1、病毒感染的實驗診斷病毒感染的實驗診斷 張德純 教授臨床微生物教研室 病毒（virus）是結(jié)構(gòu)最簡單、體積最小的微生物。病毒感染十分常見，約70%80%的傳染病由病毒感染所引起。迄今已證實500多種病毒對人有致病性，其中不少病毒危害極大，如最近流行的sars病毒。因此盡快獲得病毒的實驗診斷，對控制病毒的傳播、疾病的診斷和防治具有重要的意義。 病毒性疾病實驗診斷的一般原則：特異、敏感、快速和簡便。首先根據(jù)流行病學(xué)和臨床特點，初步判斷可能感染的病毒；然后根據(jù)可疑病毒生物學(xué)特點、機(jī)體免疫應(yīng)答和臨床過程，以及病人當(dāng)前所處的時機(jī)，確定實驗診斷的方法。目前病毒感染的檢查主要依靠經(jīng)典的方法和近來發(fā)展起來的分子

2、生物學(xué)等方法。前者主要包括病毒分離培養(yǎng)、鑒定及血清學(xué)實驗；后者主要是核酸雜交與pcr及現(xiàn)代免疫學(xué)技術(shù)。病毒學(xué)檢驗 病毒分離培養(yǎng) 病原學(xué)診斷 形態(tài)學(xué)檢測 分子生物學(xué)技術(shù)病毒核酸 補(bǔ)體結(jié)合試驗 中和試驗血清學(xué)診斷 血凝抑制試驗 間接免疫熒光檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗 一、標(biāo)本采集與運送一、標(biāo)本采集與運送（一）標(biāo)本的采集 要從臨床標(biāo)本中成功地分離出病毒，很大程度上取決于標(biāo)本的恰當(dāng)采樣和處理，為了保證標(biāo)本質(zhì)量，應(yīng)注意以下問題： 1采樣時間 盡可能在發(fā)病的初期，急性期或患者入院的當(dāng)天進(jìn)行，越早越好，最好在治療之前。疾病后期體內(nèi)產(chǎn)生免疫力，病毒量減少或消失。 2標(biāo)本種類的選擇 根據(jù)臨床感染的癥狀及流行病學(xué)資料

3、，判斷可能感染病毒的種類，選擇相應(yīng)部位采取標(biāo)本，處理標(biāo)本時要考慮病毒的生物學(xué)特性。常見分離病毒標(biāo)本的選擇見教材p64表4-2。（1） 心臟疾病（2） 中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染（3） 先天或新生兒感染（4） 胃腸道疾病（5） 呼吸道感染 3常見標(biāo)本的采集方法（1） 血液：以無菌手續(xù)抽取抗凝血10ml， 抗凝劑可選用100u/ml肝素鈉。為了血清學(xué)檢查的需要，應(yīng)抽取另一管5ml血液，不抗凝送檢。 （2） 腦脊液：以無菌手續(xù)抽取腦脊液12ml，置無菌試管內(nèi)，在冰浴中立 即送檢。4可存放72h。 （3）宮頸或陰道拭子 采取病灶部位分泌物，將拭子置運送液中；如無病損部位，則清理宮頸口粘液，將拭子伸入宮頸約1cm

4、停留5秒以上取出，置運送液中4冰浴立即送檢。 （4） 糞便標(biāo)本 取24g糞便標(biāo)本在無菌的容器中，加810ml運送液立即送檢。（5） 含漱液 可用無菌生理鹽水，讓患者含漱幾次取得，與運送液等量混合。 （6） 喉拭子：用生理鹽水濕潤的拭子采 取咽喉部表面，置運送液中，注意 避免唾液污染。（7）尿道拭子及尿液標(biāo)本：尿道拭子伸 入尿道4cm輕輕轉(zhuǎn)動23次，以獲 得較多的上皮細(xì)胞，取出后置運送 液中。（8）尸檢標(biāo)本：應(yīng)在死亡后盡早采取， 采集各種器官時要分開使用器械和 容器。 （二）標(biāo)本的運送和保存 標(biāo)本采集后注意無菌、冷凍、保濕、立即送檢。 分離培養(yǎng)病毒的標(biāo)本要盡快送到實驗室處理和接種。如不能及時送檢

