1、電泳原理與技術n移動界面電泳(moving boundary electrophoresis)n區帶電泳(zone electrophoresis)n穩態電泳(steady state electrophoresis)其中以區帶電泳為目前常用的電泳系統。依據技術原理，電泳可分三種形式:任何電泳技術方法，均是以某種載體或支持介質作為樣品中蛋白質的泳動跑道，在一定溫度、ph條件下、穩定的靜電場中實現對樣品中蛋白質的分離，進而進行分析。電泳支持介質必須具有：化學惰性、不干擾大分子的電泳過程，化學穩定性好、均勻、重復性好、電內滲小等特性。常見凝膠電泳的支持介質：聚丙烯酰胺凝膠（polyacrylami

2、de gel, pag)由丙烯酰胺和交聯劑n，n-甲叉雙丙烯酰胺在引發劑和增速劑的作用下，聚合而成。未交鏈的單體丙烯酰胺屬神經性毒素，并具有致癌作用，實驗過程注意盡可能避免中毒。實驗過程簡單，儀器設備叫貴重，但分辨率很高，重復性強。主要用于蛋白質、酶、小分子核酸等分離分析。瓊脂糖凝膠：從瓊脂中精制分離出的膠狀多糖，其分子結構大部分是由1，3連接的-d吡喃半乳糖和1,4連接的3,6脫水-d吡喃半乳糖交替形成。試劑昂貴，方法簡單，分辨率較高。主要用于dna分離分析。淀粉凝膠：15%淀粉凝膠作為載體可對一定分子量的蛋白質進行有效分離。成本低，簡單。主要用于同工酶等分離分析。一、醋酸纖維薄膜電泳1.操

3、作技術要領：(1).醋酸纖維薄膜前處理(2).點樣：點樣23l；點樣量多少直接影響分離效果，控制點樣量是試驗成功的關鍵。點樣位置合理：距離薄膜一端約2cm樣線上平行點樣，23個樣點基本保持在一條線上。商品薄膜在ph8.6巴比妥緩沖液浸泡1h以上。取出后，小塊濾紙對折吸取薄膜表面多余的緩沖液，進行點樣。(3).醋酸纖維薄膜置于電泳槽樣點一端貼陰極鹽橋(黑線端)，非點樣端置于陽極鹽橋(紅線)排除氣泡壓實(確保薄膜與電極接觸良好)。(4).電泳：80100v；3550min。ph8.6巴比妥緩沖液培養皿醋酸纖維薄膜-+點樣線懸空切勿接觸(近)濾紙(5).染色薄膜浸泡于氨基黑溶液中510min。(6)

4、.脫色薄膜浸泡于漂洗液中進行漂洗，至背景為乳白色。(7).薄膜干燥(8).透明薄膜浸泡于透明液中1030s，及時取出貼于干凈玻板上，排氣泡。慢加熱，逐步烘干。(9).分析薄膜從玻板上取下，進行分析。alb(清蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白薄膜置于烘箱完全干燥。- -+ +alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白各組分構成白蛋白1-酸性糖蛋白；1-抗胰蛋白酶；hp；cp；-巨球蛋白；脂蛋白；轉鐵蛋白；補體系統；脂蛋白igg；igm；iga；igd；ige 正常參考值alb：57%68%1：1.0%5.7%2：4.9%11.2%：7%13%：9.8%18.2%凝膠成像系統拍

5、照及掃描分析結果2.醋酸纖維薄膜電泳分離人血清蛋白質原理蛋白質名稱等電點相對分子量(kd)alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白4.645.065.065.126.857.36920030090150156950- -+在ph8.6條件下血清中哪種蛋白質在電場中向陽極移動最快？- - - - - - - - - - - - - - - - - - -分子量相同時，帶負電荷越多者移動較快；相同等電點時，分子量較小者向異極移動較快。1比2球蛋白分子量小，向陽極移動快！alb(白蛋白)-球蛋白-球蛋白1-球蛋白2-球蛋白- -+ +%57-722-54-96-1212-20polyac

