1、第一學(xué)習(xí)小組 段志峰 朱江 邢英超刁文濤 馮延賓 張熠唐亦辰 黃云 何驍男利用微衛(wèi)星多重PCR和帶型分析鑒別釀酒酵母菌株摘要我們提出了一種利用多重PCR對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)多態(tài)性分析快速鑒別釀酒酵母菌種的方法。無(wú)需使用苯酚，簡(jiǎn)單提取DNA，利用多重PCR擴(kuò)增SC8132X, YOR267C 和SCPTSY7位點(diǎn)，用瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行帶型分析，這種方法可使我們區(qū)分30種商用葡萄酒釀酒菌種。該方法被成功應(yīng)用于一項(xiàng)在15和20攝氏度這兩個(gè)發(fā)酵溫度下檢驗(yàn)兩個(gè)菌株間的顯性關(guān)系的生態(tài)學(xué)研究中。這種方法在釀酒和酵母生產(chǎn)工業(yè)中常規(guī)的低成本檢測(cè)酵母菌株的過(guò)程中應(yīng)該有應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：微衛(wèi)星，PCR，酵母菌株

2、，葡萄酒，發(fā)酵1.前言使用選育出的用于酒精發(fā)酵的酵母菌株釀造葡萄酒是現(xiàn)在普遍使用的一種方法。酵母對(duì)葡萄酒的質(zhì)量尤其是口味有很大的影響（現(xiàn)代的釀酒學(xué)家發(fā)現(xiàn)用不同的酵母菌株發(fā)酵可以使葡萄酒產(chǎn)生不同的特點(diǎn)。這導(dǎo)致了具有多種特色并可以應(yīng)用于不同領(lǐng)域的選育菌株工業(yè)生產(chǎn)化?，F(xiàn)在市場(chǎng)上提供了幾百種葡萄酒菌種，它們幾乎都屬于釀酒酵母菌屬。與此同時(shí)，人們對(duì)發(fā)明快速而且精確檢測(cè)酵母菌株的方法也產(chǎn)生了興趣。在葡萄酒釀造中，它的應(yīng)用包括確定接種菌株對(duì)在未發(fā)酵葡萄汁中野生菌株的顯性優(yōu)勢(shì)，實(shí)時(shí)記錄發(fā)酵中的菌株動(dòng)態(tài)過(guò)程，控制菌株生產(chǎn)的質(zhì)量并鑒別無(wú)效菌株。釀酒時(shí)，選育出的菌株被接種于富含野生釀酒酵母和非釀酒酵母的葡萄汁中?？?/p>

3、速鑒別酵母菌株的方法應(yīng)該考慮到菌群生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)的觀察，選育菌株的顯性優(yōu)勢(shì)和環(huán)境因素對(duì)酵母菌株的影響。在葡萄酒發(fā)酵，溫度是影響酵母動(dòng)力學(xué)的一個(gè)主要因素（Fleet and Heard,1993）;生態(tài)研究也顯示出了釀酒酵母菌株的不同行為。(Epifanio et al., 1999; Torijaet al., 2003).事實(shí)上，釀酒商要求菌株的一個(gè)突出特點(diǎn)是能夠在特定的溫度下進(jìn)行良好的發(fā)酵反應(yīng)。很多時(shí)候，在一個(gè)典型的發(fā)酵白葡萄，發(fā)酵溫度應(yīng)保持18攝氏度，但達(dá)到12-15 攝氏度也不少見(jiàn)，從而提高調(diào)味品酯的含量并減少高酒精形成。在此溫度下，經(jīng)常會(huì)發(fā)生發(fā)酵停滯，因此，在這種狀況下，選育菌種的低溫代謝

