于反應(yīng)時(shí)間較定時(shí)法長(zhǎng)，故這種影響會(huì)更大，測(cè)定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān)測(cè)法低。對(duì)于有響會(huì)更大，測(cè)定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān)測(cè)法低。對(duì)于有些零級(jí)反應(yīng)期很短的酶促反應(yīng)，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法和些零級(jí)反應(yīng)期很短的酶促反應(yīng)，用連續(xù)監(jiān)測(cè)法和定時(shí)法很難測(cè)出其初速度，也只得采用平衡法測(cè)定時(shí)法很難測(cè)出其初速度，也只得采用平衡法測(cè)定。定。第43頁(yè)/共

24、96頁(yè)定時(shí)法與連續(xù)法比較定時(shí)法與連續(xù)法比較 定時(shí)法定時(shí)法 條件無(wú)限制 試劑需量少，經(jīng)濟(jì) 采用放射性試劑時(shí)，靈敏度高 結(jié)果不能立刻揭曉 人工操作多，費(fèi)時(shí) 毋需偶聯(lián)酶 產(chǎn)物會(huì)生抑制作用 連續(xù)法連續(xù)法 因偶聯(lián)酶使條件受限制 需量較大 與放射性試劑來(lái)比，靈敏度低 結(jié)果立刻揭曉 人工操作少 偶聯(lián)酶的費(fèi)用很大 偶聯(lián)作用能消耗產(chǎn)物第44頁(yè)/共96頁(yè)（一）工具酶及酶偶聯(lián)反應(yīng)（一）工具酶及酶偶聯(lián)反應(yīng) 通過(guò)酶偶聯(lián)反應(yīng)間接地測(cè)出通過(guò)酶偶聯(lián)反應(yīng)間接地測(cè)出第一個(gè)酶促反應(yīng)中待測(cè)物的濃度或第一個(gè)酶促反應(yīng)中待測(cè)物的濃度或待測(cè)酶的活性。那些作為試劑用于待測(cè)酶的活性。那些作為試劑用于測(cè)定化合物濃度或酶活性的酶稱(chēng)為測(cè)定化合物濃度或

25、酶活性的酶稱(chēng)為工具酶。工具酶。第45頁(yè)/共96頁(yè)AB 酶1 CDC（或D）E 酶2 FGF（或G）H 酶3 IJ酶1：待測(cè)酶酶2：輔助酶酶3：指示酶E、H：輔助底物第46頁(yè)/共96頁(yè)在利用工具酶的反應(yīng)中，唯一的限在利用工具酶的反應(yīng)中，唯一的限速因子應(yīng)該是待測(cè)化合物或待測(cè)酶。速因子應(yīng)該是待測(cè)化合物或待測(cè)酶。對(duì)工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑對(duì)工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑制劑等）的含量也有一定的限制，制劑等）的含量也有一定的限制，以減少或避免干擾測(cè)定的副反應(yīng)。以減少或避免干擾測(cè)定的副反應(yīng)。第47頁(yè)/共96頁(yè) 如果工具酶制劑中污染了待測(cè)酶會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響。如果工具酶制劑中污染了待測(cè)酶會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果

26、產(chǎn)生嚴(yán)重影響。 如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASTAST）測(cè)定的工具酶是蘋(píng)果酸脫氫酶（）測(cè)定的工具酶是蘋(píng)果酸脫氫酶（MDHMDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ASTAST，則當(dāng)，則當(dāng)ASTAST活性為活性為7U/L7U/L時(shí)，測(cè)定誤差為時(shí)，測(cè)定誤差為6%6%。 而測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（而測(cè)定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALTALT）的工具酶是乳酸脫氫酶（）的工具酶是乳酸脫氫酶（LDHLDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ALTALT，則當(dāng)，則當(dāng)ALTALT活性為活性為5U/L5U/L時(shí)測(cè)定誤差也是時(shí)測(cè)定誤差也是6%6%。第48頁(yè)/共96頁(yè)（二）常用監(jiān)測(cè)物質(zhì)的特性（二）常用監(jiān)測(cè)物

27、質(zhì)的特性1 1NADHNADH或或NADPHNADPH：乳酸脫氫酶（乳酸脫氫酶（LDHLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +蘋(píng)果酸脫氫酶（蘋(píng)果酸脫氫酶（MDHMDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +谷氨酸脫氫酶（谷氨酸脫氫酶（GLDHGLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶（磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDG6PD） 動(dòng)物動(dòng)物G6PD NADPG6PD NADP+ + 微生物微生物G6PD NADG6PD NAD+ +第49頁(yè)/共96頁(yè)NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm有特征性光吸有特征性光吸收，而它

