1、第一學習小組 段志峰 朱江 邢英超刁文濤 馮延賓 張熠唐亦辰 黃云 何驍男利用微衛星多重PCR和帶型分析鑒別釀酒酵母菌株摘要我們提出了一種利用多重PCR對微衛星位點多態性分析快速鑒別釀酒酵母菌種的方法。無需使用苯酚，簡單提取DNA，利用多重PCR擴增SC8132X, YOR267C 和SCPTSY7位點，用瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳進行帶型分析，這種方法可使我們區分30種商用葡萄酒釀酒菌種。該方法被成功應用于一項在15和20攝氏度這兩個發酵溫度下檢驗兩個菌株間的顯性關系的生態學研究中。這種方法在釀酒和酵母生產工業中常規的低成本檢測酵母菌株的過程中應該有應用價值。關鍵詞：微衛星，PCR，酵母菌株

2、，葡萄酒，發酵1.前言使用選育出的用于酒精發酵的酵母菌株釀造葡萄酒是現在普遍使用的一種方法。酵母對葡萄酒的質量尤其是口味有很大的影響（現代的釀酒學家發現用不同的酵母菌株發酵可以使葡萄酒產生不同的特點。這導致了具有多種特色并可以應用于不同領域的選育菌株工業生產化。現在市場上提供了幾百種葡萄酒菌種，它們幾乎都屬于釀酒酵母菌屬。與此同時，人們對發明快速而且精確檢測酵母菌株的方法也產生了興趣。在葡萄酒釀造中，它的應用包括確定接種菌株對在未發酵葡萄汁中野生菌株的顯性優勢，實時記錄發酵中的菌株動態過程，控制菌株生產的質量并鑒別無效菌株。釀酒時，選育出的菌株被接種于富含野生釀酒酵母和非釀酒酵母的葡萄汁中。快

3、速鑒別酵母菌株的方法應該考慮到菌群生長動態的觀察，選育菌株的顯性優勢和環境因素對酵母菌株的影響。在葡萄酒發酵，溫度是影響酵母動力學的一個主要因素（Fleet and Heard,1993）;生態研究也顯示出了釀酒酵母菌株的不同行為。(Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003).事實上，釀酒商要求菌株的一個突出特點是能夠在特定的溫度下進行良好的發酵反應。很多時候，在一個典型的發酵白葡萄，發酵溫度應保持18攝氏度，但達到12-15 攝氏度也不少見，從而提高調味品酯的含量并減少高酒精形成。在此溫度下，經常會發生發酵停滯，因此，在這種狀況下，選育菌種的低溫代謝

4、能力和對野生菌種的顯性優勢備受重視。 在過去的幾年中，研究側重于用分子生物學方法進行菌株分化（Beh et al., 2006） ，如染色體分析法（Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988）和限制性片段長度多態性（ RFLP ）分析mDNA （Querolet al., 1992） ，以及基于PCR的方法，其中包括內部轉錄序列（ ITS ）的核糖體DNA 測序（Montrocher et al., 1998） ，元件插入位點的多態性（Cameron et al., 1979;Ness et al., 1993） ，擴增片段長度多態性（ A

5、FLP ）的（De Barros Lopes et al., 1999） ，隨機擴增多態性DNA （ RAPD ） （Baleiras-Couto et al., 1996） ， 內含子剪接序列擴增（De Barros Lopeset al., 1996）及PCR內含的線粒體基因（Lo pez et al., 2003） 。這些方法在關于分辨率和處理時間方面對經典生理學實驗起到了增強作用，但是其中一些方法還有些限制條件，因為它們幾乎不能應用于日常的分析中，或者當它們容易實施時，它們并不能在菌種水平上完全區分這些菌株。此外，在一些方法中，如元件分型和RAPD，其重現性取決于DNA模板的純度和濃度

6、。(Ferna ndez-Espinar et al., 2001; Beh et al., 2006)。這些缺點意味著花費大量時間和資金進行DNA清理步驟，在某些情況下還需要幾步反應，以評估非重復性帶型發生的可能性。基于具有長度多態性的簡單序列重復基因位點分散在整個基因組中，微衛星分析已成功地被用來區分酵母菌株（Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Perez et al., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et al., 2005）。最近，利用對具高度多態性的微衛星位點的多重PC