4、能力和對(duì)野生菌種的顯性優(yōu)勢(shì)備受重視。 在過(guò)去的幾年中，研究側(cè)重于用分子生物學(xué)方法進(jìn)行菌株分化（Beh et al., 2006） ，如染色體分析法（Carle and Olson,1985; Blondin and Vezinhet, 1988）和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ RFLP ）分析mDNA （Querolet al., 1992） ，以及基于PCR的方法，其中包括內(nèi)部轉(zhuǎn)錄序列（ ITS ）的核糖體DNA 測(cè)序（Montrocher et al., 1998） ，元件插入位點(diǎn)的多態(tài)性（Cameron et al., 1979;Ness et al., 1993） ，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（ A

5、FLP ）的（De Barros Lopes et al., 1999） ，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA （ RAPD ） （Baleiras-Couto et al., 1996） ， 內(nèi)含子剪接序列擴(kuò)增（De Barros Lopeset al., 1996）及PCR內(nèi)含的線粒體基因（Lo pez et al., 2003） 。這些方法在關(guān)于分辨率和處理時(shí)間方面對(duì)經(jīng)典生理學(xué)實(shí)驗(yàn)起到了增強(qiáng)作用，但是其中一些方法還有些限制條件，因?yàn)樗鼈儙缀醪荒軕?yīng)用于日常的分析中，或者當(dāng)它們?nèi)菀讓?shí)施時(shí)，它們并不能在菌種水平上完全區(qū)分這些菌株。此外，在一些方法中，如元件分型和RAPD，其重現(xiàn)性取決于DNA模板的純度和濃度

6、。(Ferna ndez-Espinar et al., 2001; Beh et al., 2006)。這些缺點(diǎn)意味著花費(fèi)大量時(shí)間和資金進(jìn)行DNA清理步驟，在某些情況下還需要幾步反應(yīng)，以評(píng)估非重復(fù)性帶型發(fā)生的可能性?；诰哂虚L(zhǎng)度多態(tài)性的簡(jiǎn)單序列重復(fù)基因位點(diǎn)分散在整個(gè)基因組中，微衛(wèi)星分析已成功地被用來(lái)區(qū)分酵母菌株（Field and Wills, 1998;Gonzalez Techera et al., 2001; Perez et al., 2001;Hennequin et al., 2001; Malgoire et al., 2005）。最近，利用對(duì)具高度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)的多重PC

7、R方法可以分離一系列商用酵母菌株 (Schuller et al., 2004;Bradbury et al., 2005; Legras et al., 2005)。微衛(wèi)星位點(diǎn)PCR高辨別能力以及其穩(wěn)定性和實(shí)用性使其成為區(qū)分酵母菌種最受歡迎的方法之一。這個(gè)方法用于常規(guī)檢測(cè)的瓶頸發(fā)生在擴(kuò)增子分析的步驟：利用聚丙烯酰胺凝膠及測(cè)序分析儀確定擴(kuò)增子的大小較為費(fèi)時(shí)費(fèi)力。為了避免這個(gè)限制，有人提出利用簡(jiǎn)單的高張力瓊脂糖凝膠電泳（Routman and Cheverud, 1994;Ferraro et al., 1998) 。最近，Howell 等人（2004）建議利用對(duì)SC8132X 位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增

8、和聚丙烯酰胺凝膠加EB染色電泳來(lái)進(jìn)行釀酒酵母的分型。為了建立一種快速精確并且甚至適用于那些低預(yù)算高通量實(shí)驗(yàn)室的鑒別菌種的方法，我們對(duì)3個(gè)高多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)的多重?cái)U(kuò)增（Gonzalez Techera et al., 2001），然后用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行帶型分析。作為第一步，我們對(duì)一組29種商用酵母菌株進(jìn)行測(cè)試，另加一釀酒酵母菌株作為參考，以檢查該方法的鑒別能力。然后，我們?cè)跍y(cè)試發(fā)酵溫度對(duì)共接種的兩個(gè)選育菌株的生長(zhǎng)速率和競(jìng)爭(zhēng)能力的影響的實(shí)驗(yàn)中檢查了這種方法的實(shí)際適用性。2.材料與方法2.1酵母菌株和培養(yǎng)基釀酒酵母菌株采購(gòu)于釀酒酵母生產(chǎn)商。釀酒酵母菌株見(jiàn)表1。酵母菌模式菌株（CBS 1171）從C