5、，可在4冷藏數(shù)小時，如需較長時間保存則應(yīng)置-70。放置在-20，病毒容易滅活，凍存液中需加入甘油或二甲亞砜等作保護(hù)，避免反復(fù)凍融使病毒滅活。 為了抑制細(xì)菌生長通常在病毒傳送培養(yǎng)基（vtm）中加入抗生素如青霉素100u/l和鏈霉素100g/ml，為了抑制真菌的生長加入2.5g/ml二性霉素b或40g/ml制霉菌素。 二、病毒的分離與鑒定二、病毒的分離與鑒定（一）病毒分離和鑒定的一般程序 見書p66圖4-1（二）病毒的分離 病毒是專性細(xì)胞寄生，需要在活細(xì)胞或動物體內(nèi)才能得到分離。選擇何種動物或細(xì)胞來分離，應(yīng)根據(jù)臨床感染的癥狀和流行病學(xué)資料，推測可能的病毒種類，選擇相對敏感的動物和細(xì)胞來分離標(biāo)本中的

6、病毒。 1.組織培養(yǎng)（1） 概念 將人或動物離體的活組織或分散的活細(xì)胞，在實驗室的試管或培養(yǎng)基中，模擬體內(nèi)的生理條件使之生存和生長，稱之為組織培養(yǎng)。（2） 組織培養(yǎng)的類型 a 器官培養(yǎng)：如氣管、腸段。器官保存了原功 能，用于分離某些有器官特異性的病毒。 b 組織塊培養(yǎng)：如肝組織塊培養(yǎng)肝炎病毒。 c 細(xì)胞培養(yǎng)（單層細(xì)胞培養(yǎng)）：現(xiàn)廣泛使用的 組織培養(yǎng)技術(shù)。 （3）細(xì)胞培養(yǎng)的種類和方法 根據(jù)細(xì)胞的來源、染色體特性和傳代次數(shù)的不同可分為三類： 1 原代和次代細(xì)胞培養(yǎng) 離體的新鮮組織或器官，機(jī)械處理 胰蛋白 洗滌 吹打酶消化 加入營養(yǎng)液 單個細(xì)胞懸液 1-3次 細(xì)胞計數(shù) 、調(diào)整細(xì)胞濃度 分裝在培養(yǎng) 生長

7、 瓶內(nèi)培養(yǎng) 形成單層細(xì)胞，稱為原代細(xì)胞培養(yǎng) 胰酶消化 轉(zhuǎn)種新的培養(yǎng)瓶 形成單層 細(xì)胞，稱為次代細(xì)胞培養(yǎng) 2 二倍體細(xì)胞株 原代細(xì)胞多次連續(xù)傳代后仍保持二倍體染色體特性（即含23對染色體），稱之為二倍體細(xì)胞。傳代細(xì)胞壽命一般為4050代，大多數(shù)為成纖維細(xì)胞,如人胚肺細(xì)胞。廣泛用于病毒分離和疫苗制備。 3傳代細(xì)胞系 來源于腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞株傳代過程的變異細(xì)胞。細(xì)胞增殖特征和染色體均類似于腫瘤細(xì)胞。不宜用于疫苗的制備，常用于病毒的分離和鑒定。 （4）組織培養(yǎng)的特點 優(yōu)點：a來源廣；b不受機(jī)體免疫因素影響，個體差異小，敏感范圍廣；c易于觀察病變；d可用于病毒的分離、鑒定、疫苗的制備；e易管理，相對比較經(jīng)

8、濟(jì)。 缺點：條件要求高，必須要有細(xì)胞培養(yǎng)的條件。 2. 雞胚接種 雞胚是用于分離粘病毒科、皰疹病毒、痘類病毒的較為理想的材料。 （1） 常用接種部位和用途 38-39 新鮮受精卵 5-13天 卵黃囊接種羊水腔接種 尿囊腔接種 絨毛尿囊膜接種 卵殼氣室尿囊絨毛尿囊膜卵黃囊卵白羊膜羊水囊 卵黃囊接種：用于流行性腦炎病毒分 離 羊水腔接種：用于流感病毒、副流感 病毒的初次分離 尿囊腔接種：用于流感病毒、腺病毒、 腮腺炎病毒分離 絨毛尿囊膜接種：用于痘病毒、皰疹 病毒分離 （2） 雞胚接種的特點 優(yōu)點：a.雞胚是一個整體，可有多種 接種途徑； b.可收獲大量病毒； c.雞胚本是無菌無病毒的，對 接種病