7、R方法可以分離一系列商用酵母菌株 (Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。微衛星位點PCR高辨別能力以及其穩定性和實用性使其成為區分酵母菌種最受歡迎的方法之一。這個方法用于常規檢測的瓶頸發生在擴增子分析的步驟：利用聚丙烯酰胺凝膠及測序分析儀確定擴增子的大小較為費時費力。為了避免這個限制，有人提出利用簡單的高張力瓊脂糖凝膠電泳（Routman and Cheverud, 1994;Ferraro et al., 1998) 。最近，Howell 等人（2004）建議利用對SC8132X 位點的PCR擴增

8、和聚丙烯酰胺凝膠加EB染色電泳來進行釀酒酵母的分型。為了建立一種快速精確并且甚至適用于那些低預算高通量實驗室的鑒別菌種的方法，我們對3個高多態性微衛星位點的多重擴增（Gonzalez Techera et al., 2001），然后用瓊脂糖凝膠電泳進行帶型分析。作為第一步，我們對一組29種商用酵母菌株進行測試，另加一釀酒酵母菌株作為參考，以檢查該方法的鑒別能力。然后，我們在測試發酵溫度對共接種的兩個選育菌株的生長速率和競爭能力的影響的實驗中檢查了這種方法的實際適用性。2.材料與方法2.1酵母菌株和培養基釀酒酵母菌株采購于釀酒酵母生產商。釀酒酵母菌株見表1。酵母菌模式菌株（CBS 1171）從C

9、RA-Istituto Sperimentale per lEnologia of Asti, Italy (ISE)的收集品中獲得。商用干菌株懸浮于無菌5%的蔗糖液體培養基中，40攝氏度下放置30分鐘，稀釋，然后涂布于YMA平板(10g/L葡萄糖, 5g/L蛋白胨, 3g/L酵母浸出物, 3g /L 麥芽膏和20g/ L瓊脂),然后在24攝氏度下培養48小時。2.2 DNA抽提 在第一步檢驗這種方法的鑒別能力時，我們用Harju等人（2004）的方法抽提DNA。簡單的說，將單個菌落重懸浮于200ml的lysis buffer(2% (w/v) TritonX-100, 1% (w/v) SD

10、S, 100 mmol L_1 NaCl, 10 mmol L_1TrisHCl pH 8.0, 1 mmol L_1 EDTA pH 8.0)中。這些試管放置于-80度冰箱中3分鐘（直到完全凍住），然后在 95攝氏度下于Thermomixer（Eppendorf AG, Hamburg, Germany）中放置一分鐘（不要振蕩）使它們快速溶化。重復上述過程，然后以最大速度旋轉試管30秒。向試管中加入200ml氯仿冰浴，然后振蕩試管2分鐘，20，000g ，5攝氏度的條件下離心5分鐘。取上清液與另一試管中加入400ml冰的純乙醇，20攝氏度下靜置沉淀10分鐘，然后在20，000g ，5攝氏度下

11、離心10分鐘。去上清，DNA沉淀用0.5mL 70% (v/v)乙醇純化，45攝氏度下真空干燥。得到的DNA溶于15mlTE (10 mmol L_1 Tris, 1 mmol L_1 EDTA, pH 8.0)。第二步檢驗該方法適用性的過程中，用微量加樣吸頭直接從單菌落中提取菌體直接懸浮于事先加好PCR混合物的0.2ml孔中。2.3 .PCR與電泳三個微衛星位點，SC8132X,YOR267C和SCPTSY7被使用是由于他們具有高度的多態性。擴增是依賴于幾對特異性的順式與反式的引物進行的（見表二）SC8132X位點的引物與YOR267C位點的順式引物是由Field和Wills所設計的，YOR

12、267C位點的反式引物是由Gonzalez Techera et al制作的，而SCPTSY7位點的順式引物是由Perez et al制作的。SCPTSY7位點的反式引物是由我們使用免費軟件Primer 3所設計的，目的是使其產生幾個電泳帶具有明顯位置區別的擴增子而不與其他兩個位點重疊。PCR擴增是進行在一個具有20微升體積液體的Biorad MyCycler熱力周期儀中。20微升液體是有以下部分組成的：1微升DNA的萃取溶液（包含20-40ng DNA），3.1mmol/L濃度的MgCl2，0.4mmol/L濃度的各種dNTP,2微升去鎂的PCR緩沖液，2個單位Taq DNA聚合酶，SCYO