9、RA-Istituto Sperimentale per lEnologia of Asti, Italy (ISE)的收集品中獲得。商用干菌株懸浮于無(wú)菌5%的蔗糖液體培養(yǎng)基中，40攝氏度下放置30分鐘，稀釋，然后涂布于YMA平板(10g/L葡萄糖, 5g/L蛋白胨, 3g/L酵母浸出物, 3g /L 麥芽膏和20g/ L瓊脂),然后在24攝氏度下培養(yǎng)48小時(shí)。2.2 DNA抽提 在第一步檢驗(yàn)這種方法的鑒別能力時(shí)，我們用Harju等人（2004）的方法抽提DNA。簡(jiǎn)單的說(shuō)，將單個(gè)菌落重懸浮于200ml的lysis buffer(2% (w/v) TritonX-100, 1% (w/v) SD

10、S, 100 mmol L_1 NaCl, 10 mmol L_1TrisHCl pH 8.0, 1 mmol L_1 EDTA pH 8.0)中。這些試管放置于-80度冰箱中3分鐘（直到完全凍?。?，然后在 95攝氏度下于Thermomixer（Eppendorf AG, Hamburg, Germany）中放置一分鐘（不要振蕩）使它們快速溶化。重復(fù)上述過(guò)程，然后以最大速度旋轉(zhuǎn)試管30秒。向試管中加入200ml氯仿冰浴，然后振蕩試管2分鐘，20，000g ，5攝氏度的條件下離心5分鐘。取上清液與另一試管中加入400ml冰的純乙醇，20攝氏度下靜置沉淀10分鐘，然后在20，000g ，5攝氏度下

11、離心10分鐘。去上清，DNA沉淀用0.5mL 70% (v/v)乙醇純化，45攝氏度下真空干燥。得到的DNA溶于15mlTE (10 mmol L_1 Tris, 1 mmol L_1 EDTA, pH 8.0)。第二步檢驗(yàn)該方法適用性的過(guò)程中，用微量加樣吸頭直接從單菌落中提取菌體直接懸浮于事先加好PCR混合物的0.2ml孔中。2.3 .PCR與電泳三個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，SC8132X,YOR267C和SCPTSY7被使用是由于他們具有高度的多態(tài)性。擴(kuò)增是依賴于幾對(duì)特異性的順式與反式的引物進(jìn)行的（見(jiàn)表二）SC8132X位點(diǎn)的引物與YOR267C位點(diǎn)的順式引物是由Field和Wills所設(shè)計(jì)的，YOR

12、267C位點(diǎn)的反式引物是由Gonzalez Techera et al制作的，而SCPTSY7位點(diǎn)的順式引物是由Perez et al制作的。SCPTSY7位點(diǎn)的反式引物是由我們使用免費(fèi)軟件Primer 3所設(shè)計(jì)的，目的是使其產(chǎn)生幾個(gè)電泳帶具有明顯位置區(qū)別的擴(kuò)增子而不與其他兩個(gè)位點(diǎn)重疊。PCR擴(kuò)增是進(jìn)行在一個(gè)具有20微升體積液體的Biorad MyCycler熱力周期儀中。20微升液體是有以下部分組成的：1微升DNA的萃取溶液（包含20-40ng DNA），3.1mmol/L濃度的MgCl2，0.4mmol/L濃度的各種dNTP,2微升去鎂的PCR緩沖液，2個(gè)單位Taq DNA聚合酶，SCYO

