1、文件名稱無菌檢驗標準操作規程文件編號cbs03-j7-a08起草人起草日期年月日審核人審核日期年月日批準人批準h期年月fi執行日期年月日頒發部門質量控制部印數3分發部門總 辦質 保質控生 技提取固 體物 料設 備供 銷辦公針劑安 全工會財 務后勤分發數量111000000000000目的建立無菌檢驗標準操作規程，保證檢驗人員操作規范化、標準化，確保企業產品質量。范圍本標準規定了無菌檢驗方法。責任質量控希0部化驗員。內容1標準依據：中華人民共和國藥典( 2000年版 第二部)。2說明無菌檢查法系指檢查藥品是否無菌的一種方法。3實驗準備3.1試劑與溶液75%乙醇、無菌0.9%氯化鈉溶液、新潔爾滅(

2、1/1000)溶液、35%甲酚溶液或 適宜的消毒溶液。3.2儀器與用具電熱干燥箱、恒溫培養箱、刻度吸管、試管、凈化工作臺。3.3培養基與菌種3.3.1硫乙醇酸鹽流體培養基、真菌瓊脂培養基、真菌培養基。3.3.2 藤黃微球菌cmcc(b)28 001 生抱梭菌cmcc (b) 64 941、白色念 珠菌icmcc (f) 98 001、金黃色葡萄球菌lcmcc (b) 26003。4 操作方法4.1無菌室的無菌程度檢杳4.1.1無菌宗在消毒處理后，無菌試驗前及操作過程中需檢查空氣中菌落數。取直徑約90mm雙碟，在接種室內點燃酒精燈，在酒精燈旁，以無菌操作，將 雙碟半開注入溶化的營養瓊脂培養基約2

3、0ml,制成平板，在30-35°c預培養48小時, 證明無菌后將平板3個，以無菌方式帶入無菌操作室內的潔凈區左、中、右各放1 個；打開碟蓋扣置，平板在空氣中暴露30分鐘后將碟蓋蓋好，置30-35°c培養48小 時，取出檢查，100級清潔度要求：3個平板上生長的菌落數平均不得超過1個。4.4.2儀器準備實驗所用的玻璃器皿 試管、量筒、三角瓶、移液管、刻度吸管(1、5、10ml)、 注射器(2、5、10)、雙碟等，用清潔液浸泡，水洗3次。晾干后，用牛皮紙包扎嚴 密，置于電熱干燥箱屮160°c干熱滅菌2小時或140°c干熱滅菌4小時。4.4.3培養基靈敏度檢查

4、4.4.3.1 菌種4.4.3藤黃微球菌(cmcc(b) 28 0014.4.3.1.2 生孑包梭菌cmcc (b) 64 941j4.4.3.3 白色念珠菌cmcc (f) 98 0014.4.3.2 操作4.4.3.2.1需氣菌、厭氣菌培養基用藤黃微球菌和生砲梭菌兩種菌檢查。取藤黃微球菌的營養瓊脂斜而新鮮培養物，加無菌0.9%氯化鈉溶液3ml,制成均 勻的菌懸液，再以無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋至與細菌濁度標準管相同的濃度，然后 作10倍系列稀釋，制成lml中含10-100個菌(cfu)并計數。取生抱梭菌的需氣菌、厭氣菌培養基的新鮮培養物，用滅菌毛細管將其吸至滅菌 離心管內，離心，棄去上清液

5、，取沉淀菌體用無菌0.9%氯化鈉溶液制成均勻菌懸液, 吸取上述菌懸液，用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋，照上述方法制成lml含10100個菌 并計數。4.2.3.2.2真菌培養基用白色念珠菌檢查取口色念珠菌的真菌瓊脂斜面新鮮培養物，加無菌0.9%氯化鈉溶液3ml,制戍均 勻的菌懸液，照藤黃微球菌項下方法稀釋制成lml屮含10-100個菌并計數。42323取藤黃微球菌的營養肉湯，生抱梭菌的需氣菌厭氣菌培養基的新鮮培 養物，白色念珠菌的真菌培養基的新鮮培養物各lml,用無菌0.9%氯化鈉溶液作10 倍系列稀釋，制成lml屮含10-100個菌并計數。4.23.2.4將藤黃微球菌的上述z的稀釋液各lml,