13、R267C位點引物各10pmol，SC8132X位點引物各15pmol以及SCPTSY7位點的引物各40pmol。PCR反應組分各成分的濃度被設計得盡量減小非特異性擴增。在發酵實驗中，反應體系的體積為10微升，試劑組分與所占比例與上述反應體系相同，這樣做可以節省Taq聚合酶與其他昂貴的試劑。為了優化對三個位點的多元化擴增，方案如下：94保持4分鐘，以a.94保持30秒;b.56保持45秒;c.72保持30秒為一個周期，重復28個周期，最后以72保持10分鐘處理。將產物在尺寸為15*10cm2濃度為2.5%（w/v）的瓊脂糖凝膠上，浸于TBE緩沖液中，在100V條件下電泳80分鐘，凝膠將被溴化乙

14、錠所染色。當使用聚丙烯酰胺凝膠電泳時，應使用預制的8.6*6.8cm210%(w/v)的TBE凝膠，在100V條件下電泳60分鐘。Marker應使用標記分子量為100-20bp的Sigma低階marker。電泳分布情況被集群分析軟件處理，該軟件使用一種類似于二進制的指標，它使用UPGMA的方式創建系統樹圖。同表象相關性將被用于探知由Rossetti和Giraffa描述的確定的與非確定的聚類。同表項相關性的百分比在各個分支中給出。2.4.該方法的可重復性與微衛星標記的穩定性通過對每個菌株取五份菌落DNA萃取液進行擴增來檢測可重復性，對擴增產物的分析是將其分為五個不同孔道進行瓊脂糖電泳而進行的。為

15、了檢驗微衛星標記在酒精發酵中的穩定性，檢驗是在隨意挑選的三個菌株中進行的：菌株2，菌株3和菌株5。再水化后，每個菌株被單獨接種在盛有滅菌葡萄汁的500ml燒瓶中。在16的條件下發酵20天。表二 用于擴增的三株啤酒酵母微衛星位點引物分析在十組隨意選出的菌落中進行，這些菌落取自發酵開始時和結束時的每個菌株。2.5.發酵兩株酵母菌株，DSM Cepage Chardonnay和Vitilevure DV10被選中進行發酵試驗，因為他們具有相似的用途與特征（用于白葡萄發酵，醇耐受性和表型殺傷性相似），就像制造者說的一樣。Vitilevure DV10是耐冷的。滅菌的葡萄汁被用于培養基。它包含濃度均為1

16、50mg/L的硫酸銨和磷酸銨作為發酵氮源。濃度為200g/L的蔗糖被加入作為糖源。發酵開始時將1.6L滅菌的葡萄汁加入到容積為2L的帶有磁力攪拌器的錐形燒瓶中。這個儀器以一個有孔的橡皮塞封口，有一根以棉線固定的巴斯德吸管插在孔中。以單菌株涂平板，再挑出單菌落以多元的PCR分析方法檢測它們的同一性。然后將相同的菌落懸浮培養于預配的培養基中，該培養基由滅菌的葡萄汁組成，可以提供氮源但無糖源。在20下進行每分鐘震動100次的好氧生長后，形成混合的接種物，每個菌株都具有均一的濃度，為5*105個細胞/L。由濃度為1*106個細胞/L的單菌株形成的接種物用來檢測每種菌株完成發酵的能力。發酵溫度被控制在1

17、5-20之間，并且設有條件相同的對照組。樣本被取于每個菌株發酵過程中的的相同時間，這幾個時間點分別為：發酵開始時（接種后的十分鐘），葡萄汁中殘余60%糖分時，葡萄汁中殘余30%糖分時以及發酵結束時（<2g/L）。發酵過程中糖分濃度是由高性能液體色譜檢測的，使用一根OAKC聚乙烯圓柱棒與一個折光指數檢測器。將樣品稀釋并涂布于YMA平板培養基上。在25下培養48小時后，將含有菌落數為150-200的菌落隨機挑選進行PCR分析。在每個時間點，每個菌落分析48-60個菌落。總共900個菌落被檢測。3.結果3.1 酵母菌菌株分類 圖.1為瓊脂糖凝膠電泳結果。對于每一菌株，除了最明顯的一條電泳帶外，