28、們的氧化型收，而它們的氧化型NADNAD+ +或或NADPNADP+ +則則沒(méi)有這個(gè)吸收峰，沒(méi)有這個(gè)吸收峰，340nm340nm波長(zhǎng)處的波長(zhǎng)處的吸光度與吸光度與NADNAD（P P）H H的濃度成正比。的濃度成正比。另外另外NADNAD（P P）H H有強(qiáng)烈的熒光，其有強(qiáng)烈的熒光，其激發(fā)波長(zhǎng)為激發(fā)波長(zhǎng)為340nm340nm，發(fā)射波長(zhǎng)為，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm460nm。第50頁(yè)/共96頁(yè)max：340nm第51頁(yè)/共96頁(yè)肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨

29、基轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+ LDH 乳酸NAD+H2O第52頁(yè)/共96頁(yè)2 2H H2 2O O2 2指示反應(yīng)指示反應(yīng)葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、膽固醇氧化酶：用于葡萄糖、酶、膽固醇氧化酶：用于葡萄糖、尿酸、甘油、膽固醇的測(cè)定，可使尿酸、甘油、膽固醇的測(cè)定，可使相應(yīng)底物被相應(yīng)底物被O O2 2氧化成氧化成H H2 2O O2 2，H H2 2O O2 2可通可通過(guò)下列指示反應(yīng)來(lái)檢測(cè)過(guò)下列指示反應(yīng)來(lái)檢測(cè)。第53頁(yè)/共96頁(yè) 使單一的色素原顯色。無(wú)色色素原過(guò)氧化物酶（使單一的色素原顯色。無(wú)色

30、色素原過(guò)氧化物酶（PODPOD）存在下被）存在下被H H2 2O O2 2氧化后氧化后可生成有色的色素。可生成有色的色素。 使成對(duì)的色素原顯色。必須要兩個(gè)色素原共同存在，再在指示酶使成對(duì)的色素原顯色。必須要兩個(gè)色素原共同存在，再在指示酶PODPOD的催化的催化下生成色素。下生成色素。 發(fā)光反應(yīng)。發(fā)光反應(yīng)。H H2 2O O2 2也可用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè)，它是憑借某些熒光前身物在氧也可用化學(xué)發(fā)光反應(yīng)來(lái)監(jiān)測(cè)，它是憑借某些熒光前身物在氧化后，處于激發(fā)狀態(tài)的分子可發(fā)射光子，光子量和化后，處于激發(fā)狀態(tài)的分子可發(fā)射光子，光子量和H H2 2O O2 2的濃度成正比。的濃度成正比。第54頁(yè)/共96頁(yè)葡萄糖葡

31、萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林 過(guò)氧化物酶 醌亞胺H2O甘油三酯甘油三酯甘油三酯H2O 脂蛋白脂酶 甘油脂肪酸甘油ATP 甘油激酶 -磷酸甘油ADP -磷酸甘油O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羥丙酮H2O2 H2O2 +4-氨基安替比林+ESPAS 過(guò)氧化物酶 醌亞胺H2O ESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-間-茴香胺第55頁(yè)/共96頁(yè)3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物 芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：對(duì)芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：對(duì)- -硝基酚和有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成的酯類(lèi)硝基酚和有機(jī)酸或無(wú)機(jī)酸形成的酯類(lèi) 糖苷酶：對(duì)硝基酚和糖苷衍生物糖苷酶：對(duì)硝

32、基酚和糖苷衍生物 -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：對(duì)谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：對(duì)- -硝基苯胺的氨基酰衍生物硝基苯胺的氨基酰衍生物 故硝基苯酚或硝基苯胺作為底物的結(jié)合型化合物均無(wú)色，而一旦水解或游離型產(chǎn)物故硝基苯酚或硝基苯胺作為底物的結(jié)合型化合物均無(wú)色，而一旦水解或游離型產(chǎn)物在在pHpH大于大于8 8的堿性條件下能生成黃色的醌類(lèi)離子型化合物，在的堿性條件下能生成黃色的醌類(lèi)離子型化合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸有光吸收峰，其吸光度與濃度成正比。收峰，其吸光度與濃度成正比。第56頁(yè)/共96頁(yè)max：405nm第57頁(yè)/共96頁(yè)堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（ALPA