6、rylamide gel electrophoresis二、聚丙烯酰胺凝膠電泳(page)不同蛋白質由于帶電性質、分子顆粒大小及形狀不同，在聚丙烯酰胺凝膠(pag)中，向異極泳動速度快慢不同，經過電泳最終被分開。由于蛋白質在凝膠系統分離過程中存在濃縮效應、電荷效應和分子篩效應，因此，page法是分離、分析蛋白質較好的技術方法之一。（一）page技術流程簡介2.制膠1.組架3.點樣4.電泳5.染色6.脫色7.分析玻板膠條u型玻板封膠分離膠溶液濃縮膠溶液插入梳子+-電極緩沖液電極緩沖液通常采用過硫酸銨或核黃素來引發該過程,以n,n,n,n-四甲基乙二胺(tetranmethylenediamine

7、,temed)為增速劑。該引發-增速的催化系統實質是自由基催化的氧化-還原過程。其結果是液態轉變為逐步膠凝的半固體狀態。凝膠形狀取決于模具。（二）丙烯酰胺凝膠聚合原理與凝膠結構ch2=chc=onh2ch2=chc=onh2ch2nhc=och2=ch甲叉雙丙烯酰胺+丙烯酰胺膠聯單體膠聯劑過硫酸銨temed聚丙烯酰胺凝膠具備立體的網狀結構-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-c=onh2c=onhch2nhc=oc=onh2c=onh2c=onh2-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-ch-ch2-ch-n-ch2-c=onhch2立體的網狀結構中網眼大

8、小與凝膠濃度相關:總膠濃度(%)平均孔徑(nm)bis(鉸鏈劑)占總膠的百分數1515256.58.010.012.015.02402301901701401901601409070280240200360300膠濃度t=a+bm100%膠聯度c=ba+b100%a:丙烯酰胺(單體)的量(g)b:甲叉雙丙烯酰胺(交聯劑)的量(g)m:a+b所在緩沖溶液總體積(ml)凝膠內均勻的立體的網狀結構示意圖凝膠中網眼的大小與膠的濃度有關，膠的濃度越小，其網眼越大，膠的濃度越大網眼越小。一般常規膠濃度為8%-10%。分離分析較小的蛋白質分子時用較高濃度的凝膠，而分離分析分子量較大的蛋白質時則用較大濃度的凝

9、膠。凝膠濃度t(c=2.6%)分子量范圍(kda)凝膠濃度t(c=5%)分子量范圍(kda)53020056070010151001022280151050151020020215205150凝膠濃度與有效分離蛋白質分子量之間的關系n分離膠濃度太大，孔徑小于樣品分子尺寸，電泳時蛋白質分子不能進入凝膠，樣品仍留在加樣位置；n分離膠濃度太小，孔徑太大，樣品中各種蛋白質分子受到的分子篩效應減小，不能得到很好的分離；因此實驗過程需要根據樣品中被分析的蛋白質分子大小適當進行設計。引發劑和增速劑的濃度：濃度小易導致聚合速度慢；濃度過大則易導致電泳時的燒膠以及電泳帶的畸變；一般控制使聚合過程在4060分鐘內

10、完成。系統ph值：酸性條件、堿性條件均可，但仍然存在一個最佳ph值，以獲得最佳的聚合結果；溫度：低溫下聚合導致凝膠變脆和混濁；適當提高溫度可以是凝膠透明而有彈性；分子氧：分子氧的存在會阻礙凝膠的化學聚合；抽氣系統純度：金屬離子會影響凝膠的聚合；（三）影響凝膠聚合速度主要因素（四）page分離蛋白質原理pag系統電泳分離蛋白質具有很高的分辨率，因為該系統工作狀態下存在三種效應，這三種效應與凝膠系統ph不連續性及凝膠網眼大小有關。1.濃縮效應電極緩沖液tris-hcl(ph8.5)濃縮膠為的ph6.5，通電后樣品中的各種帶負電荷的蛋白質會在快離子(cl-)和慢離子形成的高壓帶之間初步分開并形成很窄

