1、從MHC/類相關因子探討針灸對帶狀皰疹的免疫逃避作用學號：12007076 姓名：李建偉 專業：中醫外科學(一)研究內容、研究目標、以及擬解決的關鍵問題1.研究內容課題以VZV免疫逃避機制中發揮著重要作用的感染病毒細胞免疫識別的MHC/類基因抑制為切入點，圍繞IFN-和參與免疫逃避的的兩條主要途徑，有目的地觀察IFN-和相關基因CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC的表達量、分布及變化規律，進一步檢測CTamRNA、MHCmRNA 、MHCmRNA的表達變化以及外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群、NK細胞活性的動態變化，并對上述指標的相關性及變化規律進行分析，說明調節VZV

2、病毒感染的免疫逃避機制是針灸治療帶狀皰疹、減輕疼痛和后遺癥的關鍵。 且明確針刺與放血作用機制的差異所在。主要開展以下工作： 研究內容：（1）皮損組織病理學觀察。（2）鏡檢：外周血有核細胞計數、白細胞、淋巴細胞分類計數、巨噬細胞吞噬功能。（3）流式細胞儀檢測：外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群、NK細胞活性。（4）免疫組化法ABC染色法檢測：皮損組織IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC、蛋白的表達及分布規律。（5）western blot檢測：皮損組織IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC蛋白量的表達。（6）RT-PCR法檢測：皮損組織C

3、TamRNA、MHCmRNA 、MHCmRNA。2.研究目標：2.2.1旨在明確針灸治療帶狀皰疹，減輕疼痛和后遺神經痛，與調節MHC/類相關基因、蛋白的分布及表達關系，為針灸治療免疫逃避類疾病提供科學依據。2.2.2通過比較針灸與傳統抗病毒藥物的作用差異，為解決帶狀皰疹病毒耐藥性問題提供理論依據。2.2.3旨在明確針刺與放血在治療皰疹作用機制中的差異。3.擬解決的關鍵性問題：針刺放血對MHC/類相關基因、蛋白的調節與其有效干預VZV病毒免疫逃避機制的關系。(二)擬采用的方案及可行性分析1.擬采用的方案實驗環境：實驗室相對封閉，自然采光，環境溫度控制在2025之間，濕度控制在60%左右。實驗動物

4、：清潔級昆明種小鼠，體重2224g，籠養，自由飲食，由上海市實驗動物中心提供全價動物顆粒飼料。1.1分組及造模：第一次實驗采用大鼠192只，按照體重分層隨機，分為6組，每組8只，在造模完成后開始治療，連續7天，隔日（第1、3、5、7天）處死一批，動態觀察針刺放血對大鼠VZV病毒初感染的影響；第二次實驗在造模后30天開始治療，觀察針刺放血對大鼠VZV病毒潛伏、復發的影響，其他處理同上，第7天處死取材觀察； 造模：腹腔注射VZV8805株系病毒，按照100TCID50/0.1ml病毒量接種細胞，感染后48小時，模型即成。模型組：造模方法同上，每天陪同正常組、針刺組、放血組、針刺放血組固定，連續7天

5、。藥物組：造模方法同上。左側腹腔注射ACV0.1g/kg/d，連續三天，每天陪同正常組、針刺組、放血組、針刺放血組固定，連續7天。針刺組：造模方法同上。按照造模時間的先后順序，在造模完成后，開始針刺，進針0.20.3mm，平補平瀉，留針10min，每日1次，連續7天。放血組：造模方法同上。按照造模時間的先后順序，使用皮膚針沿皮損和脊神經叩刺，連續7天。針刺加放血組：方法同針刺組和放血組，治療連續7天。正常組：腹腔注射同體積生理鹽水。每天陪同模型組、針刺組、艾灸組固定，連續7天。 1.2 取材方法：造模結束后，在模型組40只中隨機處死8只，取材檢測VZV對對小鼠相關指標的影響。針刺組、放血組、針

6、刺加放血組、藥物組、正常組在治療后的第1、3、5、7天隨機處死8只小鼠取材。取材放入-80oC低溫冰箱保存、備檢。1.3穴位選取：固定小鼠方法：根據小鼠的形體，在木板上釘上四個適當距離的鐵釘，將夾子套在鐵釘上，用夾子夾住小鼠的四肢以做固定。小鼠穴位定位參考實驗針灸學，模擬小鼠的定位方法：“大椎”在第七頸椎與第一胸椎間；“膈俞”在第七胸椎下兩旁肋間，左右側各一穴；“合谷”在在手背，當第二掌骨橈側的中點處，“曲池”在在肘橫紋外側端，當尺澤與肱骨外上髁連線中點，“委中”在在腘橫紋中點，當股二頭肌腱與半腱肌腱的中間，“尺澤”在在肘橫紋中，肱二頭肌腱橈側凹陷處。1.4 觀察指標及方法：1.4.1皮膚組織