33、LP）磷酸對(duì)硝基苯H2O ALP 磷酸鹽對(duì)硝基苯酚 - -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ -GT-GT） -谷氨酰對(duì)硝基苯胺雙甘肽 -GT 谷氨酰基雙甘肽對(duì)硝基苯胺第58頁(yè)/共96頁(yè)（三）酶法分析的類(lèi)型（三）酶法分析的類(lèi)型 用工具酶測(cè)定體液中代謝物用工具酶測(cè)定體液中代謝物的濃度，一般可用兩種不同的測(cè)定方的濃度，一般可用兩種不同的測(cè)定方法。法。第59頁(yè)/共96頁(yè)1 1代謝物濃度的酶法分析代謝物濃度的酶法分析（1 1）終點(diǎn)法）終點(diǎn)法 將待測(cè)底物與工具酶保溫一定時(shí)間后，全部轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測(cè)的化合物，然后測(cè)將待測(cè)底物與工具酶保溫一定時(shí)間后，全部轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測(cè)的化合物，然后測(cè)定后者的總量來(lái)計(jì)算待測(cè)物的總量或濃度

34、。定后者的總量來(lái)計(jì)算待測(cè)物的總量或濃度。 尿素尿素H H2 2O O 尿素酶尿素酶 COCO2 22NH2NH3 3 乙醇乙醇NADNAD+ + 醇脫氫酶醇脫氫酶 乙醛乙醛NADHNADHH H+ + 反應(yīng)常呈一級(jí)反應(yīng)。反應(yīng)常呈一級(jí)反應(yīng)。 使待測(cè)底物完全轉(zhuǎn)變所需的時(shí)間取決于加入的工具酶量。使待測(cè)底物完全轉(zhuǎn)變所需的時(shí)間取決于加入的工具酶量。第60頁(yè)/共96頁(yè)（2 2）動(dòng)力學(xué)法）動(dòng)力學(xué)法 待測(cè)物不必完全轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測(cè)的化合物，而是利用工具酶反應(yīng)速率來(lái)待測(cè)物不必完全轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測(cè)的化合物，而是利用工具酶反應(yīng)速率來(lái)定量其濃度：定量其濃度： 一是利用零級(jí)反應(yīng)，如待測(cè)物是某個(gè)工具酶的激活劑或抑制劑，其濃一是利

35、用零級(jí)反應(yīng)，如待測(cè)物是某個(gè)工具酶的激活劑或抑制劑，其濃度可決定該工具酶的反應(yīng)速度，可采用此方法。因測(cè)定時(shí)該工具酶本身及度可決定該工具酶的反應(yīng)速度，可采用此方法。因測(cè)定時(shí)該工具酶本身及其底物都是足量的，故反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。其底物都是足量的，故反應(yīng)為零級(jí)反應(yīng)。 第61頁(yè)/共96頁(yè)例：測(cè)定血清中肝素AT 肝素 AT（AT為肝素與AT復(fù)合物）AT凝血酶 凝血酶-AT（無(wú)活性）殘余凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精-4NA 凝血酶 甲苯磺酰-甘-脯-精4-硝基苯胺 第62頁(yè)/共96頁(yè) 二是利用一級(jí)反應(yīng)，本法的基本要求是作為某一工具酶底物的待測(cè)物的濃二是利用一級(jí)反應(yīng)，本法的基本要求是作為某一工具酶底物的待測(cè)物的濃度

36、度SS必須遠(yuǎn)小于該工具酶的必須遠(yuǎn)小于該工具酶的KmKm。此時(shí)反應(yīng)速度基本上與。此時(shí)反應(yīng)速度基本上與SS成正比，呈一級(jí)反成正比，呈一級(jí)反應(yīng)。應(yīng)。 動(dòng)力學(xué)法較終點(diǎn)法具有簡(jiǎn)便、省時(shí)、干擾少、可測(cè)定低濃度物質(zhì)、不需樣動(dòng)力學(xué)法較終點(diǎn)法具有簡(jiǎn)便、省時(shí)、干擾少、可測(cè)定低濃度物質(zhì)、不需樣品對(duì)照以及易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，成為自動(dòng)化分析的主要方法。但此法必須同時(shí)品對(duì)照以及易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，成為自動(dòng)化分析的主要方法。但此法必須同時(shí)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的反應(yīng)速度，來(lái)推算未知樣品中待測(cè)物的濃度。測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)樣品的反應(yīng)速度，來(lái)推算未知樣品中待測(cè)物的濃度。第63頁(yè)/共96頁(yè)2 2酶活性測(cè)定的酶法分析酶活性測(cè)定的酶法分析 這類(lèi)酶學(xué)分析法是用

