1、一、比色分析一、比色分析1 1比色分析理論比色分析理論Beer-Lambert Beer-Lambert 定律定律 A = lgA = lg（I I0 0/I/I）KCL KCL 或或 I II I0 01010- -KCLKCL I I0 0：入射光強度：入射光強度 I I：透過光強度：透過光強度 K K：常數(shù)：常數(shù) C C：溶液濃度：溶液濃度 L L：溶液的厚度：溶液的厚度第1頁/共96頁（1 1）郎伯定律）郎伯定律 I0 It l L -dIIdl， -dIaIdl， dI/I=-adl 積分 It L dI/I -a dl 得： ln(I0 / It)-aL I0 0 將ln改為lg，

2、則為：lg（ I0 / It）-0.434aLKL 令lg（ I0 / It） A，則A KL第2頁/共96頁（2 2）比爾定律）比爾定律 A AK K”C C（3 3）郎伯）郎伯- -比爾定律比爾定律 A AKLCKLC第3頁/共96頁透光率（透光率（transmittancetransmittance，T T，透射率），透射率） T TI / II / I0 0吸光度（吸光度（absorbanceabsorbance，A A）光密度（光密度（eptical densityeptical density，D D或或ODOD） A Alg Ilg I0 0/I/I-lgT-lgT T T101

3、0-A-A1010-KCL-KCL A AKCLKCL當當L L用用cmcm，C C用用mol/Lmol/L表示，則表示，則K K即稱之為摩爾吸光系數(shù)，用即稱之為摩爾吸光系數(shù)，用表示。表示。當當C C1mol/L1mol/L，L L1cm1cm，則，則A A。第4頁/共96頁T T與與A A的關(guān)系的關(guān)系 透光率（T） 吸光度（A） 1 0.000 0.75 0.125 0.5 0.301 0.25 0.602 0.17 0.770 0.1 1.000 0.05 1.301 0.01 2.000 0.001 3.000第5頁/共96頁2 2影響因素影響因素（1 1）化學因素的影響）化學因素的影響

4、 溶液中溶質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合，與溶劑間的作用等原溶液中溶質(zhì)可因濃度的改變而發(fā)生離解、締合，與溶劑間的作用等原因而出現(xiàn)偏離比爾定律的現(xiàn)象。由化學因素引起的偏離，有時可控制溶液因而出現(xiàn)偏離比爾定律的現(xiàn)象。由化學因素引起的偏離，有時可控制溶液條件設(shè)法減免。此外，能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)也可導致偏離比爾定律。條件設(shè)法減免。此外，能產(chǎn)生熒光的物質(zhì)也可導致偏離比爾定律。第6頁/共96頁（2 2）非單色光的影響）非單色光的影響 比爾定律的一個重要條件是單色光，但在比色分析中常有不同波長的比爾定律的一個重要條件是單色光，但在比色分析中常有不同波長的光同時存在。這就使吸光度發(fā)生改變，從而偏離比爾定律。光同

5、時存在。這就使吸光度發(fā)生改變，從而偏離比爾定律。第7頁/共96頁波長的選擇波長的選擇可見綠色帶黃深黃桔紅深紅深紫青紫紫藍藍色帶綠綠色帶藍深綠Ultra-violet紫外200400深紫深紅桔紅深黃綠色帶黃暗綠綠色帶藍藍色帶綠紫藍青紫被測溶液顏色顏色750800610750595610560580580595500560490500480490435480400435波長(nm)第8頁/共96頁（3 3）光學因素的影響）光學因素的影響 散射是向空間各個方向，而使透射光減弱。反射可使光能損失，當光散射是向空間各個方向，而使透射光減弱。反射可使光能損失，當光線通過兩種不同介質(zhì)時，則發(fā)生反射。當樣本溶

6、液與空白溶液的折射率有線通過兩種不同介質(zhì)時，則發(fā)生反射。當樣本溶液與空白溶液的折射率有較大差異時，導致吸收值的偏差。較大差異時，導致吸收值的偏差。（4 4）非平行光通過吸收池時，由于光線的傾斜使厚度）非平行光通過吸收池時，由于光線的傾斜使厚度L L增大而影響測量值。增大而影響測量值。第9頁/共96頁3 3比色法的誤差比色法的誤差（1 1）儀器誤差）儀器誤差 濾光片，狹縫過寬，光電池疲濾光片，狹縫過寬，光電池疲勞，儀器結(jié)構(gòu)，散熱不良。勞，儀器結(jié)構(gòu)，散熱不良。（2 2）方法誤差）方法誤差 （3 3）操作誤差）操作誤差第10頁/共96頁比色法舉例比色法舉例1. 1. 總蛋白總蛋白(TP)(TP)蛋白

7、質(zhì)中的肽鍵+Cu 2+ 堿性條件 紫紅色絡(luò)合物引起在波長540560nm范圍內(nèi)吸光度的上升, 與總蛋白含量成正比2. 2. 白蛋白白蛋白(ALB)(ALB)白蛋白+溴甲酚綠 pH4.2 白蛋白溴甲酚綠復合物引起在波長630nm范圍內(nèi)吸光度的上升, 與白蛋白含量成正比第11頁/共96頁二、分光光度計二、分光光度計1 1光源光源熱光源熱光源: : 鎢燈、鹵鎢燈（鎢燈、鹵鎢燈（3203202500nm2500nm）氣體放電光源：氣體放電光源： 氫燈、氘燈（氫燈、氘燈（185185375nm375nm）。）。 氘燈發(fā)光強度比氫燈強氘燈發(fā)光強度比氫燈強3 35 5倍，是目前紫外光區(qū)常用光源。倍，是目前紫