11、的條帶，而整個樣品中的蛋白質在將進入分離膠時會形成一條細線，即被濃縮之效果。2.電荷效應3.分子篩效應樣品+ +- -甘氨酸緩沖液濃縮膠(網眼大)甘氨酸緩沖液分離膠(網眼小)ph8.5ph6.5ph8.9玻板組成的三明治模具(1mm厚)電泳槽2.電荷效應3.分子篩效應在設置好的濃縮膠及分離膠特定ph條件下，不同蛋白質所帶電荷多少不同，并在穩定的靜電場中向異極泳動的動力所決定的泳動速度不同，最終會被分離。分離膠內屬于立體的網狀結構，分子量較大的蛋白質顆粒向異極泳動受到的阻力較大，泳動較慢，而分子量較小的蛋白質則阻力較小，向異極涌動較快，最終被分開。（五）影響蛋白質泳動速度及分離效果主要因素1.系

12、統的ph值凝膠體系及電極緩沖液的ph決定樣品中蛋白質的帶電性質，直接影響蛋白質的電泳方向和泳動速度。ph一般設置成大于樣品中蛋白質的等電點，蛋白質均荷負電，電泳方向朝陽極。而當ph小于樣品中蛋白質的等電點時，則所有蛋白質分子荷正電，靜電場中向陰極泳動。前一種電泳系統屬于堿性電泳，后者成為酸性電泳。2.電場強度普通電泳高壓電泳520v/cm電壓降(電位梯度)。70200v/cm電壓降(電位梯度)。直接影響蛋白質泳動速度的主要因素。3.溫度電泳過程中由于電流作用致使凝膠發熱，熱效應對電泳有很大影響。溫度升高時介質粘度下降，分子熱運動加劇，自由擴散變快，有效遷移率增加，但對于蛋白質分離不利。另外較高

13、溫度會使凝膠變形，分子篩效應降低，影響分離。因此，一般要求在15-25之間進行電泳效果較好。4.電滲作用電泳介質或支持物(如凝膠)在電極緩沖液中吸附帶電離子，使溶液相對帶電，進而在電場作用下，溶液就會向一定方向移動，這種想象稱為電滲現象。帶電溶液的移動會影響蛋白質的泳動。sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis三、三、sds-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(sds-page)蛋白質受還原劑作用解開二硫鍵，同時受sds作用處于變性狀態，在聚丙烯酰胺凝膠中，向亦極泳動速度快慢主要是按照分子顆粒從小到大小依次排開得以分離

14、的技術方法。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳設備簡單、操作簡便、快速、重復性好、樣品無需純化。由于同時存在三種效應，因此分辨率和檢出靈敏度高。技術主要特點：技術主要應用范圍：除了分離分析蛋白質亞基種類、表達劑量之外，還可用于測定未知蛋白質亞基分子量。（一）sds-page 分離基本原理蛋白質分子的解聚sds是一種陰離子去污劑，作為變性劑和助溶性試劑，能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白質分子的二級、三級結構；而強還原劑，如二硫蘇糖醇、-巰基乙醇能使半胱氨酸殘基之間的二硫鍵斷裂。在樣品和凝膠中加入sds和還原劑后，蛋白質分子被解聚為組成它們的多肽鏈，解聚后的氨基酸側鏈與sds結合

15、后，形成帶負電的蛋白質-sds膠束，所帶電荷遠遠超過了蛋白質原有的電荷量，消除了不同分子間的電荷差異；同時，蛋白質-sds聚合體的形狀也基本相同，這就消除了在電泳過程中分子形狀對遷移率的影響。因此，sds-page過程中蛋白質分子在凝膠中的泳動速度主要取決與亞基的分子量大小。與page技術方法相似，蛋白質亞基在電泳過程中存在三效應。蛋白質樣品用sds處理后亞基的解聚和分子形狀的改變：（二）未知蛋白質分子量的測定以不同分子量的標準蛋白進行sds-page電泳得到不同標準蛋白的電泳遷移率，制作標準校正曲線，然后對未知蛋白在相同條件下進行sds-page電泳，測定遷移率，從標準曲線得到相應的分子量；相對遷移距離(relative migration,cm)logmr