37、工具酶來(lái)測(cè)定這類(lèi)酶學(xué)分析法是用工具酶來(lái)測(cè)定待測(cè)酶的產(chǎn)物以求取待測(cè)酶的活性，待測(cè)酶的產(chǎn)物以求取待測(cè)酶的活性，適合于待測(cè)酶產(chǎn)物不能直接監(jiān)測(cè)的情適合于待測(cè)酶產(chǎn)物不能直接監(jiān)測(cè)的情況。況。 也可有終點(diǎn)法和動(dòng)力學(xué)法兩種。也可有終點(diǎn)法和動(dòng)力學(xué)法兩種。 第64頁(yè)/共96頁(yè)（1 1）終點(diǎn)法）終點(diǎn)法 將底物與待測(cè)酶反應(yīng)一定時(shí)間將底物與待測(cè)酶反應(yīng)一定時(shí)間后，終止反應(yīng)，再用指示酶測(cè)定該后，終止反應(yīng)，再用指示酶測(cè)定該時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量即可算出酶活時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的生成量即可算出酶活性。性。 第65頁(yè)/共96頁(yè)（2 2）偶聯(lián)反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué)）偶聯(lián)反應(yīng)的基本動(dòng)力學(xué) S Ex P1 Ei P2 應(yīng)先將樣品與工具酶預(yù)保溫，使樣品中的

38、內(nèi)源性干擾物充分催化消耗，然后加應(yīng)先將樣品與工具酶預(yù)保溫，使樣品中的內(nèi)源性干擾物充分催化消耗，然后加入底物入底物S S起動(dòng)反應(yīng)。起動(dòng)反應(yīng)。 起動(dòng)后，因起動(dòng)后，因P P從零開(kāi)始升高，故工具酶反應(yīng)速度也較低，不能代表待測(cè)酶反應(yīng)速?gòu)牧汩_(kāi)始升高，故工具酶反應(yīng)速度也較低，不能代表待測(cè)酶反應(yīng)速度，這一時(shí)期稱(chēng)為延滯期。度，這一時(shí)期稱(chēng)為延滯期。 隨著反應(yīng)進(jìn)行，進(jìn)入恒態(tài)期，只要工具酶用量足夠，就能正確地反映酶的活性隨著反應(yīng)進(jìn)行，進(jìn)入恒態(tài)期，只要工具酶用量足夠，就能正確地反映酶的活性. .第66頁(yè)/共96頁(yè) A 延遲期 恒態(tài)期 非恒態(tài)期 1.5 1.0 S Ex P1 Ei P2 0.5 0 30 60 90 1

39、20 150 180 秒 （以NADH減少為指示反應(yīng)） 如Ei用量過(guò)少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可導(dǎo)致P1的逐漸堆積，不能成為恒態(tài)或其延滯期極長(zhǎng)。但如Ei用量足夠，Vi等于或大于Vx，則P1一旦生成可較快或很快轉(zhuǎn)變成P2，P1產(chǎn)生與消失速度一致而成為恒態(tài)。第67頁(yè)/共96頁(yè)（四）酶活性濃度的計(jì)算（四）酶活性濃度的計(jì)算 Vt106U/L（A/min） VsLA 吸光度變化吸光度變化V Vt t為反應(yīng)系統(tǒng)總體積為反應(yīng)系統(tǒng)總體積V Vs s為樣品體積為樣品體積 為被測(cè)物的摩爾吸光系數(shù)為被測(cè)物的摩爾吸光系數(shù)(mol(mol-1-1 cm cm-1-1) )L

40、L為光徑為光徑10106 6是將是將molmol轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化成molmol。第68頁(yè)/共96頁(yè)常數(shù)常數(shù)K K值的意義和設(shè)置值的意義和設(shè)置 Vt106U/L（A/min） VsL （A/min）K Vt106 K VsL 第69頁(yè)/共96頁(yè)常數(shù)常數(shù)K K值的檢驗(yàn)值的檢驗(yàn) ：pHpH；溫度；單色光；儀器信號(hào)接收；溫度；單色光；儀器信號(hào)接收V V：儀器加樣系統(tǒng)：儀器加樣系統(tǒng) 對(duì)一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對(duì)硝基酚、對(duì)硝基苯胺，可以用高純?cè)噭┡涑蓸?biāo)準(zhǔn)品，對(duì)一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對(duì)硝基酚、對(duì)硝基苯胺，可以用高純?cè)噭┡涑蓸?biāo)準(zhǔn)品，將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測(cè)定，根據(jù)其濃度和吸光度變化可計(jì)算出實(shí)際將它們作為標(biāo)本進(jìn)行酶的測(cè)定，