8、外光區(qū)常用光源。 第12頁/共96頁 2. 2. 單色器單色器 單色器是一種用來把光源發(fā)出的復合光分解成單色光，并能任意改變所需波長單色器是一種用來把光源發(fā)出的復合光分解成單色光，并能任意改變所需波長的裝置。的裝置。 (1)(1)棱鏡棱鏡 玻璃棱鏡的折射率大、色散能力也大，因而分辨本領(lǐng)高。但它吸收紫外光，因玻璃棱鏡的折射率大、色散能力也大，因而分辨本領(lǐng)高。但它吸收紫外光，因此只適用于此只適用于3503503000nm3000nm的波長范圍。的波長范圍。 石英棱鏡對紫外光吸收少，適用于石英棱鏡對紫外光吸收少，適用于195-4000nm195-4000nm間分光。但由于石英棱鏡折射間分光。但由于石

9、英棱鏡折射率低于玻璃，因而色散能力差。率低于玻璃，因而色散能力差。第13頁/共96頁 (2)(2)光柵光柵 光柵是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光柵在質(zhì)量上，光柵是利用光的衍射、干涉原理制成的色散元件。目前，全息光柵在質(zhì)量上，成本上都大大優(yōu)于機械光柵。因光柵分光在紫外和可見光區(qū)均適用，且色散力強、成本上都大大優(yōu)于機械光柵。因光柵分光在紫外和可見光區(qū)均適用，且色散力強、分辨率高，故近年生產(chǎn)的分光光度計大都采用光柵作單色器。分辨率高，故近年生產(chǎn)的分光光度計大都采用光柵作單色器。第14頁/共96頁3 3比色杯比色杯 比色杯可由玻璃和石英等材料制成，比色杯可由玻璃和石英等材料制成，玻

10、璃適用于玻璃適用于350nm350nm以上光區(qū)，而石英以上光區(qū)，而石英杯則適用于紫外和可見光區(qū)。杯則適用于紫外和可見光區(qū)。第15頁/共96頁4 4檢測器檢測器 在分光光度計中，把光信號轉(zhuǎn)變在分光光度計中，把光信號轉(zhuǎn)變成電信號輸出的裝置稱檢測器。成電信號輸出的裝置稱檢測器。 光電池光電池 光電管光電管 光電倍增管光電倍增管 第16頁/共96頁雙波長分光光度計 來自光源的光被兩個單色器分別分離出波長為來自光源的光被兩個單色器分別分離出波長為1 1和和2 2的兩束單色光。經(jīng)過的兩束單色光。經(jīng)過折波器后，兩束波長不同的單色光交替地照射于同一樣品杯。樣品杯背后的光折波器后，兩束波長不同的單色光交替地照射

11、于同一樣品杯。樣品杯背后的光電倍增管交替地接收到兩種波長照射吸收池后所產(chǎn)生的信號。此信號經(jīng)電子電電倍增管交替地接收到兩種波長照射吸收池后所產(chǎn)生的信號。此信號經(jīng)電子電路轉(zhuǎn)化為兩個吸光度之差路轉(zhuǎn)化為兩個吸光度之差A A。第17頁/共96頁三、酶法分析三、酶法分析 酶法分析包括兩方面的內(nèi)容：酶法分析包括兩方面的內(nèi)容： 借助酶來測定某一化合物的濃借助酶來測定某一化合物的濃度，如測定體液中的葡萄糖、甘油三度，如測定體液中的葡萄糖、甘油三酯、膽固醇、尿素、尿酸、肌酐等。酯、膽固醇、尿素、尿酸、肌酐等。 借助酶來測定另一種酶的活性，借助酶來測定另一種酶的活性，實際上是用酶來測定待測酶的產(chǎn)物，實際上是用酶來測

12、定待測酶的產(chǎn)物，如轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。如轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、淀粉酶等。第18頁/共96頁葡萄糖葡萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林 過氧化物酶 醌亞胺H2O尿素尿素尿素H2O 脲酶 2NH4+CO2NH4+-酮戊二酸NADH 谷氨酸脫氫酶 谷氨酸NAD+H2O第19頁/共96頁肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADH

13、H+ LDH 乳酸NAD+H2O第20頁/共96頁酶催化特點酶催化特點高度的特異性高催化效率作用條件溫和第21頁/共96頁酶的活性部位酶的活性部位底物結(jié)合部位催化部位第22頁/共96頁酶的輔助因子酶的輔助因子金屬離子輔基和輔酶NAD ，NADP第23頁/共96頁酶的分類酶的分類1. 氧化還原酶2. 轉(zhuǎn)移酶3. 水解酶4. 裂合酶5. 異構(gòu)酶6. 合成酶第24頁/共96頁酶的系統(tǒng)命名酶的系統(tǒng)命名應將酶的一種或兩種底物以及催化反應的性質(zhì)明確標明。乳酸脫氫酶 L-乳酸：NAD+氧化還原酶肌酸激酶 ATP：肌酸磷酸轉(zhuǎn)移酶第25頁/共96頁酶的活性單位酶的活性單位一國際單位為在一分鐘內(nèi)催化轉(zhuǎn)變1個微摩爾

14、的反應物的酶量.IUU U/L1Katal為每秒鐘轉(zhuǎn)化1mole底物的酶量1國際單位=16.67nKatal1Katal=6107國際單位第26頁/共96頁酶活性測定酶活性測定影響酶活性測定：底物、激活劑、抑制劑、緩沖液、pH、溫度、酶濃度。在最適條件下以求達到最大的反應速度。但由于底物的溶解度低，或售價太高，或需連鎖的酶反應，則必須對測定條件作修正。第27頁/共96頁酶活性測定的最適條件酶活性測定的最適條件1. 1.合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類和濃度合適的底物、輔因子、活化劑、變構(gòu)劑的種類和濃度2. 2.指示酶和輔助酶的種類和濃度指示酶和輔助酶的種類和濃度3. 3.反應混合液的最