7、病理切片1.4.2鏡檢：外周血有核細胞計數、白細胞、淋巴細胞、巨噬細胞分類計數各組小鼠每天定時，專人割尾靜脈采血10l，加入0.38ml的白細胞稀釋液中，搖勻，靜置3分鐘，光鏡查外周血有核細胞、白細胞數和淋巴細胞、巨噬細胞分類計數； 1.4.3流式細胞儀檢測：外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群、NK細胞活性。制備樣品：處死動物，離心，收集細胞懸液，滴加特異性免疫熒光抗體，用流式細胞儀上機檢測并進行分選。流式細胞儀檢測：將分選細胞清洗、離心(1500RPM，10min)，清洗兩次，棄上清；加入PI熒光標記抗體；用流氏細胞儀分別檢測CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群、NK細胞活性。分析方法：測出

8、的數據經PHOENIX公司分析軟件Multicycle處理，得出細胞各周期的CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群、NK細胞相對含量和百分數,并繪出DNA分布的直方圖。1.4.4免疫組化法ABC染色法檢測：皮損組織IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC、蛋白的表達及分布規律。 制備樣品：處死動物，取股骨骨髓，10%福爾馬林固定標本，石蠟包埋，4m厚切片。 免疫組化染色檢測方法：鼠抗人IFN-單克隆抗體(DO-27)（武漢博士德生物有限責任公司，濃度1:50）；鼠抗人 cyclinD1單克隆抗體（DCS/6）（NeoMarker福州邁新公司，濃度1:100）；鼠抗人單克隆抗體

9、CTa 、Jak1、Jak2、MHC、MHC（晶美公司）；S-P免疫組化試劑盒（北京中山公司）。ABC法：用0.1 mol/L PBST洗，切片與0.1mol/L PBST(含0.5%H2O2)作用30 min，用0.1mol/L PBST洗,10 min×3次，與一抗4溫育，用0.1 mol/L PBST洗,10 min×3次，與二抗(1:1000稀釋)室溫作用2 h，用0.1 mol/L PBST洗，10 min×3次，與ABC(1:2000稀釋)室溫作用1 h.用0.1mol/L PBST洗，10 min×3次.在DAB溶液中反應，用0.05 mo

10、l/L Tris-HCl緩沖液終止反應，用包被有明膠的玻片固定、水洗，用系列濃度乙醇(70%1次，80%1次，90%2次，95%2次，100%3次，每次5 min)脫水，二甲苯中透明，封邊。 分析方法：IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC免疫組化陽性信號均為棕黃色細顆粒狀，染色結果按陽性細胞百分比及染色強度綜合記分作半定量分析。 1.4.5 western blot檢測：皮損組織IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC蛋白量的表達。制備樣品：取樣品1×1061×107細胞，PBS清洗，去PBS加0.11ml總蛋白抽提試劑抽

11、提總蛋白；使用KCTMBCA蛋白質定量試劑盒，測定樣品濃度。方法：變性聚丙烯酰胺不連續凝膠電泳(SDS-PAGE)；蛋白質轉移到硝酸纖維膜，30mA恒流，4°C轉移，過夜；膜在5BSA溶液中室溫孵育1小時，加入一級抗體室溫孵育1.5小時；加入HRP標記的二級抗體，室溫孵育1小時；化學發光法檢測，X膠片曝光顯影。 分析方法：掃描圖片，用ImageJ分析軟件將圖片上每個特異條帶灰度值數字化；將目的蛋白灰度值除以內參GAPDF的灰度值，校正誤差，所得結果代表某樣品的目的蛋白相對含量。1.4.6 RT-PCR法檢測：皮損組織CTamRNA、MHCmRNA 、MHCmRNA。 提取總RNA：取

12、標本，用試劑(GIB-CO公司，美國)提取總RNA，溶于無RNA酶的滅菌超純水中，用紫外分光分度計測定總RNA的濃度和純度，同時瓊脂糖電泳觀察其完整性。將RNA稀釋成1mg/L，-80°C保存。 MHC、MHC和-actin引物序列CTa: 5-ACTCGATATCATTCCGGCAGACCTGAAGCAT-35-GCTCACTGCC-CCAGCCCAATA-3MHC: 5- TGTCCCGGCCCGGCCTCGGG-3 5-TCTCAGCAGGGTAGAAGCTA- 3MHC: 5-ACCAACGGGACGAGCGCAT-35-CAAGCCGCCGCAGGGAGGTG-3-acti

