1、下面內容綜合了 Agile nt和網上查到的一些資料：一般來說，反相HPLC的流動相包括有機相和水相，有機相常用的為色譜甲 醇和乙腈，不太常用的還有四氫呋喃和異丙醇。 甲醇有其性價比的優勢，但是甲 醇活性高，可能與某些樣品發生反應，而且甲醇在低波長下有紫外吸收， 會降低 分析方法的靈敏度；乙腈雖然價格很高，毒性比甲醇大，但是洗脫能力比甲醇強， 很少與樣品發生反應，用作流動相系統壓力要比甲醇低很多， 且截止波長比甲醇 低20nm，增加了檢測出在低波長下才有吸收的雜質的可能性，所以我們一般傾 向于多用乙腈，少用甲醇。但是當樣品峰形不好或者分離不好時，更換溶劑是一個很好的選擇，因為不同的溶劑可提供不

2、同的選擇性。在反相色譜中，流動相中水相的 pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏 感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型樣品的保留隨pH改變而明顯變化，因此控制pH對于保留和選擇性的穩定非常重要，通常在 pH24的條件 下，保留時間對pH的微小改變穩定性最高，因此建議將這一 pH范圍作為大多數 樣品方法開發的起始pH,包括堿性化合物和一般的弱酸。考慮到重現性，所用 的pH應高于或低于待分析物pKa或pKb上下一個pH單位。當待分析物pKa或 pKb未知時，應測試一種以上流動相 pH (如pH2.0和pH6.5緩沖鹽溶液)，可提 供最好結果。對流動相的優化主要體現在水相上。流動相pH值對

3、色譜分離的影響有多鐘方式，根據待分析物的結構性質，pH可能影響選擇性、峰形和保留。如果是非 極性較強或中性的化合物，pH對分離度和保留的影響一般不明顯。如果是可離 子化的化合物，如酸或堿，保留因子和選擇性隨pH改變非常明顯。(1) 酸性分析物，應選擇低pH緩沖液流動相，以防止分析物離子化。 了解分析物的pKa,才能有效的選擇流動相pHo緩沖范圍應在其緩沖液離子 pK 值土 1 pH單位，使流動相的優化具有一定的靈活性。 例如，醋酸鹽的pKa為4.8， 緩沖范圍為pH3.85.8。(2) 堿性化合物，在高pH條件下才能得到其非離子形態，但這對色譜 柱不利。通常許多堿性化合物在低 pH條件的保留就

4、已經滿足要求了，所以可選 擇低pH條件。如果選擇高pH條件，則注意需選擇耐強堿的色譜柱。水里可以加酸、加堿、加鹽，從而改變 pH值、改善峰形、提高分離度。 常用的酸有磷酸、三氟乙酸、甲酸、乙酸、高氯酸、甲基磺酸等。單純做液相時， 低波長下磷酸最合適；而做液質時首選三氟乙酸，或甲酸、乙酸。開發液相分析 方法時流動相可首選 0.1%的磷酸水溶液，然后再以此為基礎做優化。在單獨用 酸不行的時候再考慮使用緩沖鹽，緩沖鹽的選擇原則是：簡單、穩定、緩沖能力 強、配制簡單，需要調pH值時要有相應的酸或堿。常用的緩沖鹽是磷酸鹽，主 要是鉀鹽和鈉鹽，還有醋酸鹽，常用的鹽濃度在1020mM左右(根據實際情況，有時

5、可以選擇更低或更高濃度，建議最高濃度不超過50mM。卜表是Waters提供的一個資料，常規實驗室建議使用的緩沖鹽體系。緩沖鹽/流動相pKa緩沖范圍揮發是否MS兼備注改性劑性?(±pH)容？TFA0.3-是是離子對試劑，能夠抑制MS信號，通常使用的濃度范圍0.020.1%乙酸4.76-是是同乙酸銨一起使用具有 最大的緩沖能力，通常使 用的濃度范圍0.11.0%甲酸3.75-是是同甲酸銨一起使用具有 最大的緩沖能力，通常使用的濃度范圍0.11.0%乙酸鹽（銨鹽）4.763.765.76是是通常使用110mM濃度，注意鉀鹽和鈉鹽是非揮 發性的甲酸鹽（銨鹽）3.752.754.75是是通常使

6、用110mM濃度，注意鉀鹽和鈉鹽是非揮 發性的磷酸鹽12.151.153.15否否傳統的低pH緩沖體系，UV透光度很好磷酸鹽27.26.28.2否否當pH超過7時，降低操 作溫度/緩沖鹽濃度以及 使用保護柱可以延長色 譜柱壽命磷酸鹽312.311.313.3否否當pH超過8時，降低操 作溫度/緩沖鹽濃度以及使用保護柱可以延長色譜柱壽命4-甲基嗎啡啉8.47.49.4是是通常使用濃度為10mM 或更少氨水 碳酸氫 銨9.210.3(HCO3-)9.2(NH4+)8.210.28.211.3是是通常使用濃度為510mM （用于MS工作 時保持離子源溫度超過150 °C）。用氨水或乙酸 調

7、節pH值，在pH10時 具有很好的緩沖能力。乙酸銨9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM甲酸銨9.28.210.2是是通常使用濃度為110mM硼酸9.28.210.2否否降低溫度，減少濃度并使 用色譜柱來延長柱壽命CAPSO （3-環 己胺基-2-羥基丙磺酸9.78.710.7否否兩性離子緩沖液，同乙腈 互溶，通常使用濃度為110mM，氣味小Glyc ine甘氨酸2.4,9.88.810.8否否兩性離子緩沖液，比使用 硼酸鹽對柱子的損傷更 小些1-甲基哌啶10.29.311.3是是通常使用濃度為110mMCAPS10.49.511.5否否兩性離子緩沖液，同乙腈互溶，通常使用濃度為110mM，氣味小三乙胺（乙酸 鹽）10.79.71