15、適反應混合液的最適pHpH，緩沖液種類和濃度，緩沖液種類和濃度4. 4.去除各種抑制劑去除各種抑制劑第28頁/共96頁酶促反應的兩個階段酶促反應的兩個階段 反應級數(shù) 0級 1級 P 1.可逆反應可逆反應 2.產(chǎn)物抑制產(chǎn)物抑制 3.酶變性失活酶變性失活 v=dP/dt 4.底物不飽和底物不飽和 S 時間 t第29頁/共96頁酶反應進程和酶濃度曲線酶反應進程和酶濃度曲線 酶量E 40 1.E越大，線性反 產(chǎn) 應期越短 物 2.E相同，S越小， P 20 線性反應期越短 10 5 0 5 10 15 20 時間(min)第30頁/共96頁酶反應時間曲線酶反應時間曲線 時間(min) 5(t0) 反應

16、時間越短， 10(t1) 線性范圍越大 15(t2) 20(t3) 0 10 20 30 40 酶量E第31頁/共96頁米氏方程米氏方程E + SESE + Pkkkk+1+2-2-1v=VSKm+SvV2S Km第32頁/共96頁米氏曲線米氏曲線SVVmaxKmVmax 2KmKm第33頁/共96頁米氏常數(shù)米氏常數(shù)米米- -孟氏公式：孟氏公式：v vVmS/(KmVmS/(KmS)S)當當SKmSKmSKm時，則時，則v vVmVm，即反，即反應速度是一個常數(shù)，為零級反應速度是一個常數(shù)，為零級反應。應。如如SSKmKm時，混合級反應時，混合級反應。第34頁/共96頁米氏常數(shù)的意義米氏常數(shù)的意

17、義 如如v v0.5Vm0.5Vm，則，則KmKmSS，KmKm值等于酶促反應的初速度為最大速度的一半時所值等于酶促反應的初速度為最大速度的一半時所需的底物濃度。需的底物濃度。 KmKm等于等于ESES的解離常數(shù)；而的解離常數(shù)；而KmKm的倒數(shù)可代表酶和底物的親和力。的倒數(shù)可代表酶和底物的親和力。 KmKm是酶的特征性常數(shù)，當是酶的特征性常數(shù)，當pHpH、溫度和離子強度恒定時，、溫度和離子強度恒定時，KmKm只和酶及底物的性質(zhì)只和酶及底物的性質(zhì)有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。有關(guān)，而與酶濃度無關(guān)。 純度不同的同一種酶，如雜質(zhì)中沒有可使底物發(fā)生旁反應的其它酶或酶的激活純度不同的同一種酶，如雜質(zhì)中沒有可使底

18、物發(fā)生旁反應的其它酶或酶的激活劑和抑制劑，則劑和抑制劑，則KmKm的變化不大。的變化不大。第35頁/共96頁米氏常數(shù)的應用米氏常數(shù)的應用（1 1）如已知酶的）如已知酶的KmKm，可計算某一底，可計算某一底物濃度時的物濃度時的v/Vmv/Vm。（2 2）如要求）如要求v v占占VmVm一定的百分比，一定的百分比，也可算出所需底物濃度為其也可算出所需底物濃度為其KmKm的多的多少倍。少倍。（3 3）利用工具酶來測定某一底物的）利用工具酶來測定某一底物的濃度時，可計算工具酶的用量。濃度時，可計算工具酶的用量。第36頁/共96頁（4 4）測定幾個同工酶對同一底物）測定幾個同工酶對同一底物的的KmKm，

19、可估計是原級（，可估計是原級（ KmKm常有差常有差異）還是次生性同工酶（異）還是次生性同工酶（ KmKm接近接近或相同）。或相同）。（5 5）測定正逆方向底物的）測定正逆方向底物的KmKm，可，可大體知道該酶催化哪一方向為主。大體知道該酶催化哪一方向為主。（6 6）如已知一組酶中各酶的）如已知一組酶中各酶的KmKm及及其相應底物的濃度，有助于尋找其相應底物的濃度，有助于尋找限速步驟。限速步驟。第37頁/共96頁KmKm的求取的求取 Lineweaver-Burk作圖法 1/v(Km/Vm)(1/S)1/Vm Eadie-Hofstee作圖法 vVmKm(v/S) Eisenthal和Corn

20、ish-Bowden作圖法 設(shè)Y軸和X軸分別為求取Vm及Km的座標，將不同S濃度點在X軸的負側(cè)；相應的反應速度點在Y軸上，連接各線，交點在Y軸上的座標為Vm，在X軸上的座標為Km。第38頁/共96頁酶活性測定的基本知識酶活性測定的基本知識 酶活性是通過測定酶促反應過程酶活性是通過測定酶促反應過程中單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的中單位時間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的生成量，即測定酶促反應的速率來獲生成量，即測定酶促反應的速率來獲得的。得的。第39頁/共96頁（1 1）定時法）定時法 測定酶反應開始后某一時間內(nèi)（測定酶反應開始后某一時間內(nèi)（t t1 1到到t t2 2）產(chǎn)物或底物濃度的總變化量來求取）產(chǎn)

21、物或底物濃度的總變化量來求取酶反應初速度的方法稱為定時法。酶反應初速度的方法稱為定時法。 產(chǎn)產(chǎn) 2 2 物物 3 3 生生 1 1 成成 t t1 1 t t2 2 第40頁/共96頁（2 2）連續(xù)監(jiān)測法）連續(xù)監(jiān)測法 連續(xù)測定（每連續(xù)測定（每15s15s1min1min監(jiān)測一次）酶反應過程中某一反應產(chǎn)物或底物的監(jiān)測一次）酶反應過程中某一反應產(chǎn)物或底物的濃度隨時間的變化來求出酶反應初速度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法，又稱動力學法濃度隨時間的變化來求出酶反應初速度的方法稱為連續(xù)監(jiān)測法，又稱動力學法或速率法。這種方法的優(yōu)點是可將多點的測定結(jié)果連接成線，很易找到成直線或速率法。這種方法的優(yōu)點是可將多點的測定結(jié)