13、R267C位點(diǎn)引物各10pmol，SC8132X位點(diǎn)引物各15pmol以及SCPTSY7位點(diǎn)的引物各40pmol。PCR反應(yīng)組分各成分的濃度被設(shè)計(jì)得盡量減小非特異性擴(kuò)增。在發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，反應(yīng)體系的體積為10微升，試劑組分與所占比例與上述反應(yīng)體系相同，這樣做可以節(jié)省Taq聚合酶與其他昂貴的試劑。為了優(yōu)化對(duì)三個(gè)位點(diǎn)的多元化擴(kuò)增，方案如下：94保持4分鐘，以a.94保持30秒;b.56保持45秒;c.72保持30秒為一個(gè)周期，重復(fù)28個(gè)周期，最后以72保持10分鐘處理。將產(chǎn)物在尺寸為15*10cm2濃度為2.5%（w/v）的瓊脂糖凝膠上，浸于TBE緩沖液中，在100V條件下電泳80分鐘，凝膠將被溴化乙

14、錠所染色。當(dāng)使用聚丙烯酰胺凝膠電泳時(shí)，應(yīng)使用預(yù)制的8.6*6.8cm210%(w/v)的TBE凝膠，在100V條件下電泳60分鐘。Marker應(yīng)使用標(biāo)記分子量為100-20bp的Sigma低階marker。電泳分布情況被集群分析軟件處理，該軟件使用一種類似于二進(jìn)制的指標(biāo)，它使用UPGMA的方式創(chuàng)建系統(tǒng)樹(shù)圖。同表象相關(guān)性將被用于探知由Rossetti和Giraffa描述的確定的與非確定的聚類。同表項(xiàng)相關(guān)性的百分比在各個(gè)分支中給出。2.4.該方法的可重復(fù)性與微衛(wèi)星標(biāo)記的穩(wěn)定性通過(guò)對(duì)每個(gè)菌株取五份菌落DNA萃取液進(jìn)行擴(kuò)增來(lái)檢測(cè)可重復(fù)性，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的分析是將其分為五個(gè)不同孔道進(jìn)行瓊脂糖電泳而進(jìn)行的。為

15、了檢驗(yàn)微衛(wèi)星標(biāo)記在酒精發(fā)酵中的穩(wěn)定性，檢驗(yàn)是在隨意挑選的三個(gè)菌株中進(jìn)行的：菌株2，菌株3和菌株5。再水化后，每個(gè)菌株被單獨(dú)接種在盛有滅菌葡萄汁的500ml燒瓶中。在16的條件下發(fā)酵20天。表二 用于擴(kuò)增的三株啤酒酵母微衛(wèi)星位點(diǎn)引物分析在十組隨意選出的菌落中進(jìn)行，這些菌落取自發(fā)酵開(kāi)始時(shí)和結(jié)束時(shí)的每個(gè)菌株。2.5.發(fā)酵兩株酵母菌株，DSM Cepage Chardonnay和Vitilevure DV10被選中進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，因?yàn)樗麄兙哂邢嗨频挠猛九c特征（用于白葡萄發(fā)酵，醇耐受性和表型殺傷性相似），就像制造者說(shuō)的一樣。Vitilevure DV10是耐冷的。滅菌的葡萄汁被用于培養(yǎng)基。它包含濃度均為1

16、50mg/L的硫酸銨和磷酸銨作為發(fā)酵氮源。濃度為200g/L的蔗糖被加入作為糖源。發(fā)酵開(kāi)始時(shí)將1.6L滅菌的葡萄汁加入到容積為2L的帶有磁力攪拌器的錐形燒瓶中。這個(gè)儀器以一個(gè)有孔的橡皮塞封口，有一根以棉線固定的巴斯德吸管插在孔中。以單菌株涂平板，再挑出單菌落以多元的PCR分析方法檢測(cè)它們的同一性。然后將相同的菌落懸浮培養(yǎng)于預(yù)配的培養(yǎng)基中，該培養(yǎng)基由滅菌的葡萄汁組成，可以提供氮源但無(wú)糖源。在20下進(jìn)行每分鐘震動(dòng)100次的好氧生長(zhǎng)后，形成混合的接種物，每個(gè)菌株都具有均一的濃度，為5*105個(gè)細(xì)胞/L。由濃度為1*106個(gè)細(xì)胞/L的單菌株形成的接種物用來(lái)檢測(cè)每種菌株完成發(fā)酵的能力。發(fā)酵溫度被控制在1