18、還觀察到好幾條模糊的帶，可能是因為非特異性擴增。將單一引物擴增的帶形圖和多引物擴增帶形圖比較發現19和30（菌株）的電泳圖中有大量的這些帶。圖2中，這些微弱的帶同樣出現在由單一引物進行擴增的帶形圖中，說明不是由3個位點的引物的交互作用引起的，盡管這些帶是可復制的，但是它們并不被認為有基因多態性價值。各片斷在數量和大小上的差異已被發現。對于1、3、4、6、8、10、11、15、20、24和25這些菌株，僅有3條比較明顯的帶出現，然而大部分菌株顯示，電泳圖中每個位點出現3到9條帶而不是1到3條帶。帶形圖的電腦分析顯示，在所有的菌株里面，3與7、18與29、8與20、14與16有80%以上相似，僅在

19、帶寬上有很小的差異，同時2與9、4與11菌有100%的相似度。所有有80%以上相似度的組群導致可靠的100%同表象相關。為了核實這些結果，將PCR得到的產物的10%聚丙烯酰胺凝膠電泳結果和瓊脂糖凝膠電泳結果進行比較（圖.4）。電泳結果（圖.4b）顯示：18與29、8與20、14與16展現出在電泳帶數量和位置方面的清晰而有價值的差異。3與7、4與8的結果非常相似，但是，可通過用SCPTSY7引物對3于7進行擴增產生的擴增子和用SCPTSY7與SC8132X引物對4與7進行擴增產生的擴增子進行區別。最后，DSM Fermivin（菌株 2）和Laffort Zymaflore ST（菌株 9）在所

20、有的電泳分析中顯示相同的結果。在重復實驗中，對任一菌株的五個重復試驗結果顯示出相同的帶形圖，用Bionumerics軟件分析各片斷大小與平均值的標準偏差不超過1.5%（圖.3），達到100%匹配。在發酵開始和結束時對3個所挑選菌株的擴增，產生相同的輪廓，說明在發酵過程中微衛星標記是穩定的。3.2 發酵在發酵試驗中，通過對采集和重懸的細胞群落直接進行PCR與用冷凍萃取法提取DNA后擴增所得到的帶形沒有差別。得到的帶都很清晰，而且所用的兩個菌株的差別很明顯。蛋白質和細胞組分干擾信號會很快地消失，不會影響到DNA的遷移。由兩個菌株發酵試驗所得到的結果如圖.6所示。在15試驗中，菌株5再發酵中很快占據

21、優勢；當30%的糖分被消耗后，該菌株在整個菌群中的百分比達到70%，在發酵結束時，菌株3已基本消失（圖.6a）。在20發酵中（圖.6b）兩個菌株的行為是不同的。在實驗上半過程中，他們互具優勢，而在以后的發酵過程中菌株5的數量增加。當糖分全部消耗后，菌株5再整個菌群中占的比例達到85%-90% 。4、討論雖然允許對擴增子的精確測定的分析序列，仍然是菌株的微指令衛星分型的參考標準，但昂貴的成本和有限的產量是它在酒類研究領域中得以日常應用的障礙。我們基于對由多元PCR產生的樣本的分析而提出的方法是有辨識力和分析及成本的時間需要兩者的好的折中。我們能夠區分30種大量生產的檢測過的菌株其中的29種，那種

22、與瓊脂糖電泳相似的菌株可以進一步分析和被聚丙烯酰胺預制的凝膠體區別。只有2種DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST,是瓊脂糖和聚丙烯酰胺預制的凝膠體均不能加以區分的。最近，利用17多形態標記對以上2種菌株的遺傳分析顯示，它們僅在第4位點有輕微的不同（包括SC8132X）。SC8132X位點表明，在這個研究中，DSM Fermivin的1個等位基因和Laffort Zymaflore ST的2個等位基因在47bp被識別。這個重要的區別應該被瓊脂糖和聚丙烯酰胺預制的凝膠體二者之一區別。然而，我們的分析，表明2種菌株總體上在擴增子的數量及大小SC8132X擴增中區別很小。

23、這個爭論可能因為在許多不同酵母生產過程中的變異而引起的一個小的遺傳差異。令1個假設是酵母生產者在不同的市場上用了同1個商業名稱出售2種酵母菌株。有趣的是，一些菌株給出了很多強烈的帶。當每個位點的帶的數目多于1個時，這可能是因為倍數染色體位點雜合現象、在挑選的葡萄酒酵母中普通的多倍體的或非整倍體的菌株。(Bakalinsky andSnow, 1990; Hennequin et al., 2001; Bradbury et al., 2005); 從對生物直接PCR而得的結果證明了此法的簡單與活力，此外，給DNA提取設旁路的可能逐步縮短了加工時間和瓊脂糖的使用，這有益于安全和費用。在酵母生態學的研究中，有能