1、p-p-糖蛋白與癲癇耐藥糖蛋白與癲癇耐藥 概念性定義概念性定義 癲癇是一種以具有持久的致癇傾向和相應的神經生物、認知、社會心理等方面后果為特征的腦部疾病(2005年，ilae和國際癲癇病友會)。一、癲癇定義一、癲癇定義一、癲癇定義一、癲癇定義 實用性定義實用性定義( (新新) ) 癲癇是一種腦部疾病，符合如下任何一種情況可確定為癲癇：1、至少2次間隔24h的非誘發性(或反射性)發作；2、一次非誘發性(或反射性)發作，并且在未來10年內，再次發作風險與兩次非誘發性發作后的再發風險相當(至少60%)；3、診斷某種癲癇綜合征。符合以下任何一種情況，可以認為癲癇已不存在：1、已經超過了某種年齡依賴癲癇

2、綜合征的患病年齡；2、已經10年無發作，并且近5年已停用aeds (2014年，ilae)。( (吳立吳立文，等文，等. .解讀新的癲癇臨床實用性定義，中華神經科雜志，解讀新的癲癇臨床實用性定義，中華神經科雜志，2014)2014)二、流行病學資料二、流行病學資料131 1、全球患病情況、全球患病情況 who調查顯示癲癇的患病率約57，目前全球癲癇患者超過5000萬。2 2、國內患病情況、國內患病情況 王文志等調查報道，目前國內約有癲癇患者900萬，其中600萬左右為活動性癲癇；國內癲癇年發病率約28.8/10萬，每年新增癲癇患者約38萬；其中寧夏患病率約8.5，居全國之首。3 3、aedsa

3、eds治療現狀治療現狀 目前癲癇的治療仍然以aeds為主。在發展中國家，人們對癲癇缺乏正確認識以及醫療資源匱乏，大多數癲癇患者得不到合理有效的治療，存在很大的“治療缺口”。指南中指出我國活動性癲癇患者的治療缺口高達63%，據此估算大約有400萬活動性癲癇患者沒有得到合理的治療。二、流行病學資料二、流行病學資料 研究表明，新診斷的癲癇患者，如果接受規范、合理的aeds治療，7080患者的發作是可以控制的，其中6070的患者經25年的治療可以停藥，但有2030%的患者對各種aeds不敏感，產生耐藥。盡管各種新型盡管各種新型aedsaeds問世，癲癇耐藥依然是癲癇藥物治療中的棘手問題，問世，癲癇耐藥

4、依然是癲癇藥物治療中的棘手問題，也是目前研究熱點之一。也是目前研究熱點之一。4 4、癲癇危害、癲癇危害 癲癇對于個人、家庭和社會帶來嚴重的負癲癇對于個人、家庭和社會帶來嚴重的負面影響，面影響，如社會上存在對癲癇病的誤解、對癲癇患者的歧視、以及癲癇反復發作、長期服藥等均嚴重影響患者及家庭生活質量，帶來沉重的經濟負擔。同時，癲癇患者的保癲癇患者的保健、教育、就業、婚姻、生育等，也是備受關注的問題。健、教育、就業、婚姻、生育等，也是備受關注的問題。因此，癲癇不僅是醫療問題，也是重要的公共衛生和社會問題。 癲癇耐藥目前缺乏統一定義，并且耐藥概念尚有爭議。 2010年ilae將癲癇耐藥定義為：2種正確選

5、擇、可耐受的抗癲癇藥物經足夠療程及劑量的單藥或聯合用藥仍未能控制發作的癲癇。 有學者(bodet r,et al.)認為，除對第一種抗癲癇藥物耐藥外，對隨后連續多種單一藥物或聯合用藥治療均無效，并且排除假性耐藥后即可診斷癲癇耐藥。三、癲癇耐藥機制三、癲癇耐藥機制 癲癇耐藥機制復雜，仍不十分清楚，主要有以下四種學說： 多藥轉運體學說多藥轉運體學說 在bbb上有多種多藥轉運體，如p-糖蛋白(p-gp)、多藥耐藥相關蛋白(mrp)、主穹窿蛋白(mvp)、乳腺癌耐藥蛋白(bcrp)等，其功能是阻止可能有害毒性分子進入腦組織。aeds要想發揮療效就必須透過bbb，當這些轉運蛋白表達增加或活性增強時，可阻

6、止aeds穿過bbb到達腦組織，降低aeds在致癇灶的有效濃度。 藥物靶點學說藥物靶點學說 是指aeds作用靶點的分子結構、功能、位置的變化導致aeds敏感性下降，這種變化可以是遺傳基因所決定的，或者是獲得性的，即伴隨著癲癇發作同時發生，可能是發作、藥物治療的后果。aeds控制癲癇發作必須作用于腦內的分子靶點，這些靶點包括電壓門控式離子通道、神經遞質受體以及影響神經遞質釋放、吸收、轉運、代謝的酶。 神經網絡重組學說神經網絡重組學說 認為通過基因、神經遞質或微環境的作用引起神經元變性壞死和膠質細胞反應性增生，殘留神經元在錯誤信息的指導下向著非生理方向延伸，與下位突觸形成異常連接，形成了病理狀態下