22、果連接成線，很易找到成直線的區(qū)段，來計算酶活性。此法較為準確。的區(qū)段，來計算酶活性。此法較為準確。 分為直接連續(xù)監(jiān)測法和間接連續(xù)監(jiān)測法。分為直接連續(xù)監(jiān)測法和間接連續(xù)監(jiān)測法。 法法. .第41頁/共96頁連續(xù)監(jiān)測法的測定時間連續(xù)監(jiān)測法的測定時間 吸 光 度 A3 A2 A1 t1 t2 t3 t4 時間第42頁/共96頁（3 3）平衡法）平衡法 通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產(chǎn)物或通過測定酶反應開始至反應達到平衡時產(chǎn)物或底物濃度總變化量來求出酶活性的方法稱為平衡底物濃度總變化量來求出酶活性的方法稱為平衡法。用平衡法測定時，因產(chǎn)物的增加或底物的減法。用平衡法測定時，因產(chǎn)物的增加或底物的減少與反

23、應時間不成線性，故不能把少與反應時間不成線性，故不能把PP或或SS的總的總變化量除以變化量除以t t來代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化。來代表每分鐘產(chǎn)物或底物的變化。另外，平衡法也會受到產(chǎn)物抑制、可逆反應等因另外，平衡法也會受到產(chǎn)物抑制、可逆反應等因素的影響，由于反應時間較定時法長，故這種影素的影響，由于反應時間較定時法長，故這種影響會更大，測定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān)測法低。對于有響會更大，測定結(jié)果也較連續(xù)監(jiān)測法低。對于有些零級反應期很短的酶促反應，用連續(xù)監(jiān)測法和些零級反應期很短的酶促反應，用連續(xù)監(jiān)測法和定時法很難測出其初速度，也只得采用平衡法測定時法很難測出其初速度，也只得采用平衡法測定。定。第43頁/共

24、96頁定時法與連續(xù)法比較定時法與連續(xù)法比較 定時法定時法 條件無限制 試劑需量少，經(jīng)濟 采用放射性試劑時，靈敏度高 結(jié)果不能立刻揭曉 人工操作多，費時 毋需偶聯(lián)酶 產(chǎn)物會生抑制作用 連續(xù)法連續(xù)法 因偶聯(lián)酶使條件受限制 需量較大 與放射性試劑來比，靈敏度低 結(jié)果立刻揭曉 人工操作少 偶聯(lián)酶的費用很大 偶聯(lián)作用能消耗產(chǎn)物第44頁/共96頁（一）工具酶及酶偶聯(lián)反應（一）工具酶及酶偶聯(lián)反應 通過酶偶聯(lián)反應間接地測出通過酶偶聯(lián)反應間接地測出第一個酶促反應中待測物的濃度或第一個酶促反應中待測物的濃度或待測酶的活性。那些作為試劑用于待測酶的活性。那些作為試劑用于測定化合物濃度或酶活性的酶稱為測定化合物濃度或

25、酶活性的酶稱為工具酶。工具酶。第45頁/共96頁AB 酶1 CDC（或D）E 酶2 FGF（或G）H 酶3 IJ酶1：待測酶酶2：輔助酶酶3：指示酶E、H：輔助底物第46頁/共96頁在利用工具酶的反應中，唯一的限在利用工具酶的反應中，唯一的限速因子應該是待測化合物或待測酶。速因子應該是待測化合物或待測酶。對工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑對工具酶試劑中的雜質(zhì)（雜酶、抑制劑等）的含量也有一定的限制，制劑等）的含量也有一定的限制，以減少或避免干擾測定的副反應。以減少或避免干擾測定的副反應。第47頁/共96頁 如果工具酶制劑中污染了待測酶會對測定結(jié)果產(chǎn)生嚴重影響。如果工具酶制劑中污染了待測酶會對測定結(jié)果

26、產(chǎn)生嚴重影響。 如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（如天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ASTAST）測定的工具酶是蘋果酸脫氫酶（）測定的工具酶是蘋果酸脫氫酶（MDHMDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ASTAST，則當，則當ASTAST活性為活性為7U/L7U/L時，測定誤差為時，測定誤差為6%6%。 而測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（而測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALTALT）的工具酶是乳酸脫氫酶（）的工具酶是乳酸脫氫酶（LDHLDH），如污染），如污染0.03%0.03%的的ALTALT，則當，則當ALTALT活性為活性為5U/L5U/L時測定誤差也是時測定誤差也是6%6%。第48頁/共96頁（二）常用監(jiān)測物質(zhì)的特性（二）常用監(jiān)測物

27、質(zhì)的特性1 1NADHNADH或或NADPHNADPH：乳酸脫氫酶（乳酸脫氫酶（LDHLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +蘋果酸脫氫酶（蘋果酸脫氫酶（MDHMDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +谷氨酸脫氫酶（谷氨酸脫氫酶（GLDHGLDH） NADNAD+ +或或NADPNADP+ +6-6-磷酸葡萄糖脫氫酶（磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDG6PD） 動物動物G6PD NADPG6PD NADP+ + 微生物微生物G6PD NADG6PD NAD+ +第49頁/共96頁NADHNADH或或NADPHNADPH在在340nm340nm有特征性光吸有特征性光吸收，而它

28、們的氧化型收，而它們的氧化型NADNAD+ +或或NADPNADP+ +則則沒有這個吸收峰，沒有這個吸收峰，340nm340nm波長處的波長處的吸光度與吸光度與NADNAD（P P）H H的濃度成正比。的濃度成正比。另外另外NADNAD（P P）H H有強烈的熒光，其有強烈的熒光，其激發(fā)波長為激發(fā)波長為340nm340nm，發(fā)射波長為，發(fā)射波長為460nm460nm。第50頁/共96頁max：340nm第51頁/共96頁肌酸激酶（肌酸激酶（CK）磷酸肌酸ADP CK 肌酸ATP葡萄糖ATP HK 葡萄糖-6-磷酸ADP葡萄糖-6-磷酸NADP G6PDH 6-磷酸葡萄糖酸NADPHH+丙氨酸氨

