1、微生物菌群的分離純化、培養、鑒定及保藏食品1201班 第六組 陳帆、劉旸、榮躍、龍開友實驗目的和要求實驗原理實驗安排1、2、3、4、實驗材料和器材實驗方案內容實驗方案內容1 1 實驗目實驗目的及要求的及要求1.1 學習大腸菌群分離純化、鑒定的原理。學習大腸菌群分離純化、鑒定的原理。1.2 掌握平板表面涂布法、平板劃線法掌握平板表面涂布法、平板劃線法的分離技術。的分離技術。1.3 學習掌握菌種保藏的原理和方法。學習掌握菌種保藏的原理和方法。 2 2 實驗原理實驗原理 2.1 2.1 菌種菌種的分離純化的分離純化 從混雜微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物分離與純化。在分子生

2、物學的研究及應用中，不僅需要通過分離純化技術從混雜的天然微生物群中分離出特定的微生物，而且還必須隨時注意保持微生物純培養物的“純潔”，防止其他微生物的混入。 2.1.1 2.1.1 平板涂布法平板涂布法 因為將微生物懸液先加到較燙的培養基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會使一些嚴格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長，因此在微生物學研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。 用途：一般多用于從菌種的純化； 優點：可以觀察菌落特征，對混合菌進行分離； 缺點：不能計數 2.1.2 2.1.2 平板劃線法平板劃線法 最簡單的分離微生物的方法是平板劃線法，其原理是將微生物樣

3、品在固體培養基表面多次作“由點到線”稀釋而達到分離目的的。劃線的方法很多，常見的比較容易出現單個菌落的劃線方法有斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。 用途：一般多用于篩選菌株。一般用于平板培養基的回收率計數。 優點：可以計數，可以觀察菌落特征。 缺點：吸收量較少，較麻煩，平板不干燥效果不好，容易蔓延。如果菌液密度大的話，長不出單菌落。 2.2 2.2 大腸菌群的培養鑒定大腸菌群的培養鑒定 大腸菌群能在乳糖膽鹽液體培養液中生長，并且產氣產酸，使培養液變色。還能在伊紅美蘭固體培養上生長，形成黑紫色的菌落，有的還有金屬光澤。其他病原菌的菌落呈粉紅色。再做鏡檢觀察是無芽孢的革蘭氏陰性桿菌（呈紅色

4、）。即可鑒定是有大腸菌群的菌存在。 2.3 2.3 菌種菌種保藏保藏 菌種保藏是將微生物的菌種經長時間的保存，不污染其它雜菌，及可保持其形態特征和生理性狀，減少變異，防止衰老，以便于將來使用。 保藏菌種一般是選用它的休眠休，如孢子；芽孢等等，并且要創造一個低溫；干燥；缺氧；避光和缺少營養的環境條件，以利于休眠體能長期地處于休眠狀態。對于不產孢子的微生物，應使其新陳代謝處于最低狀態，又不會死亡，從而達到長期保存的目的。3.1 菌種 污水中的大腸菌群。3.2 培養基乳糖膽鹽液體培養基、伊紅美藍瓊脂（EMB）、營養瓊脂培養基。3.3 器材4根接種環、干燥器、冰箱、4個250mL錐形瓶、3支產氣管、1

5、7支試管、6套培養皿、14支無菌移液管(12支1mL管，2支10mL管)、電爐、雙目顯微鏡、恒溫培養箱、無菌操作臺、高壓滅菌鍋、恒溫干燥箱等。3.4 試劑革蘭氏一(草酸銨結晶紫)、革蘭氏二(路哥氏碘液) 、革蘭氏三（95%乙醇）、革蘭氏四（蕃紅）、醫用液體石臘（比重0.830.89）。3 3 實驗材料和器材實驗材料和器材 注： 1 乳糖膽鹽液體培養基：由蛋白胨、乳糖、溴甲酚紫和膽鹽組成，屬液態、鑒別、增值、半合成培養液，實驗中用于廢水中菌群的培養； 2 伊紅美藍瓊脂：含蛋白胨、乳糖、磷酸氫二鉀、伊紅-美藍和瓊脂。瓊脂平板用于分離純化腸道致病菌，特別是大腸菌群和糞大腸菌群； 3 營養瓊脂培養基：

6、含牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉和瓊脂。用于分離純化后的菌體培養。4 實驗方法和步驟實驗方法和步驟 4.1 實驗安排實驗安排 4.1.1 實驗準備 4.1.2 采樣、恒溫培養富集及初篩； 4.1.3 觀察產氣情況及稀釋、倒培養基、劃線、涂布、倒置培養； 4.1.4 鑒定、接種； 4.1.5 菌種保藏。4.2 具體操作步驟 4.2.1 實驗準備4.2.1.1 配置培養基(伊紅美蘭瓊脂培養基：7.4g+200mL無菌水、調pH7.27.4，營養瓊脂培養基：6.6g+200mL無菌水、調pH7.40.2,0.85%生理鹽水、乳糖膽鹽液體培養基2.6g+100mL無菌水，調pH7.40.2),，裝瓶，高壓蒸汽