41、根據(jù)其濃度和吸光度變化可計(jì)算出實(shí)際K K值。值。 對(duì)對(duì)NAD(P)HNAD(P)H，可使用測(cè)葡萄糖試劑盒，對(duì)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點(diǎn)法測(cè)，可使用測(cè)葡萄糖試劑盒，對(duì)已知濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行終點(diǎn)法測(cè)定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)HNAD(P)H，故不難從吸光度變化求出，故不難從吸光度變化求出K K值。值。第70頁(yè)/共96頁(yè) 利用標(biāo)準(zhǔn)管的方法較簡(jiǎn)單，但標(biāo)利用標(biāo)準(zhǔn)管的方法較簡(jiǎn)單，但標(biāo)準(zhǔn)管的濃度必須在該比色法或紫外分光準(zhǔn)管的濃度必須在該比色法或紫外分光光度法測(cè)定的濃度線(xiàn)性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)曲光度法測(cè)定的濃度線(xiàn)性范圍內(nèi)。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法可得濃度和吸光度的線(xiàn)性范圍，

42、消線(xiàn)法可得濃度和吸光度的線(xiàn)性范圍，消除濃度過(guò)高偏離線(xiàn)性的影響，但標(biāo)準(zhǔn)曲除濃度過(guò)高偏離線(xiàn)性的影響，但標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備時(shí)間與測(cè)定樣品的時(shí)間不同，線(xiàn)的制備時(shí)間與測(cè)定樣品的時(shí)間不同，容易產(chǎn)生試劑批號(hào)、配制、實(shí)驗(yàn)溫度、容易產(chǎn)生試劑批號(hào)、配制、實(shí)驗(yàn)溫度、儀器工作狀態(tài)等因素造成的誤差。儀器工作狀態(tài)等因素造成的誤差。第71頁(yè)/共96頁(yè)單試劑、雙試劑、液體試劑單試劑、雙試劑、液體試劑1. 1. 單試劑的優(yōu)缺點(diǎn)單試劑的優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)便適用于各類(lèi)生化分析儀操作簡(jiǎn)便適用于各類(lèi)生化分析儀 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：配方復(fù)雜（穩(wěn)定劑、掩蔽劑），穩(wěn)定配方復(fù)雜（穩(wěn)定劑、掩蔽劑），穩(wěn)定性差，不能完全避免內(nèi)外源物質(zhì)干擾。性差，不能完

43、全避免內(nèi)外源物質(zhì)干擾。2. 2. 雙試劑的特點(diǎn)雙試劑的特點(diǎn) （1 1）可較徹底排除樣品空白和內(nèi)外源干擾物）可較徹底排除樣品空白和內(nèi)外源干擾物 （2 2）更加符合酶偶聯(lián)反應(yīng)的特性和過(guò)程）更加符合酶偶聯(lián)反應(yīng)的特性和過(guò)程 （3 3）試劑配方簡(jiǎn)單）試劑配方簡(jiǎn)單 （4 4）試劑穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存，運(yùn)輸和使用）試劑穩(wěn)定，便于儲(chǔ)存，運(yùn)輸和使用 （5 5）可用抑制法直接測(cè)定某些同工酶）可用抑制法直接測(cè)定某些同工酶第72頁(yè)/共96頁(yè)3. 3. 液體試劑的優(yōu)點(diǎn)液體試劑的優(yōu)點(diǎn) （1 1）不需手工調(diào)制，省工省時(shí)）不需手工調(diào)制，省工省時(shí) （2 2）試劑批間差小，重復(fù)性好）試劑批間差小，重復(fù)性好 （3 3）杜絕干粉試劑重溶時(shí)