29、基轉(zhuǎn)移酶（丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALTALT）丙氨酸-酮戊二酸 ALT 丙酮酸谷氨酸丙酮酸NADHH+ LDH 乳酸NAD+H2O第52頁/共96頁2 2H H2 2O O2 2指示反應指示反應葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化葡萄糖氧化酶、尿酸酶、甘油氧化酶、膽固醇氧化酶：用于葡萄糖、酶、膽固醇氧化酶：用于葡萄糖、尿酸、甘油、膽固醇的測定，可使尿酸、甘油、膽固醇的測定，可使相應底物被相應底物被O O2 2氧化成氧化成H H2 2O O2 2，H H2 2O O2 2可通可通過下列指示反應來檢測過下列指示反應來檢測。第53頁/共96頁 使單一的色素原顯色。無色色素原過氧化物酶（使單一的色素原顯色。無色

30、色素原過氧化物酶（PODPOD）存在下被）存在下被H H2 2O O2 2氧化后氧化后可生成有色的色素。可生成有色的色素。 使成對的色素原顯色。必須要兩個色素原共同存在，再在指示酶使成對的色素原顯色。必須要兩個色素原共同存在，再在指示酶PODPOD的催化的催化下生成色素。下生成色素。 發(fā)光反應。發(fā)光反應。H H2 2O O2 2也可用化學發(fā)光反應來監(jiān)測，它是憑借某些熒光前身物在氧也可用化學發(fā)光反應來監(jiān)測，它是憑借某些熒光前身物在氧化后，處于激發(fā)狀態(tài)的分子可發(fā)射光子，光子量和化后，處于激發(fā)狀態(tài)的分子可發(fā)射光子，光子量和H H2 2O O2 2的濃度成正比。的濃度成正比。第54頁/共96頁葡萄糖葡

31、萄糖葡萄糖O2H2O 葡萄糖氧化酶 葡萄糖酸H2O2H2O2苯酚4-氨基安替比林 過氧化物酶 醌亞胺H2O甘油三酯甘油三酯甘油三酯H2O 脂蛋白脂酶 甘油脂肪酸甘油ATP 甘油激酶 -磷酸甘油ADP -磷酸甘油O2 甘油磷酸氧化酶 磷酸二羥丙酮H2O2 H2O2 +4-氨基安替比林+ESPAS 過氧化物酶 醌亞胺H2O ESPAS:N-乙基-N-(3-磺丙基)-間-茴香胺第55頁/共96頁3 3硝基苯衍生物硝基苯衍生物 芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：對芳香酯酶、磷酸酯酶和硫酸酯酶：對- -硝基酚和有機酸或無機酸形成的酯類硝基酚和有機酸或無機酸形成的酯類 糖苷酶：對硝基酚和糖苷衍生物糖苷酶：對硝

32、基酚和糖苷衍生物 -谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：對谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶、芳香酰胺酶和胰蛋白酶：對- -硝基苯胺的氨基酰衍生物硝基苯胺的氨基酰衍生物 故硝基苯酚或硝基苯胺作為底物的結(jié)合型化合物均無色，而一旦水解或游離型產(chǎn)物故硝基苯酚或硝基苯胺作為底物的結(jié)合型化合物均無色，而一旦水解或游離型產(chǎn)物在在pHpH大于大于8 8的堿性條件下能生成黃色的醌類離子型化合物，在的堿性條件下能生成黃色的醌類離子型化合物，在400nm400nm410nm410nm有光吸有光吸收峰，其吸光度與濃度成正比。收峰，其吸光度與濃度成正比。第56頁/共96頁max：405nm第57頁/共96頁堿性磷酸酶（堿性磷酸酶（ALPA

33、LP）磷酸對硝基苯H2O ALP 磷酸鹽對硝基苯酚 - -谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（ -GT-GT） -谷氨酰對硝基苯胺雙甘肽 -GT 谷氨酰基雙甘肽對硝基苯胺第58頁/共96頁（三）酶法分析的類型（三）酶法分析的類型 用工具酶測定體液中代謝物用工具酶測定體液中代謝物的濃度，一般可用兩種不同的測定方的濃度，一般可用兩種不同的測定方法。法。第59頁/共96頁1 1代謝物濃度的酶法分析代謝物濃度的酶法分析（1 1）終點法）終點法 將待測底物與工具酶保溫一定時間后，全部轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測的化合物，然后測將待測底物與工具酶保溫一定時間后，全部轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測的化合物，然后測定后者的總量來計算待測物的總量或濃度

34、。定后者的總量來計算待測物的總量或濃度。 尿素尿素H H2 2O O 尿素酶尿素酶 COCO2 22NH2NH3 3 乙醇乙醇NADNAD+ + 醇脫氫酶醇脫氫酶 乙醛乙醛NADHNADHH H+ + 反應常呈一級反應。反應常呈一級反應。 使待測底物完全轉(zhuǎn)變所需的時間取決于加入的工具酶量。使待測底物完全轉(zhuǎn)變所需的時間取決于加入的工具酶量。第60頁/共96頁（2 2）動力學法）動力學法 待測物不必完全轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測的化合物，而是利用工具酶反應速率來待測物不必完全轉(zhuǎn)變成可監(jiān)測的化合物，而是利用工具酶反應速率來定量其濃度：定量其濃度： 一是利用零級反應，如待測物是某個工具酶的激活劑或抑制劑，其濃一是利