9、毒不產(chǎn)生抗體； d.來源廣，操作簡便。 缺點: a.易感病毒較少，應(yīng)用較局限； b.反復(fù)用雞胚傳代，病毒毒力 可下降。 3. 動物接種 （1） 常用動物：小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、 猴等（2） 接種途徑： 呼吸道病毒，如流感病毒，滴鼻接種3周齡新生小鼠腸道病毒，如柯薩奇病毒，腹腔接種乳鼠（一日齡）乙肝病毒，靜脈注射猩猩嗜神經(jīng)病毒，如乙腦病毒（用3周齡小鼠）、狂犬病毒（用家兔），顱內(nèi)接種 （3） 接種后觀察應(yīng)每日至少兩次，必要時 每隔24小時觀察一次。根據(jù)實驗?zāi)?的的不同，觀察不同的反應(yīng)情況。（4） 動物接種特點 優(yōu)點：a.可以按照不同途徑分離鑒定 病毒，可模擬人類感染途徑 b.可用于疫苗的篩選、

10、制備 c.可用于制備抗血清 d.操作簡便，對環(huán)境要求低 缺點：a.可自然帶毒或隱性感染，影響 結(jié)果的觀察 b.存在個體差異 c.敏感病毒較少，或有些病毒感 染后不出現(xiàn)明顯癥狀，不宜觀 察 d.不經(jīng)濟(jì)，難管理（三）病毒的鑒定 1.初步鑒定 根據(jù)臨床癥狀、流行病學(xué)特點、標(biāo)本來源、易感動物范圍、細(xì)胞病變特征及生物學(xué)特性、理化性質(zhì)，可初步確定病毒屬于何科何屬。（1） 動物感染范圍及潛伏期 病毒感染動物的范圍、發(fā)病的潛伏期有差異。如柯薩奇b組病毒對新生乳鼠致病，對成年小鼠不致病；小鼠腦內(nèi)接種乙腦病毒，潛伏期一般為4天，少于4天發(fā)病則可能為非乙腦病毒引起。（2）對雞胚的敏感性 不同病毒對雞胚不同接種途徑敏

11、感性不同。 直接法：如觀察絨毛尿囊膜是否有病灶 間接法：尿囊液、羊水做血凝抑制試驗等 （3） 病毒在細(xì)胞培養(yǎng)中的表現(xiàn) 細(xì)胞代謝類型改變：細(xì)胞代謝產(chǎn)酸可 導(dǎo)致培養(yǎng)液ph指示劑呈黃色，病毒 增殖抑制了細(xì)胞代謝，使培養(yǎng)液不變 色或變紅。但腺病毒不抑制細(xì)胞代謝， 反而促進(jìn)糖酵解增加產(chǎn)酸。 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 由病毒增殖所引起的細(xì)胞變化稱為 細(xì)胞病變效應(yīng)(cytopathic effect cpe)。 a. 細(xì)胞溶解，細(xì)胞培養(yǎng)瓶中出現(xiàn)空斑, 如腸道病毒； b. 細(xì)胞融合形成多核巨細(xì)胞，如皰疹病 毒；c .細(xì)胞腫大，變圓堆積成葡萄狀，如腺 病毒；d .胞漿內(nèi)或核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性包涵體，如 狂犬病毒：e .不出現(xiàn)細(xì)

12、胞病變現(xiàn)象。 空斑或蝕斑（plaque）形成試驗 空斑是指在單層細(xì)胞中被病毒感染引起死亡的細(xì)胞區(qū)域，周圍被活細(xì)胞包圍。一般而言，一個空斑是由一個感染性病毒顆粒感染所引起。不同的病毒引起的空斑形態(tài)和大小不同。可進(jìn)行病毒顆粒的計數(shù)、純化，結(jié)合中和試驗可進(jìn)行病毒的鑒定。 干擾現(xiàn)象 一種病毒感染細(xì)胞后，可以干擾以后進(jìn)入的病毒的增殖。利用此現(xiàn)象鑒定不引起形態(tài)學(xué)變化的病毒。如某些型別的鼻病毒能干擾以后進(jìn)入的副流感型病毒的增殖，從而阻抑后者的紅細(xì)胞吸附作用。 紅細(xì)胞吸附及吸附抑制試驗 紅細(xì)胞吸附現(xiàn)象的產(chǎn)生是由于病毒在細(xì)胞膜成熟時，將其血凝素插入細(xì)胞膜，使感染細(xì)胞吸附紅細(xì)胞，是病毒增殖的指標(biāo)。該現(xiàn)象可被相應(yīng)的