44、因水質(zhì)差引起試劑變質(zhì)）杜絕干粉試劑重溶時(shí)因水質(zhì)差引起試劑變質(zhì) （4 4）有利于急診標(biāo)本）有利于急診標(biāo)本 （5 5）按需取量，避免浪費(fèi)）按需取量，避免浪費(fèi)第73頁(yè)/共96頁(yè)自動(dòng)生化分析儀主要參數(shù)自動(dòng)生化分析儀主要參數(shù)1.1.測(cè)定方法學(xué)類(lèi)型的選擇測(cè)定方法學(xué)類(lèi)型的選擇: : 終點(diǎn)法終點(diǎn)法, ,速率法速率法, ,固定時(shí)間法固定時(shí)間法2.2.溫度溫度3.3.波長(zhǎng)波長(zhǎng)4.4.樣品與試劑量樣品與試劑量5.5.延遲時(shí)間延遲時(shí)間6.6.測(cè)定時(shí)間測(cè)定時(shí)間7.7.濃度校正因子濃度校正因子第74頁(yè)/共96頁(yè)四、免疫濁度分析法四、免疫濁度分析法 抗體（抗體（AbAb）與可溶性抗原（）與可溶性抗原（AgAg）反）反應(yīng)，形

45、成一定結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，成應(yīng)，形成一定結(jié)構(gòu)的免疫復(fù)合物，成為懸浮于反應(yīng)溶液中的微粒。在沉淀為懸浮于反應(yīng)溶液中的微粒。在沉淀反應(yīng)中形成的復(fù)合物微粒具有特殊的反應(yīng)中形成的復(fù)合物微粒具有特殊的光學(xué)性質(zhì)，可用儀器檢測(cè)，提高了方光學(xué)性質(zhì)，可用儀器檢測(cè)，提高了方法的速度、靈敏度和易操作性。法的速度、靈敏度和易操作性。第75頁(yè)/共96頁(yè)抗原抗原- -抗體沉淀反應(yīng)的特征抗體沉淀反應(yīng)的特征1. 1. 抗體過(guò)剩區(qū)：抗體過(guò)剩區(qū)：隨著抗原濃度增加，隨著抗原濃度增加，ICIC也相應(yīng)增加，濁度增加。也相應(yīng)增加，濁度增加。2. 2. 等價(jià)點(diǎn)：等價(jià)點(diǎn)：抗原抗體相當(dāng)時(shí)，所有抗體與抗原形成抗原抗體相當(dāng)時(shí)，所有抗體與抗原形成ICI

46、C，濁度最大，達(dá)到，濁度最大，達(dá)到等價(jià)點(diǎn)。等價(jià)點(diǎn)。3. 3. 抗原過(guò)剩區(qū)：抗原過(guò)剩區(qū)：抗原過(guò)量存在，不但不會(huì)形成更多的抗原過(guò)量存在，不但不會(huì)形成更多的ICIC，反而會(huì)引起原，反而會(huì)引起原先的先的ICIC溶解，濁度下降，產(chǎn)生虛假的低濃度結(jié)果。溶解，濁度下降，產(chǎn)生虛假的低濃度結(jié)果。第76頁(yè)/共96頁(yè)1 1透射比濁測(cè)定法透射比濁測(cè)定法 是測(cè)定入射光強(qiáng)度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接測(cè)定散射是測(cè)定入射光強(qiáng)度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接測(cè)定散射的光強(qiáng)。這一點(diǎn)與分光光度測(cè)定法極為類(lèi)似。用這種方法時(shí)，多用聚乙二醇的光強(qiáng)。這一點(diǎn)與分光光度測(cè)定法極為類(lèi)似。用這種方法時(shí)，多用聚乙二醇

47、（PEGPEG）作為反應(yīng)增強(qiáng)劑。這種非離子型聚合物可以降低抗原抗體復(fù)合物的溶解）作為反應(yīng)增強(qiáng)劑。這種非離子型聚合物可以降低抗原抗體復(fù)合物的溶解度。度。2 2散射比濁測(cè)定法散射比濁測(cè)定法 它是直接測(cè)定溶液中微粒所散射的光強(qiáng)。散射比濁法也已經(jīng)用于自動(dòng)分析儀器它是直接測(cè)定溶液中微粒所散射的光強(qiáng)。散射比濁法也已經(jīng)用于自動(dòng)分析儀器中。中。第77頁(yè)/共96頁(yè)3 3免疫濁度測(cè)定中應(yīng)注意的問(wèn)題免疫濁度測(cè)定中應(yīng)注意的問(wèn)題（1 1）偽濁度的影響。）偽濁度的影響。 非特異的交叉反應(yīng)非特異的交叉反應(yīng) 增濁劑濃度增濁劑濃度 反應(yīng)時(shí)間反應(yīng)時(shí)間 樣品本身的濁度樣品本身的濁度 試劑的污染和變質(zhì)試劑的污染和變質(zhì) 器材不夠清潔器