7、滅菌。4.2.1.2 包扎好培養皿，移液管，試管，進行干熱滅菌。4.2.1.3 將配好的乳糖膽鹽液體培養基分裝入三個試管中，每個大約十毫升，包扎，滅菌。4.2.1.4 液體石蠟和涂布棒等其他實驗玻璃器進行滅菌。 4.2.2 采樣、培養 取水，湖水，廢水三樣約23滴于3支已滅菌的乳糖膽鹽液體培養基試管中，貼好標簽（采樣時間、人物、溫度，采樣地點及天氣情況），塞好棉塞，于恒溫箱（37）培養1824小時 4.2.3 觀察產氣情況、稀釋觀察產氣情況、稀釋 4.2.3.1 觀察產氣管有無氣柱，標記陽性管數。 4.3.2.2 樣品稀釋：對已滅菌的5只試管編號（分別為1、2、3、4、5號），從樣液試管取1m

8、L樣品液放入盛有9mL生理鹽水的試管中為1號試管，換一只移液管，按上述方法依次配置5份10倍系列稀釋液。貼明標簽。 4.2.4 劃線、涂布劃線、涂布 4.2.4.1 涂布涂布平板法平板法：將已熔化的營養瓊脂培養基倒入無菌平皿，制成無菌平板，冷卻凝固后，將一定量的含大腸菌群的污水滴加在平板表面，再用無菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個平板表面，置培養箱中37培養24小時。經培養后挑取單個菌落。 涂布平板法操作：1、將涂布器浸在盛有酒精的燒杯中；2、取少量菌液（不超過0.1ml），滴加到培養基表面；3、將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃盡后，冷卻810s；4、用涂布器將菌液均勻地涂布在培養基

9、表面。涂布時可轉動培養皿，使涂布均勻。 （注意： 1、將涂布器末端浸在盛有體積分數為70%的酒精的燒杯中。取出時，要讓多余的酒精在燒杯中滴盡，然后將沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃。 2、操作中一定要注意防火！不要將過熱的涂布器放在盛放酒精的燒杯中，以免引燃其中的酒精。）4.2.4.2 平板劃線平板劃線法法：經培養后挑取單個菌落，接種環以無菌操作沾取少許菌落，在無菌伊紅美蘭瓊脂培養基平板表面進行連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，并逐步分散開來，如果如果劃線適宜的話，劃線適宜的話，微生物能一一分散。微生物能一一分散。在37經培養24小時后，可在平板表面得到單菌落。（有時這種單菌

10、落并非都由單個細胞繁殖而來的，故必須反復分離多次才可得到純種。） 平板劃線操作：1、將接種環放在火焰上灼燒，直到接種環燒紅；2、在火焰旁冷卻接種環，并打開盛有菌液的試管的棉塞；3、將試管口通過火焰；4、將已冷卻的接種環伸入菌液中，沾取一環菌液；5、將試管口通過火焰，并塞上棉塞；6、左手將皿蓋打開一條縫隙，右手將沾有菌種的接種環迅速伸入平板內，劃三至五條平行線，蓋上皿蓋。注意不要劃破培養基。7、灼燒接種環，待其冷卻后，從第一區域劃線的末端開始往第二區域內劃線。重復以上操作，在三區域內劃線。注意不要將最后一區域的劃線與第一區相連。8、將平板倒置，放入培養箱中培養。 4.2.5 鑒定鑒定 4.2.5

11、.1 鑒定 觀察EMB平板，菌落呈紫黑色，具有或略有金屬光澤，或者呈淡紫紅色，僅中心顏色較深，選取符合上述特征的單個菌落進行革蘭氏染色，鏡檢（油鏡）觀察是否為無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌。 4.2.5.2 培養 a 將菌落轉入裝有玻璃珠的滅菌錐形瓶中調節酸堿度為7，充分搖勻備用。 b 液體發酵：取處理好的樣品液1mL加入滅菌的乳糖膽鹽液體培養基中。搖勻后置培養箱中37培養24小時 4.2.6 菌種保藏菌種保藏 4.2.6.1 斜面低溫保藏法： 此法為最常用的一種。一般霉菌；放線菌和有芽孢的細菌可保存24個月，酵母菌可保存2個月，無芽孢的細菌最好每周移接一次。操作過程如下： a 接種：將要保藏的菌種

12、接入斜面培養基上，試管上貼好標簽，寫上菌種名稱，時間。 b 培養：各類菌按其所需溫度和時間進行培養。 c 保藏：選取生長健壯的菌種，于其試管帶棉塞的上半部用滅菌的塑料包扎好，以防棉塞受潮感染雜菌。置于4冰箱中保藏。 4.2.6.2 液體石臘保藏法： 此法可用不分解石臘的菌種保藏。保存時間是半年至一年。放線菌；霉菌和產芽孢菌可保藏二年。液體石臘可防止培養基水分的蒸發，而引起的菌種死亡。同時可阻止氧氣進入，防止好氧菌的生長。從而延長菌種保藏的時間。但需注意的是試管必須直立放置，并且不便攜帶。操作過程如下： a 液體石臘的滅菌：將液體石臘裝入錐形瓶中，量不超出錐形瓶體積的1/3，塞上棉塞，包扎好后，進行高壓蒸汽滅菌二次（12030分鐘）。再在110120干燥箱中蒸發掉蒸汽滅菌時帶入的水分。此時石臘透明清亮狀。經檢驗確定無菌后備用。 b 菌種培養：將所需的菌種經培養后，選取健狀的保藏。 c 加石臘油：用無菌管吸取石臘油加入菌種試管中，以高出菌種斜面頂點1cm為宜。少了會因培養基露出油面，而使培養基變干造成菌死亡。 d 收藏：試管上部用塑料包扎好，垂直立于冰箱中4。