7、的興奮性為主的神經環路，增加了發作的敏感性，并可避開一些重要的藥物作用和生理屏蔽，導致癲癇耐藥。 疾病自身嚴重性學說疾病自身嚴重性學說 耐藥是與疾病自身嚴重性相關的固有特性，由疾病本身的病因學、病理改變所決定。如皮質發育不良本身有輕、中、重之分，直接決定其臨床療效。不同的癲癇綜合征其嚴重性不同，如伴中央顳區棘波的兒童良性癲癇(bect)正規抗癲癇治療預后良好；不典型兒童良性局部性癲癇(abpe)為bect變異型難以控制，預后不佳，常遺留輕至中度智力缺陷。 p-gpp-gp的結構及分布的結構及分布 p-gp是一個磷酸化和糖基化的能量依賴性跨膜外向轉運蛋白，其分子量為170kd(包含1280個氨基

8、酸)，由12個疏水跨膜區和兩個胞內三磷酸腺苷(atp)結合點組成，atp結合點為底物轉運提供能量。p-gp主要位于毛細血管近血管腔一側和毛細血管外星形膠質細胞足突上，參與構成bbb。四、四、p-gpp-gp與癲癇耐藥的相關研究與癲癇耐藥的相關研究1 1、p-gpp-gp與結構、功能及編碼基因與結構、功能及編碼基因 p-gpp-gp功能功能 其基本功能是作為一個能量依賴性運輸泵，將來自大腦的多種有害物質逆濃度梯度轉運至細胞外，減少其在大腦中的蓄積，減輕細胞毒作用。 p-gpp-gp底物底物 其底物具有親脂性并帶有陰離子，在膜上有較長的停留時間，可被其轉運，如pb、cbz、pht和ltg等陸續被證

9、實為p-gp的底物，影響其在體內的吸收和分布。尚無證據表明lev是p-gp的底物(potschka h,et al.)。 p-gpp-gp抑制劑抑制劑 抗生素類(利福平)、免疫抑制劑(環孢素a)、鈣拮抗劑(維拉帕米)等。 p-gpp-gp的編碼基因的編碼基因 abcb1基因位于7q21.1，全長大約100kb，包含29個外顯子和28個內含子，超過50個單核苷酸多態性(snps)。其中位于12號外顯子的t1236c、21號外顯子的g2677t/a、26號外顯子的c3435t，是研究其與癲癇耐藥相關性常用的位點。p-gpp-gp二級結構模式圖二級結構模式圖 p-gp的12個跨膜區在細胞膜上形成一個

10、三維的桶狀結構。小圓圈內（箭頭）標注了常見的snps所在位置，灰色圓圈標注的區域為atp結合部位(li yan-hong,et al.)。 2 2、p-gpp-gp對對aedsaeds的影響的影響 細胞水平細胞水平 用同位素法測定細胞內的aeds濃度，結果顯示耐藥細胞內aeds濃度明顯低于正常細胞(tishler dm,et al.)。用高效液相色譜法測定耐藥和正常細胞內aeds的濃度，發現耐藥細胞內aeds濃度僅相當正常細胞內的1/4左右，對耐藥細胞采用維拉帕米干預后，可以提高耐藥細胞內aeds濃度，直觀的證實p-gp可以限制aeds 進入細胞內(陳英輝,等)。 動物模型動物模型 研究發現耐

11、藥組中致癇灶p-gp的表達明顯高于敏感組；加用高選擇性的p-gp抑制劑后，耐藥組大鼠的癲癇發作明顯減少(schmidt d,et al.)。在顳葉癲癇動物模型中，海馬區p-gp表達增加，該區域aeds的濃度顯著降低(van vliet ea,et al)。表明p-gp過表達與癲癇耐藥有關。 癲癇患者癲癇患者 用逆轉-聚合酶鏈反應(rt-pcr)定量分析了19例難治性癲癇患者手術切除的腦組織標本，其中11例樣本的abcb1 mrna表達水平高于正常值10倍以上 (tishler,et al.)，致癇灶周圍組織細胞的p-gp表達是鄰近組織的1.32.0倍(kannan p,et al)。 在癲癇患

12、者的研究中，abcb1 c3435t多態性與耐藥可能存在一定的聯系(hung cc,et al.)，影響部分aeds血藥濃度，如攜帶cc基因型者pht的血藥濃度最低(kannan p,et al)，cc基因型患者腦脊液pb濃度低于ct和tt基因型(basic,et al.)。但也有研究但也有研究報道報道abcb1 abcb1 c3435tc3435t多態性、多態性、p-gpp-gp表達與癲癇耐藥之表達與癲癇耐藥之間無相關性間無相關性(tan nc,et al)(tan nc,et al)。 癲癇耐藥癲癇耐藥aeds透過透過bbbp-gp表達或表達或/和功能和功能abcb1 snps影響？影響？