48、材不夠清潔第78頁(yè)/共96頁(yè)(2)(2)鉤狀效應(yīng)（鉤狀效應(yīng)（hook effecthook effect）的影響。）的影響。當(dāng)當(dāng)AgAg和和AbAb濃度比例不當(dāng)時(shí)，不能有濃度比例不當(dāng)時(shí)，不能有效地形成免疫復(fù)合物，產(chǎn)生弱陽(yáng)性效地形成免疫復(fù)合物，產(chǎn)生弱陽(yáng)性甚至假陰性結(jié)果。甚至假陰性結(jié)果。(3)(3)嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控是極必要的。嚴(yán)格的室內(nèi)質(zhì)控是極必要的。(4)(4)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作. .第79頁(yè)/共96頁(yè)五、方法學(xué)評(píng)價(jià)五、方法學(xué)評(píng)價(jià)（一）準(zhǔn)確度試驗(yàn) 準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與“真值真值”的符合程度。是評(píng)價(jià)一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法是否可取的符合程度。是評(píng)價(jià)一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)方法是否可取的重要指標(biāo)。的重要

49、指標(biāo)。 1 1標(biāo)準(zhǔn)物鑒定標(biāo)準(zhǔn)物鑒定 為了確定和評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性，常用基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液或參考血清為樣本進(jìn)行檢為了確定和評(píng)價(jià)方法的準(zhǔn)確性，常用基準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)液或參考血清為樣本進(jìn)行檢測(cè)，所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以衡量方法的準(zhǔn)確性。測(cè)，所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，以衡量方法的準(zhǔn)確性。第80頁(yè)/共96頁(yè)2 2回收試驗(yàn)回收試驗(yàn) 回收率的計(jì)算是（回收值回收率的計(jì)算是（回收值/ /加入加入值）值）100100，這里的回收值是指，這里的回收值是指標(biāo)本中加入標(biāo)準(zhǔn)液后的測(cè)定值減去標(biāo)本中加入標(biāo)準(zhǔn)液后的測(cè)定值減去標(biāo)本原來(lái)的測(cè)定值。回收率達(dá)到標(biāo)本原來(lái)的測(cè)定值。回收率達(dá)到1001005 5者為準(zhǔn)確性符合要求的者為準(zhǔn)確性符合要求的方法。方法。第

50、81頁(yè)/共96頁(yè)回收試驗(yàn)應(yīng)注意：回收試驗(yàn)應(yīng)注意： 樣品的選用樣品的選用 樣品最好應(yīng)用新鮮混合血樣品最好應(yīng)用新鮮混合血清。清。 標(biāo)準(zhǔn)物的加入標(biāo)準(zhǔn)物的加入 應(yīng)先配制成適當(dāng)濃度的應(yīng)先配制成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)物溶液，再加入到基礎(chǔ)樣品中。所加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)物溶液，再加入到基礎(chǔ)樣品中。所加標(biāo)準(zhǔn)溶液量越少越好。準(zhǔn)溶液量越少越好。 標(biāo)準(zhǔn)物的加入濃度標(biāo)準(zhǔn)物的加入濃度 最好同時(shí)設(shè)計(jì)幾個(gè)最好同時(shí)設(shè)計(jì)幾個(gè)加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的試驗(yàn)樣品。加入標(biāo)準(zhǔn)加入不同濃度標(biāo)準(zhǔn)液的試驗(yàn)樣品。加入標(biāo)準(zhǔn)液后的試驗(yàn)樣品的總濃度不能超過(guò)本方法的液后的試驗(yàn)樣品的總濃度不能超過(guò)本方法的線(xiàn)性范圍。線(xiàn)性范圍。 操作準(zhǔn)確操作準(zhǔn)確 標(biāo)準(zhǔn)液的加入量必須準(zhǔn)確無(wú)標(biāo)準(zhǔn)液的加入