6、分別接種至每管裝量為9ml 的需氣菌、厭氣菌培養基3管，生抱梭菌的上述z的稀釋液各lml,分別接種至每 管裝量為12ml的需氣菌、厭氣菌培養基3管，曲白色念珠菌的上述之一的稀釋液各 lml,接種至每管裝量為9ml的真菌培養基3管，以未接種的培養基作對照，按規定 的溫度培養5天，并逐日記錄結果。4.4.3.3結果判定以每株菌接種后的培養基不得少于2管呈現生長，即該培養基的靈敏度檢查符合 要求。4.4.4對照用菌液的制備4.4.4.1金黃色葡萄球菌菌液 用接種環取金黃色葡萄球菌的營養瓊脂斜面新 鮮培養物少許，接種至需氣菌、厭氣菌培養基內，在30-35°c培養16-18小時，用無 菌0.9

7、%氯化鈉溶液稀釋制成每1ml屮含10100個菌。4.4.4.2生砲梭菌菌液用接種環取生砲梭菌的需氣菌、厭氣菌培養基新鮮培養 物少許，接種至相同的培養基內，在30-35°c培養1824小時，用無菌0.9%氯化鈉溶 液稀釋制成每lml中含10-100個菌。4.4.4.3白色念珠菌菌液 用接種環取白色念菌的真菌瓊脂培養基斜面培養物 少許，接種至真菌培養基內，在20-25°c培養24小時，用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋 制成每lml中含10-100個菌。4.4.4.4上述制備的菌液，一般當口使用。4.4.5抑細菌和抑真菌試驗取每管裝量為9nil的需氣菌、厭氣菌培養基4管及真菌培養基2

8、管，分別接種金 黃色葡萄球菌、生抱梭菌、白色念珠菌10j00個菌各兩管，其屮1管加供試品規定 量，按規定的溫度培養35 口，如培養基各管24小時內微生物生長良好，則供試品 無抑菌作用。如加供試品的培養基管與未加供試品的培養基管對照比校，微生物生長 微弱、緩慢或不生長，均判斷為供試晶有抑菌作用于。該供試品需用稀釋法或屮和法、 薄膜過濾法處理，消除供試品的抑菌性厲，方可接種至培養基。4.4.6直接接種法4.4.6.1供試品制備用滅菌銀取出注射黠，在火焰旁將針芯插入針管并安上針頭，供試品瓶蓋和注射 器針頭均應迅速通過火焰數次，以無菌操作吸取供試品一定量，接種于上述培養基中。4.4.6.2 操作用注射

9、器吸取供試品，沿培養基管壁分別接種于需氣菌、厭氣菌培養基6管，（其 中1管丁操作結束后移至接種室接種金黃色葡萄球菌對照菌液lml）,真菌培養基5 管。輕輕搖動使勻。需氣菌、厭氣菌培養基在30-35°c培養，真菌培養基在20-25°c 培養7日，培養期間應逐日檢查是否有菌生長邙h性對照在24小時內應有菌生長）, 并填寫檢查記錄表。如在加入供試品后，培養基出現渾濁，培養7日后，不能從外觀 上判斷無微生物生長，可取該培養液適量接種于同種新鮮培養基中或斜面上，繼續培 養，細菌培養2日，真菌培養3日，觀察是否再現渾濁或斜面上有無菌落生長，在接 種的同時，取培養液少量，涂片制成染色標木，用顯微鏡觀察是否有菌生長。4.4.7結果判斷當陽性對照管顯渾濁并確有細菌生長時，可根據觀察所得的結果判泄。如需氣菌、厭氣菌及霉菌培養管均為澄清或