35、用零級反應，如待測物是某個工具酶的激活劑或抑制劑，其濃度可決定該工具酶的反應速度，可采用此方法。因測定時該工具酶本身及度可決定該工具酶的反應速度，可采用此方法。因測定時該工具酶本身及其底物都是足量的，故反應為零級反應。其底物都是足量的，故反應為零級反應。 第61頁/共96頁例：測定血清中肝素AT 肝素 AT（AT為肝素與AT復合物）AT凝血酶 凝血酶-AT（無活性）殘余凝血酶甲苯磺酰-甘-脯-精-4NA 凝血酶 甲苯磺酰-甘-脯-精4-硝基苯胺 第62頁/共96頁 二是利用一級反應，本法的基本要求是作為某一工具酶底物的待測物的濃二是利用一級反應，本法的基本要求是作為某一工具酶底物的待測物的濃度

36、度SS必須遠小于該工具酶的必須遠小于該工具酶的KmKm。此時反應速度基本上與。此時反應速度基本上與SS成正比，呈一級反成正比，呈一級反應。應。 動力學法較終點法具有簡便、省時、干擾少、可測定低濃度物質(zhì)、不需樣動力學法較終點法具有簡便、省時、干擾少、可測定低濃度物質(zhì)、不需樣品對照以及易于自動化等優(yōu)點，成為自動化分析的主要方法。但此法必須同時品對照以及易于自動化等優(yōu)點，成為自動化分析的主要方法。但此法必須同時測定標準樣品的反應速度，來推算未知樣品中待測物的濃度。測定標準樣品的反應速度，來推算未知樣品中待測物的濃度。第63頁/共96頁2 2酶活性測定的酶法分析酶活性測定的酶法分析 這類酶學分析法是用

37、工具酶來測定這類酶學分析法是用工具酶來測定待測酶的產(chǎn)物以求取待測酶的活性，待測酶的產(chǎn)物以求取待測酶的活性，適合于待測酶產(chǎn)物不能直接監(jiān)測的情適合于待測酶產(chǎn)物不能直接監(jiān)測的情況。況。 也可有終點法和動力學法兩種。也可有終點法和動力學法兩種。 第64頁/共96頁（1 1）終點法）終點法 將底物與待測酶反應一定時間將底物與待測酶反應一定時間后，終止反應，再用指示酶測定該后，終止反應，再用指示酶測定該時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量即可算出酶活時間內(nèi)產(chǎn)物的生成量即可算出酶活性。性。 第65頁/共96頁（2 2）偶聯(lián)反應的基本動力學）偶聯(lián)反應的基本動力學 S Ex P1 Ei P2 應先將樣品與工具酶預保溫，使樣品中的

38、內(nèi)源性干擾物充分催化消耗，然后加應先將樣品與工具酶預保溫，使樣品中的內(nèi)源性干擾物充分催化消耗，然后加入底物入底物S S起動反應。起動反應。 起動后，因起動后，因P P從零開始升高，故工具酶反應速度也較低，不能代表待測酶反應速從零開始升高，故工具酶反應速度也較低，不能代表待測酶反應速度，這一時期稱為延滯期。度，這一時期稱為延滯期。 隨著反應進行，進入恒態(tài)期，只要工具酶用量足夠，就能正確地反映酶的活性隨著反應進行，進入恒態(tài)期，只要工具酶用量足夠，就能正確地反映酶的活性. .第66頁/共96頁 A 延遲期 恒態(tài)期 非恒態(tài)期 1.5 1.0 S Ex P1 Ei P2 0.5 0 30 60 90 1

39、20 150 180 秒 （以NADH減少為指示反應） 如Ei用量過少，Ex的速度Vx大于Ei的速度，即P1生成的速度大于P1消失的速度，可導致P1的逐漸堆積，不能成為恒態(tài)或其延滯期極長。但如Ei用量足夠，Vi等于或大于Vx，則P1一旦生成可較快或很快轉(zhuǎn)變成P2，P1產(chǎn)生與消失速度一致而成為恒態(tài)。第67頁/共96頁（四）酶活性濃度的計算（四）酶活性濃度的計算 Vt106U/L（A/min） VsLA 吸光度變化吸光度變化V Vt t為反應系統(tǒng)總體積為反應系統(tǒng)總體積V Vs s為樣品體積為樣品體積 為被測物的摩爾吸光系數(shù)為被測物的摩爾吸光系數(shù)(mol(mol-1-1 cm cm-1-1) )L

40、L為光徑為光徑10106 6是將是將molmol轉(zhuǎn)化成轉(zhuǎn)化成molmol。第68頁/共96頁常數(shù)常數(shù)K K值的意義和設(shè)置值的意義和設(shè)置 Vt106U/L（A/min） VsL （A/min）K Vt106 K VsL 第69頁/共96頁常數(shù)常數(shù)K K值的檢驗值的檢驗 ：pHpH；溫度；單色光；儀器信號接收；溫度；單色光；儀器信號接收V V：儀器加樣系統(tǒng)：儀器加樣系統(tǒng) 對一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對硝基酚、對硝基苯胺，可以用高純試劑配成標準品，對一些性質(zhì)穩(wěn)定的物質(zhì)如對硝基酚、對硝基苯胺，可以用高純試劑配成標準品，將它們作為標本進行酶的測定，根據(jù)其濃度和吸光度變化可計算出實際將它們作為標本進行酶的測定，

41、根據(jù)其濃度和吸光度變化可計算出實際K K值。值。 對對NAD(P)HNAD(P)H，可使用測葡萄糖試劑盒，對已知濃度的葡萄糖標準品進行終點法測，可使用測葡萄糖試劑盒，對已知濃度的葡萄糖標準品進行終點法測定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的定，此法產(chǎn)生與葡萄糖相等摩爾數(shù)的NAD(P)HNAD(P)H，故不難從吸光度變化求出，故不難從吸光度變化求出K K值。值。第70頁/共96頁 利用標準管的方法較簡單，但標利用標準管的方法較簡單，但標準管的濃度必須在該比色法或紫外分光準管的濃度必須在該比色法或紫外分光光度法測定的濃度線性范圍內(nèi)。標準曲光度法測定的濃度線性范圍內(nèi)。標準曲線法可得濃度和吸光度的線性范圍，