51、量必須準(zhǔn)確無(wú)誤，應(yīng)經(jīng)多次試驗(yàn)。誤，應(yīng)經(jīng)多次試驗(yàn)。第82頁(yè)/共96頁(yè)（二）精密度試驗(yàn)（二）精密度試驗(yàn) 目前常以重復(fù)性試驗(yàn)來(lái)衡量一個(gè)方法的精密目前常以重復(fù)性試驗(yàn)來(lái)衡量一個(gè)方法的精密度 。 一 般 來(lái) 說(shuō) ， 標(biāo) 準(zhǔn) 差 、 變 異 系 數(shù) （度 。 一 般 來(lái) 說(shuō) ， 標(biāo) 準(zhǔn) 差 、 變 異 系 數(shù) （ C VC V s/xs/x100100）小的實(shí)驗(yàn)方法精密。）小的實(shí)驗(yàn)方法精密。 1 1批內(nèi)精密度試驗(yàn)批內(nèi)精密度試驗(yàn) 取一份樣品，用欲測(cè)項(xiàng)取一份樣品，用欲測(cè)項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，反復(fù)測(cè)定目實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作，反復(fù)測(cè)定2020次以上，計(jì)算次以上，計(jì)算每一次的測(cè)定結(jié)果，然后計(jì)算每一次的測(cè)定結(jié)果，然后計(jì)算x

52、 x、s s、CVCV。 2 2批間精密度試驗(yàn)批間精密度試驗(yàn) 這種試驗(yàn)也是同一份標(biāo)這種試驗(yàn)也是同一份標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，至少為本進(jìn)行重復(fù)測(cè)定，至少為2020次。但是重復(fù)測(cè)定不次。但是重復(fù)測(cè)定不是在一天內(nèi)完成，而是每天隨患者標(biāo)本一起測(cè)定，是在一天內(nèi)完成，而是每天隨患者標(biāo)本一起測(cè)定，再計(jì)算再計(jì)算x x、s s、CVCV。第83頁(yè)/共96頁(yè)（三）靈敏度試驗(yàn)（三）靈敏度試驗(yàn) 靈敏度是單位濃度變化所引起的指示物理量的變化。在定量分析中是指被檢靈敏度是單位濃度變化所引起的指示物理量的變化。在定量分析中是指被檢測(cè)物單位濃度的變化所引起的物理量的變化。測(cè)物單位濃度的變化所引起的物理量的變化。 所選用的方法，應(yīng)進(jìn)

53、行線(xiàn)性試驗(yàn)，選用線(xiàn)性范圍寬度適宜的方法。線(xiàn)性檢驗(yàn)所選用的方法，應(yīng)進(jìn)行線(xiàn)性試驗(yàn)，選用線(xiàn)性范圍寬度適宜的方法。線(xiàn)性檢驗(yàn)所得結(jié)果，可用回歸方程（所得結(jié)果，可用回歸方程（Y Ya abXbX）處理，回歸系數(shù)（）處理，回歸系數(shù)（b b）為靈敏度大小）為靈敏度大小的指標(biāo)，回歸系數(shù)大，靈敏度高，反之亦然。不同方法也可用回歸系數(shù)進(jìn)行的指標(biāo)，回歸系數(shù)大，靈敏度高，反之亦然。不同方法也可用回歸系數(shù)進(jìn)行比較，回歸系數(shù)大的靈敏度高。比較，回歸系數(shù)大的靈敏度高。第84頁(yè)/共96頁(yè)（四）線(xiàn)性試驗(yàn)（四）線(xiàn)性試驗(yàn) 線(xiàn)性試驗(yàn)是衡量一個(gè)方法的檢測(cè)范圍的一種實(shí)驗(yàn)。通過(guò)線(xiàn)性試驗(yàn)，可以了解該方線(xiàn)性試驗(yàn)是衡量一個(gè)方法的檢測(cè)范圍的一種實(shí)驗(yàn)。通過(guò)線(xiàn)性試驗(yàn)，可以了解該方法的最高檢測(cè)值和最低檢測(cè)值。法的最高檢測(cè)值和最低檢測(cè)值。 超出上下限值的結(jié)果是不可靠的，為使結(jié)果可靠，遇到這種情況應(yīng)加大樣品用量超出上下限值的結(jié)果是不可靠的，為使結(jié)果可靠，遇到這種情況應(yīng)加大樣品用量或稀釋樣品后再次檢測(cè)。或稀釋樣品后再次檢測(cè)。 線(xiàn)性試驗(yàn)的方法基本同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備。一般先進(jìn)行線(xiàn)性試驗(yàn)，然后在線(xiàn)性范圍線(xiàn)性試驗(yàn)的方法基本同標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制備。一般先進(jìn)行線(xiàn)性試驗(yàn)，然后在線(xiàn)性范圍內(nèi)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。內(nèi)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。第85頁(yè)/共96頁(yè)（五）特異性及干擾試驗(yàn)（五）特異性及干擾試驗(yàn) 干擾是指標(biāo)本中存在分析物以外的其他物干擾是指標(biāo)本中存在分析物以外的其他物質(zhì)，致使測(cè)定結(jié)果有