13、n: 5- AACGGCTCCGGCATGTGCAA - 35-CTTCTGACCCATGCCCACCA-3PCR反應體系30l，轉錄產物3l，2U Taq DNA聚合酶，10mmol/L 4×dNTP 2lPOL和-actin引物。反應條件：94°C預變性；94°C 50s，55°C 55s，72°C 60s，72°C 10min共30個循環。分析方法：產物經SYNGENE凝膠成像系統分析，以目的基因和-actin積分灰度值的比值，作為目的基因mRNA的相對表達量。研究路線昆明種小鼠 CTX100mg/kg/d，連續3天正常組模型組

14、針刺組 放血組以上各組在造模后后每天相同時間，分別進行相應處理，并作動態觀察。正常組給予同體積的生理鹽水；針刺組10min/次/天，放血組皮膚針沿皮損和脊神經叩刺，1次/天，藥物組、正常組、模型組陪同固定。外周血有核細胞計數、白細胞、淋巴細胞分類計數、巨噬細胞吞噬功能。皮損組織病理學觀察藥物組流式細胞儀檢測：外周血CD4+、CD8+T淋巴細胞亞群、NK細胞活性。免疫組化法檢測皮損組織IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC蛋白表達及分布規律Western blot檢測皮損組織IFN-、CTa、Stat1、Jak1、Jak2、MHC、MHC蛋白表達量RT-PCR方法測定:

15、CTamRNA、MHCmRNA、MHCmRNA表達率和表達量針刺放血組Spss統計分析得出結論、撰寫論文左側腹腔注射ACV0.1g/kg/d3.可行性分析： 1、本人針灸專業碩士、中醫外科皮膚病方向在讀博士，多學科背景保證實驗研究按計劃進展并不斷推向深入。2、前期大量的臨床實踐和文獻回顧性研究顯示出針刺放血可改善VZV感染機體免疫功能；3、研究思路清晰，目的明確，有成熟的理論指導，所選指標針對性強，研究方案可行，研究方法及技術路線成熟；4、實驗室的軟件、硬件設備完全具備科研條件。上海中醫藥大學實驗室條件先進，課題所需儀器設備均已具有，所需試劑、抗體均可購買。5、課題組成員層次結構、知識結構合理

16、，有較強的科研能力和團結協作精神。4.本項目的特色與創新之處1、首次開展針灸對VZV免疫逃避機制的研究，進一步揭示針灸改善調節VZV感染機體免疫功能的的分子生物學機制，也為針灸治療病毒感染的相關疾病提供了理論依據。2、通過研究針灸對帶狀皰疹后遺神經痛的調節機制，促進臨床藥物、針刺放血等多種療法相結合，提高臨床療效，更具實際意義。3、首次探討針刺與放血療法在改善VZV感染機體免疫功能中的差異，為兩種療法治療不同病理的相關疾病提供實驗依據。5.年度研究計劃及預期研究結果2008.01-2008.06 建立動物模型，進行細胞分選及各項檢測的預實驗。2008.07-2009.07 擴大樣本數量，應用流

17、式細胞儀、免疫組織化學方法、Western Blot法、RT-PCR法等方法，完成所有實驗。2010.08-2010.12 完成統計學處理，進行課題總結。6.預期研究結果本課題通過觀察針刺放血對MHC/類相關酶類和蛋白的影響，從而揭示針灸對抗病毒、提高免疫力作用新的分子生物學機制，為針灸在皮膚病及相關免疫類疾病中的應用提供可靠的實驗室依據，豐富針灸的科學內涵。其研究成果不僅為免疫逃避類相關疾病提供新的治療思路和方法，同時推動了針灸學與皮膚病學學科的交叉研究，同時明確針刺與放血作用機制的差異，為針灸在該領域的應用打下基礎。（二）研究基礎與工作條件1. 文獻掌握情況：對近20年來國內外有關帶狀皰疹的相關文獻進行了回顧性分析，尤其是近10年的有關中、西醫治療帶狀皰疹的臨床和實驗研究的論文，較全面的掌握了本研究領域的最新科研動態。2. 預研究情況：擬開展相關預研究，為下一步的研究提供基礎數