42、消線法可得濃度和吸光度的線性范圍，消除濃度過高偏離線性的影響，但標準曲除濃度過高偏離線性的影響，但標準曲線的制備時間與測定樣品的時間不同，線的制備時間與測定樣品的時間不同，容易產(chǎn)生試劑批號、配制、實驗溫度、容易產(chǎn)生試劑批號、配制、實驗溫度、儀器工作狀態(tài)等因素造成的誤差。儀器工作狀態(tài)等因素造成的誤差。第71頁/共96頁單試劑、雙試劑、液體試劑單試劑、雙試劑、液體試劑1. 1. 單試劑的優(yōu)缺點單試劑的優(yōu)缺點 優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡便適用于各類生化分析儀操作簡便適用于各類生化分析儀 缺點：缺點：配方復雜（穩(wěn)定劑、掩蔽劑），穩(wěn)定配方復雜（穩(wěn)定劑、掩蔽劑），穩(wěn)定性差，不能完全避免內(nèi)外源物質(zhì)干擾。性差，不能完

43、全避免內(nèi)外源物質(zhì)干擾。2. 2. 雙試劑的特點雙試劑的特點 （1 1）可較徹底排除樣品空白和內(nèi)外源干擾物）可較徹底排除樣品空白和內(nèi)外源干擾物 （2 2）更加符合酶偶聯(lián)反應的特性和過程）更加符合酶偶聯(lián)反應的特性和過程 （3 3）試劑配方簡單）試劑配方簡單 （4 4）試劑穩(wěn)定，便于儲存，運輸和使用）試劑穩(wěn)定，便于儲存，運輸和使用 （5 5）可用抑制法直接測定某些同工酶）可用抑制法直接測定某些同工酶第72頁/共96頁3. 3. 液體試劑的優(yōu)點液體試劑的優(yōu)點 （1 1）不需手工調(diào)制，省工省時）不需手工調(diào)制，省工省時 （2 2）試劑批間差小，重復性好）試劑批間差小，重復性好 （3 3）杜絕干粉試劑重溶時

44、因水質(zhì)差引起試劑變質(zhì)）杜絕干粉試劑重溶時因水質(zhì)差引起試劑變質(zhì) （4 4）有利于急診標本）有利于急診標本 （5 5）按需取量，避免浪費）按需取量，避免浪費第73頁/共96頁自動生化分析儀主要參數(shù)自動生化分析儀主要參數(shù)1.1.測定方法學類型的選擇測定方法學類型的選擇: : 終點法終點法, ,速率法速率法, ,固定時間法固定時間法2.2.溫度溫度3.3.波長波長4.4.樣品與試劑量樣品與試劑量5.5.延遲時間延遲時間6.6.測定時間測定時間7.7.濃度校正因子濃度校正因子第74頁/共96頁四、免疫濁度分析法四、免疫濁度分析法 抗體（抗體（AbAb）與可溶性抗原（）與可溶性抗原（AgAg）反）反應，形

45、成一定結(jié)構(gòu)的免疫復合物，成應，形成一定結(jié)構(gòu)的免疫復合物，成為懸浮于反應溶液中的微粒。在沉淀為懸浮于反應溶液中的微粒。在沉淀反應中形成的復合物微粒具有特殊的反應中形成的復合物微粒具有特殊的光學性質(zhì)，可用儀器檢測，提高了方光學性質(zhì)，可用儀器檢測，提高了方法的速度、靈敏度和易操作性。法的速度、靈敏度和易操作性。第75頁/共96頁抗原抗原- -抗體沉淀反應的特征抗體沉淀反應的特征1. 1. 抗體過剩區(qū)：抗體過剩區(qū)：隨著抗原濃度增加，隨著抗原濃度增加，ICIC也相應增加，濁度增加。也相應增加，濁度增加。2. 2. 等價點：等價點：抗原抗體相當時，所有抗體與抗原形成抗原抗體相當時，所有抗體與抗原形成ICI

46、C，濁度最大，達到，濁度最大，達到等價點。等價點。3. 3. 抗原過剩區(qū)：抗原過剩區(qū)：抗原過量存在，不但不會形成更多的抗原過量存在，不但不會形成更多的ICIC，反而會引起原，反而會引起原先的先的ICIC溶解，濁度下降，產(chǎn)生虛假的低濃度結(jié)果。溶解，濁度下降，產(chǎn)生虛假的低濃度結(jié)果。第76頁/共96頁1 1透射比濁測定法透射比濁測定法 是測定入射光強度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接測定散射是測定入射光強度由于溶液中粒子的散射而降低的程度，它并不直接測定散射的光強。這一點與分光光度測定法極為類似。用這種方法時，多用聚乙二醇的光強。這一點與分光光度測定法極為類似。用這種方法時，多用聚乙二醇

47、（PEGPEG）作為反應增強劑。這種非離子型聚合物可以降低抗原抗體復合物的溶解）作為反應增強劑。這種非離子型聚合物可以降低抗原抗體復合物的溶解度。度。2 2散射比濁測定法散射比濁測定法 它是直接測定溶液中微粒所散射的光強。散射比濁法也已經(jīng)用于自動分析儀器它是直接測定溶液中微粒所散射的光強。散射比濁法也已經(jīng)用于自動分析儀器中。中。第77頁/共96頁3 3免疫濁度測定中應注意的問題免疫濁度測定中應注意的問題（1 1）偽濁度的影響。）偽濁度的影響。 非特異的交叉反應非特異的交叉反應 增濁劑濃度增濁劑濃度 反應時間反應時間 樣品本身的濁度樣品本身的濁度 試劑的污染和變質(zhì)試劑的污染和變質(zhì) 器材不夠清潔器