13、影響？影響？ 3 3、p-gpp-gp實驗研究實驗研究 研究方法研究方法 研究對象研究對象 本研究根據病例選擇及排除標準，收集癲癇患者187例，按照耐藥標準分為耐藥組100例，敏感組87例。(1(1、漯河市第二人民醫院；、漯河市第二人民醫院；2 2、寧夏農、寧夏農村癲癇示范項目村癲癇示范項目) ) 樣本采集樣本采集 上午空腹采集靜脈血5 ml，置于edta抗凝管中，常溫下以3000 r/min離心15 min，分離血清及有形成分；行腰椎穿刺術留取患者腦脊液2 ml；收集的血清和腦脊液樣本保存在-80冰箱中備用。 p-gpp-gp檢測檢測 血清及腦脊液中p-gp濃度采用elisa測定，測定步驟嚴

14、格按照說明進行。 abcb1abcb1 c3435t c3435t分型分型 應用聚合酶鏈反應-限制性片段長度多態性(pcr-rflp)。上游引物：5-actcttgttttcagctg cttg-3；下游引物：5-agagacttacattaggcagtgactc-3。反應條件：94預變性5min，94變性30s，55退火20s，72延伸30s，循環35次，最后72延伸5min。每10l pcr擴增產物中加入限制性內切酶dpn0.5l，于37水浴過夜消化1416h，3.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測后確定abcb1 c3435t基因型。結果結果表表1 耐藥組與敏感組癲癇患者一般臨床資料比較耐藥組與敏感

15、組癲癇患者一般臨床資料比較變量變量耐藥組耐藥組(n=100)敏感組敏感組(n=87)2/tp值值性別性別(例例)男性男性56520.2710.603女性女性4435民族民族(例例)漢族漢族69590.0300.862回族回族3128年齡年齡(歲歲)37.3613.5637.7015.96-0.1580.875發病年齡發病年齡(歲歲)18.8914.1315.0612.02-0.7410.460病程病程(年年)20.3110.3118.8810.250.6310.529發作類型發作類型(例例)全面性發作全面性發作91732.1690.141部分性發作部分性發作813未分類發作未分類發作*11注：

16、*由于未分類發作類型的樣本量太少，統計時其與部分性發作類型合并。表表2 耐藥組和敏感組患者腦脊液、血清中耐藥組和敏感組患者腦脊液、血清中p-gp濃度，濃度， 以及二者濃度比值比較以及二者濃度比值比較組別組別 n 腦脊液中腦脊液中p-gp濃度濃度(ng/ml)血清中血清中p-gp濃度濃度(ng/ml)腦脊液與血清中腦脊液與血清中p-gp濃度比值濃度比值耐藥組耐藥組 10020.065.2630.658.400.760.24敏感組敏感組 8717.314.2028.726.080.640.18t 值值p值值2.7150.0081.8200.070 2.088 0.042野生純合型(cc)：163b

17、p和68bp兩條帶；突變型(tt)：231bp一條帶；雜合子型(ct)：231bp、163bp和68bp三條帶。a：dna marker；b：cc型；c，d：ct型；e：tt型。abcb1abcb1 c3435t c3435t電泳圖電泳圖目的基因條帶(231bp)電泳圖 a為marker；b：b及右側條帶均為pcr產物。表表3 abcb1基因基因c3435t不同基因型患者不同基因型患者p-gp濃度及比值比較濃度及比值比較基因型基因型 n 腦脊液中腦脊液中p-gp濃濃度度(ng/ml)血清中血清中p-gp濃度濃度(ng/ml)腦脊液與血清中腦脊液與血清中p-gp濃度比值濃度比值cc型型 5819

18、.604.1031.549.340.620.19ct型型 9218.895.4828.926.160.680.24tt型型 2816.463.5229.017.250.620.18f值值p值值3.3850.0252.3610.097 0.709 0.495 結論結論 癲癇患者腦脊液中p-gp的高表達與癲癇耐藥關系密切。耐藥性癲癇患者腦脊液中存在p-gp高表達，可能阻礙了aeds透過bbb，降低腦組織內的藥物濃度，導致癲癇耐藥的發生。 abcb1基因c3435t位點snps可影響癲癇患者腦脊液中p-gp水平，即攜帶cc基因型的癲癇患者p-gp高表達，發生癲癇耐藥的風險增加。臨床意義臨床意義 p-gp在癲癇耐藥中可能扮演著重要的作用，為耐藥性癲癇藥物治療提供重要的信息，如研發非p-gp