17、5-20之間，并且設(shè)有條件相同的對(duì)照組。樣本被取于每個(gè)菌株發(fā)酵過(guò)程中的的相同時(shí)間，這幾個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別為：發(fā)酵開(kāi)始時(shí)（接種后的十分鐘），葡萄汁中殘余60%糖分時(shí)，葡萄汁中殘余30%糖分時(shí)以及發(fā)酵結(jié)束時(shí)（<2g/L）。發(fā)酵過(guò)程中糖分濃度是由高性能液體色譜檢測(cè)的，使用一根OAKC聚乙烯圓柱棒與一個(gè)折光指數(shù)檢測(cè)器。將樣品稀釋并涂布于YMA平板培養(yǎng)基上。在25下培養(yǎng)48小時(shí)后，將含有菌落數(shù)為150-200的菌落隨機(jī)挑選進(jìn)行PCR分析。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)菌落分析48-60個(gè)菌落?？偣?00個(gè)菌落被檢測(cè)。3.結(jié)果3.1 酵母菌菌株分類 圖.1為瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。對(duì)于每一菌株，除了最明顯的一條電泳帶外，

18、還觀察到好幾條模糊的帶，可能是因?yàn)榉翘禺愋詳U(kuò)增。將單一引物擴(kuò)增的帶形圖和多引物擴(kuò)增帶形圖比較發(fā)現(xiàn)19和30（菌株）的電泳圖中有大量的這些帶。圖2中，這些微弱的帶同樣出現(xiàn)在由單一引物進(jìn)行擴(kuò)增的帶形圖中，說(shuō)明不是由3個(gè)位點(diǎn)的引物的交互作用引起的，盡管這些帶是可復(fù)制的，但是它們并不被認(rèn)為有基因多態(tài)性價(jià)值。各片斷在數(shù)量和大小上的差異已被發(fā)現(xiàn)。對(duì)于1、3、4、6、8、10、11、15、20、24和25這些菌株，僅有3條比較明顯的帶出現(xiàn)，然而大部分菌株顯示，電泳圖中每個(gè)位點(diǎn)出現(xiàn)3到9條帶而不是1到3條帶。帶形圖的電腦分析顯示，在所有的菌株里面，3與7、18與29、8與20、14與16有80%以上相似，僅在

19、帶寬上有很小的差異，同時(shí)2與9、4與11菌有100%的相似度。所有有80%以上相似度的組群導(dǎo)致可靠的100%同表象相關(guān)。為了核實(shí)這些結(jié)果，將PCR得到的產(chǎn)物的10%聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果和瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行比較（圖.4）。電泳結(jié)果（圖.4b）顯示：18與29、8與20、14與16展現(xiàn)出在電泳帶數(shù)量和位置方面的清晰而有價(jià)值的差異。3與7、4與8的結(jié)果非常相似，但是，可通過(guò)用SCPTSY7引物對(duì)3于7進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子和用SCPTSY7與SC8132X引物對(duì)4與7進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)生的擴(kuò)增子進(jìn)行區(qū)別。最后，DSM Fermivin（菌株 2）和Laffort Zymaflore ST（菌株 9）在所

20、有的電泳分析中顯示相同的結(jié)果。在重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)任一菌株的五個(gè)重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果顯示出相同的帶形圖，用Bionumerics軟件分析各片斷大小與平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差不超過(guò)1.5%（圖.3），達(dá)到100%匹配。在發(fā)酵開(kāi)始和結(jié)束時(shí)對(duì)3個(gè)所挑選菌株的擴(kuò)增，產(chǎn)生相同的輪廓，說(shuō)明在發(fā)酵過(guò)程中微衛(wèi)星標(biāo)記是穩(wěn)定的。3.2 發(fā)酵在發(fā)酵試驗(yàn)中，通過(guò)對(duì)采集和重懸的細(xì)胞群落直接進(jìn)行PCR與用冷凍萃取法提取DNA后擴(kuò)增所得到的帶形沒(méi)有差別。得到的帶都很清晰，而且所用的兩個(gè)菌株的差別很明顯。蛋白質(zhì)和細(xì)胞組分干擾信號(hào)會(huì)很快地消失，不會(huì)影響到DNA的遷移。由兩個(gè)菌株發(fā)酵試驗(yàn)所得到的結(jié)果如圖.6所示。在15試驗(yàn)中，菌株5再發(fā)酵中很快占據(jù)