13、病毒特異性抗體所抑制，稱為紅細(xì)胞吸附抑制試驗，可用來鑒定病毒。 （4） 理化性質(zhì)的測定 病毒的大小和形態(tài)：可用電鏡觀察病毒的大小和形態(tài)。 核酸類型鑒別及序列測定：利用5-溴-2-脫氧尿苷（budr）抑制dna復(fù)制的特性，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入該物質(zhì)，可抑制dna病毒的復(fù)制和增殖，抑制細(xì)胞病變的出現(xiàn)，但對rna病毒無抑制作用，以此判斷病毒核酸類型。也可對病毒特異序列或全序列的堿基排列測定或dna雜交、dna-rna雜交來鑒定病毒。 耐酸試驗 腸道病毒對酸有耐受力，而鼻病毒在酸性環(huán)境下易被滅活。 乙醚敏感試驗 病毒外周如有類脂包膜，則易被乙醚破壞，而失去感染性，不能感染細(xì)胞。可作為病毒是否具有類脂包膜

14、的依據(jù)，也可用氯仿或去膽酸鈉代替乙醚進(jìn)行試驗。 2 最后鑒定血清學(xué)試驗 在初步鑒定的基礎(chǔ)上，對已分離出陽性結(jié)果需選擇適當(dāng)?shù)难鍖W(xué)方法對病毒分離株作最后鑒定。血清學(xué)方法鑒定是將分離到的病毒和已知病毒的參考血清作中和試驗、補(bǔ)體結(jié)合試驗、血凝抑制試驗等。由于分子病毒學(xué)的發(fā)展，病毒的最后鑒定還應(yīng)包括分子生物學(xué)方法的鑒定，它還能檢出不產(chǎn)生細(xì)胞病變的那些病毒。 （1） 中和試驗 是將病毒與特異性抗體進(jìn)行免疫反應(yīng)，使病毒失去感染性，在細(xì)胞培養(yǎng)和活的機(jī)體內(nèi)不出現(xiàn)病變的試驗。常用細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行中和試驗。方方 法：法：固定病毒（100tcid50），稀釋血清，測ab效價。兩次效價相差4倍以上有診斷意義。 tcid5

15、0：50%組織細(xì)胞感染的病毒劑量(50%tissue cell infective dose tcid50)。 固定血清（1：20或1：40），稀釋病毒，求中和指數(shù)。 中和指數(shù)50為陽性，有意義； 中和指數(shù)9為陰性，無意義； 中和指數(shù)1049，為可凝。 中和試驗較復(fù)雜和費時，多用于v的鑒定和流行病學(xué)調(diào)查，對臨床診斷價值不大。（2）血凝與血凝抑制試驗 某些病毒可與一定種類的哺乳動物或禽類的紅細(xì)胞產(chǎn)生血凝現(xiàn)象。加入相應(yīng)的血凝素抗體可抑制血凝現(xiàn)象的發(fā)生，稱為血凝抑制試驗。可作為病毒型別鑒定的依據(jù)。（3）補(bǔ)體結(jié)合試驗 三、病毒感染的快速診斷三、病毒感染的快速診斷（一）、病毒的形態(tài)學(xué)檢查1. 光學(xué)顯微鏡

16、 可以觀察到大型的病毒如痘病毒類。在光學(xué)顯微鏡下還可以觀察到病毒感染的宿主細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)嗜酸性的包涵體（inclusion body）。根據(jù)包涵體的特點，可以作出輔助診斷。包涵體可能是病毒增殖的場所或病毒顆粒的聚合體，也可能是宿主細(xì)胞對病毒作用的反應(yīng)產(chǎn)物，一般來說，產(chǎn)生核內(nèi)包涵體的是在細(xì)胞核內(nèi)裝配的病毒（通常為dna病毒），產(chǎn)生胞質(zhì)內(nèi)包涵體的是在胞質(zhì)中裝配病毒（通常為rna病毒）。 2. 電子顯微鏡檢查 （1）電鏡直接檢查：某些病毒感染的早期在臨床標(biāo)本中就可出現(xiàn)病毒顆粒。經(jīng)粗提濃縮后用磷鎢酸鹽負(fù)染，電鏡下直接觀察，可發(fā)現(xiàn)病毒顆粒，獲得診斷。 （2）免疫電鏡檢查：在含病毒的標(biāo)本中，加

17、入特異抗體。經(jīng)抗原抗體反應(yīng)后，使標(biāo)本中的病毒顆粒聚集成塊，再經(jīng)負(fù)染觀察，比直接電鏡檢查更易發(fā)現(xiàn)病毒體，靈敏度可提高100倍。（二）、病毒抗原檢查 病毒抗原是病毒特異性的標(biāo)志，通過免疫學(xué)技術(shù)檢測標(biāo)本中的特異性抗原存在，可以早期診斷病毒感染。用于病毒抗原檢查的抗體，最好是單克隆抗體。 1. 免疫熒光技術(shù) 有直接和間接熒光法。具有快速、實用的優(yōu)點。適合于病毒型別少，細(xì)胞培養(yǎng)難以成功的病毒。間接熒光技術(shù)具有放大作用，因而靈敏度比直接法高。免疫熒光技術(shù)易出現(xiàn)非特異性熒光，導(dǎo)致假陽性，需要嚴(yán)格對照和排除試驗。 2. 酶免疫技術(shù) 有酶免組化和酶免吸附試驗法。酶免組化法與免疫熒光技術(shù)相同，不同的是將熒光標(biāo)記改