48、材不夠清潔第78頁/共96頁(2)(2)鉤狀效應（鉤狀效應（hook effecthook effect）的影響。）的影響。當當AgAg和和AbAb濃度比例不當時，不能有濃度比例不當時，不能有效地形成免疫復合物，產(chǎn)生弱陽性效地形成免疫復合物，產(chǎn)生弱陽性甚至假陰性結(jié)果。甚至假陰性結(jié)果。(3)(3)嚴格的室內(nèi)質(zhì)控是極必要的。嚴格的室內(nèi)質(zhì)控是極必要的。(4)(4)標準曲線的制作標準曲線的制作. .第79頁/共96頁五、方法學評價五、方法學評價（一）準確度試驗 準確度是指測定值與準確度是指測定值與“真值真值”的符合程度。是評價一項實驗方法是否可取的符合程度。是評價一項實驗方法是否可取的重要指標。的重要

49、指標。 1 1標準物鑒定標準物鑒定 為了確定和評價方法的準確性，常用基準標準液或參考血清為樣本進行檢為了確定和評價方法的準確性，常用基準標準液或參考血清為樣本進行檢測，所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，以衡量方法的準確性。測，所得結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學處理，以衡量方法的準確性。第80頁/共96頁2 2回收試驗回收試驗 回收率的計算是（回收值回收率的計算是（回收值/ /加入加入值）值）100100，這里的回收值是指，這里的回收值是指標本中加入標準液后的測定值減去標本中加入標準液后的測定值減去標本原來的測定值。回收率達到標本原來的測定值。回收率達到1001005 5者為準確性符合要求的者為準確性符合要求的方法。方法。第

50、81頁/共96頁回收試驗應注意：回收試驗應注意： 樣品的選用樣品的選用 樣品最好應用新鮮混合血樣品最好應用新鮮混合血清。清。 標準物的加入標準物的加入 應先配制成適當濃度的應先配制成適當濃度的標準物溶液，再加入到基礎(chǔ)樣品中。所加標標準物溶液，再加入到基礎(chǔ)樣品中。所加標準溶液量越少越好。準溶液量越少越好。 標準物的加入濃度標準物的加入濃度 最好同時設(shè)計幾個最好同時設(shè)計幾個加入不同濃度標準液的試驗樣品。加入標準加入不同濃度標準液的試驗樣品。加入標準液后的試驗樣品的總濃度不能超過本方法的液后的試驗樣品的總濃度不能超過本方法的線性范圍。線性范圍。 操作準確操作準確 標準液的加入量必須準確無標準液的加入

51、量必須準確無誤，應經(jīng)多次試驗。誤，應經(jīng)多次試驗。第82頁/共96頁（二）精密度試驗（二）精密度試驗 目前常以重復性試驗來衡量一個方法的精密目前常以重復性試驗來衡量一個方法的精密度 。 一 般 來 說 ， 標 準 差 、 變 異 系 數(shù) （度 。 一 般 來 說 ， 標 準 差 、 變 異 系 數(shù) （ C VC V s/xs/x100100）小的實驗方法精密。）小的實驗方法精密。 1 1批內(nèi)精密度試驗批內(nèi)精密度試驗 取一份樣品，用欲測項取一份樣品，用欲測項目實驗方法進行操作，反復測定目實驗方法進行操作，反復測定2020次以上，計算次以上，計算每一次的測定結(jié)果，然后計算每一次的測定結(jié)果，然后計算x

52、 x、s s、CVCV。 2 2批間精密度試驗批間精密度試驗 這種試驗也是同一份標這種試驗也是同一份標本進行重復測定，至少為本進行重復測定，至少為2020次。但是重復測定不次。但是重復測定不是在一天內(nèi)完成，而是每天隨患者標本一起測定，是在一天內(nèi)完成，而是每天隨患者標本一起測定，再計算再計算x x、s s、CVCV。第83頁/共96頁（三）靈敏度試驗（三）靈敏度試驗 靈敏度是單位濃度變化所引起的指示物理量的變化。在定量分析中是指被檢靈敏度是單位濃度變化所引起的指示物理量的變化。在定量分析中是指被檢測物單位濃度的變化所引起的物理量的變化。測物單位濃度的變化所引起的物理量的變化。 所選用的方法，應進

53、行線性試驗，選用線性范圍寬度適宜的方法。線性檢驗所選用的方法，應進行線性試驗，選用線性范圍寬度適宜的方法。線性檢驗所得結(jié)果，可用回歸方程（所得結(jié)果，可用回歸方程（Y Ya abXbX）處理，回歸系數(shù)（）處理，回歸系數(shù)（b b）為靈敏度大小）為靈敏度大小的指標，回歸系數(shù)大，靈敏度高，反之亦然。不同方法也可用回歸系數(shù)進行的指標，回歸系數(shù)大，靈敏度高，反之亦然。不同方法也可用回歸系數(shù)進行比較，回歸系數(shù)大的靈敏度高。比較，回歸系數(shù)大的靈敏度高。第84頁/共96頁（四）線性試驗（四）線性試驗 線性試驗是衡量一個方法的檢測范圍的一種實驗。通過線性試驗，可以了解該方線性試驗是衡量一個方法的檢測范圍的一種實驗。通過線性試驗，可以了解該方法的最高檢測值和最低檢測值。法的最高檢測值和最低檢測值。 超出上下限值的結(jié)果是不可靠的，為使結(jié)果可靠，遇到這種情況應加大樣品用量超出上下限值的結(jié)果是不可靠的，為使結(jié)果可靠，遇到這種情況應加大樣品用量或稀釋樣品后再次檢測。或稀釋樣品后再次檢測。 線性試驗的方法基本同標準曲線的制備。一般先進行線性試驗，然后在線性范圍線性試驗的方法基本同標準曲線的制備。一般先進行線性試驗，然后在線性范圍內(nèi)制備標準曲線。內(nèi)制備標準曲線。第85頁/共96頁（五）特異性及干擾試驗（五）特異性及干擾試驗 干擾是指標本中存在分析物以外的其他物干擾是指標本中存在分析物以外的其他物質(zhì)，致使測定結(jié)果有