21、優(yōu)勢(shì)；當(dāng)30%的糖分被消耗后，該菌株在整個(gè)菌群中的百分比達(dá)到70%，在發(fā)酵結(jié)束時(shí)，菌株3已基本消失（圖.6a）。在20發(fā)酵中（圖.6b）兩個(gè)菌株的行為是不同的。在實(shí)驗(yàn)上半過(guò)程中，他們互具優(yōu)勢(shì)，而在以后的發(fā)酵過(guò)程中菌株5的數(shù)量增加。當(dāng)糖分全部消耗后，菌株5再整個(gè)菌群中占的比例達(dá)到85%-90% 。4、討論雖然允許對(duì)擴(kuò)增子的精確測(cè)定的分析序列，仍然是菌株的微指令衛(wèi)星分型的參考標(biāo)準(zhǔn)，但昂貴的成本和有限的產(chǎn)量是它在酒類研究領(lǐng)域中得以日常應(yīng)用的障礙。我們基于對(duì)由多元PCR產(chǎn)生的樣本的分析而提出的方法是有辨識(shí)力和分析及成本的時(shí)間需要兩者的好的折中。我們能夠區(qū)分30種大量生產(chǎn)的檢測(cè)過(guò)的菌株其中的29種，那種

22、與瓊脂糖電泳相似的菌株可以進(jìn)一步分析和被聚丙烯酰胺預(yù)制的凝膠體區(qū)別。只有2種DSM Fermivin和Laffort Zymaflore ST,是瓊脂糖和聚丙烯酰胺預(yù)制的凝膠體均不能加以區(qū)分的。最近，利用17多形態(tài)標(biāo)記對(duì)以上2種菌株的遺傳分析顯示，它們僅在第4位點(diǎn)有輕微的不同（包括SC8132X）。SC8132X位點(diǎn)表明，在這個(gè)研究中，DSM Fermivin的1個(gè)等位基因和Laffort Zymaflore ST的2個(gè)等位基因在47bp被識(shí)別。這個(gè)重要的區(qū)別應(yīng)該被瓊脂糖和聚丙烯酰胺預(yù)制的凝膠體二者之一區(qū)別。然而，我們的分析，表明2種菌株總體上在擴(kuò)增子的數(shù)量及大小SC8132X擴(kuò)增中區(qū)別很小。

23、這個(gè)爭(zhēng)論可能因?yàn)樵谠S多不同酵母生產(chǎn)過(guò)程中的變異而引起的一個(gè)小的遺傳差異。令1個(gè)假設(shè)是酵母生產(chǎn)者在不同的市場(chǎng)上用了同1個(gè)商業(yè)名稱出售2種酵母菌株。有趣的是，一些菌株給出了很多強(qiáng)烈的帶。當(dāng)每個(gè)位點(diǎn)的帶的數(shù)目多于1個(gè)時(shí)，這可能是因?yàn)楸稊?shù)染色體位點(diǎn)雜合現(xiàn)象、在挑選的葡萄酒酵母中普通的多倍體的或非整倍體的菌株。(Bakalinsky andSnow, 1990; Hennequin et al., 2001; Bradbury et al., 2005); 從對(duì)生物直接PCR而得的結(jié)果證明了此法的簡(jiǎn)單與活力，此外，給DNA提取設(shè)旁路的可能逐步縮短了加工時(shí)間和瓊脂糖的使用，這有益于安全和費(fèi)用。在酵母生態(tài)學(xué)的研究中，有能