18、為酶標(biāo)記。由于酶反應(yīng)的產(chǎn)物具有累積性，因而靈敏度比熒光技術(shù)高。 3. 其它技術(shù) 如固相放射免疫技術(shù)、發(fā)光免疫分析技術(shù)、膠體金標(biāo)記的免疫層析技術(shù)等。 （四）、病毒核酸檢測 1. 斑點雜交法(dot blot hybridization)： 將待測的dna或rna直接點在雜交濾膜上,變性后,用標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交。（三）、早期抗體檢測 檢測病毒感染機(jī)體后產(chǎn)生的早期特異性抗體。 2. 固相雜交技術(shù) 將核酸探針進(jìn)行修飾后，包被強(qiáng)力吸附的聚苯乙烯微孔板中，加入待測的核酸序列和標(biāo)記的指示探針在微孔板的雜交液中，進(jìn)行雜交，洗滌后，用酶免疫技術(shù)進(jìn)行檢測。或?qū)⒑怂崽结槹挥谖⑿〈胖楸砻妫瑧腋∮陔s交液中。與待測

19、的核酸序列及標(biāo)記的指示探針進(jìn)行雜交。用磁分離技術(shù)分離結(jié)合有雜交體的磁體，進(jìn)行檢測。 3 . 原 位 分 子 雜 交 技 術(shù) （ i n s i t u hybridization） 是核酸雜交技術(shù)結(jié)合細(xì)胞學(xué)技術(shù)的一種特殊檢測技術(shù)。通過將細(xì)胞固定后，在不破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的前提下，在細(xì)胞原位釋放暴露dna或rna，加入標(biāo)記的特異核酸探針，進(jìn)行雜交。通過顯色技術(shù)，可以顯示特定的雜交探針在細(xì)胞內(nèi)的位置和核酸的數(shù)量。直接觀察待測核酸在細(xì)胞內(nèi)的分布狀態(tài)與細(xì)胞染色體的關(guān)系。 4. southern印跡法和northern印跡法： southern印跡法用于dna的雜交。將dna提取后，直接或經(jīng)限制性內(nèi)切酶切割后

20、，在瓊脂糖電泳中使dna按分子量大小分開，然后將瓊脂糖凝膠中的dna移至硝酸纖維膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。可以檢測病毒dna中的特異序列。 northern印跡法用于rna的雜交分析。利用rna與dbm(diagobenloxymethyl)結(jié)合的特點，將瓊脂糖電泳后的rna移至dbm膜上，用標(biāo)記探針進(jìn)行雜交。rna也可轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上進(jìn)行雜交分析。用于檢測rna或mrna。 5.聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction pcr)： 選擇病毒的特異、保守片段作為靶基因，進(jìn)行引物設(shè)計和擴(kuò)增，可診斷病毒性感染。選擇病毒的易變區(qū)，結(jié)合rflp，測序等技術(shù)可以對病毒進(jìn)行分析和

21、突變的研究。 （1） dna病毒：可直接進(jìn)行pcr擴(kuò)增其特異片段。（2） rna病毒：可通過rt-pcr技術(shù)，將rna逆轉(zhuǎn)錄為cdna，再進(jìn)行pcr擴(kuò)增，常結(jié)合巢式pcr(nest-pcr)技術(shù)進(jìn)行二次擴(kuò)增，提高了反應(yīng)的靈敏度和特異性。（3） 定量pcr技術(shù)：pcr技術(shù)是以指數(shù)方式對靶基因進(jìn)行擴(kuò)增。采用內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)對擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行原始標(biāo)本定量，對病毒感染的診斷起到了量化的作用。同時，對研究病毒和機(jī)體之間的關(guān)系提供了參考。 6. 病毒核酸的直接檢測 有些病毒如輪狀病毒的核酸具有典型的分節(jié)段特點。可以從標(biāo)本中直接提取輪狀病毒的核酸。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（page），觀察其特有的11個核酸節(jié)段的條帶排列情況，進(jìn)行診斷。 （五）、 病毒檢驗的結(jié)果評價 通過實驗手段，從標(biāo)本中獲得有關(guān)病毒感染的證據(jù)，從而確定病毒感