1、（課件重點(diǎn)）毒理學(xué)研究方法1.體內(nèi)試驗(yàn)(in vivo)：也稱整體動(dòng)物試驗(yàn)，可嚴(yán)格控制接觸條件，測(cè)定多種類型的毒作用。大鼠，小鼠，豚鼠，家兔，狗和猴等。也有魚類，鳥類，昆蟲等2體外試驗(yàn)(in vitro):利用游離器官、培養(yǎng)的細(xì)胞或細(xì)胞器、生物模擬系統(tǒng)進(jìn)行毒理學(xué)研究。器官（肝、胚胎），細(xì)胞，細(xì)胞器，分子等3人體觀察(human toxicology)，事故或志愿者4流行病學(xué)研究(epidemiological study)：為什么有選擇毒性1物種和細(xì)胞學(xué)的差異 (植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑) 2蓄積能力 3.代謝過(guò)程和速率 4.損傷的修復(fù)能力非損害作用(non-adverse effect)所致機(jī)體發(fā)生的

2、一切生物學(xué)變化都是暫時(shí)的、可逆的，應(yīng)在機(jī)體代償能力范圍之內(nèi)，不造成機(jī)體形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程及壽命的改變、不降低機(jī)體維持穩(wěn)態(tài)的能力和對(duì)額外應(yīng)激代償?shù)哪芰Α⒉挥绊憴C(jī)體的功能容量，如進(jìn)食量、體力勞動(dòng)負(fù)荷能力等涉及到解剖、生理生化和行為方面的指標(biāo)，也不引起機(jī)體對(duì)其他環(huán)境有害因素的易感性增高。損害作用(adverse effect)所致的機(jī)體生物學(xué)改變是持久的、不可逆的，造成機(jī)體功能容量的各項(xiàng)指標(biāo)改變、維持體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)能力下降、對(duì)額外應(yīng)激狀態(tài)的代償能力降低以及對(duì)其他環(huán)境有害因素的易感性增高，使機(jī)體正常形態(tài)、生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程均受到影響，壽命縮短生物膜biomembrane定義：將細(xì)胞或細(xì)胞器與周圍環(huán)境分隔開的一層

3、半透膜。功能：將細(xì)胞或細(xì)胞器與周圍環(huán)境隔離；保持細(xì)胞或細(xì)胞器內(nèi)部理化性質(zhì)的穩(wěn)定；選擇地允許或部允許某些物質(zhì)通過(guò)，主動(dòng)攝入或排出一些物質(zhì)生物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程的機(jī)理1、被動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)1）簡(jiǎn)單擴(kuò)散：溶液中的化學(xué)物質(zhì)分子，由濃集部位向各個(gè)方向分散，直到全部分子均勻分布在溶液中。 simple diffusion:化學(xué)物質(zhì)由濃度較高部位透過(guò)生物膜向濃度較低部位分散的過(guò)程。特點(diǎn)：化學(xué)物不與膜起反應(yīng)；不消耗代謝能量；膜兩側(cè)濃度差愈大，脂溶性愈高，其簡(jiǎn)單擴(kuò)散速度快；在毒理學(xué)上，是大多數(shù)化學(xué)物透過(guò)生物膜的主要轉(zhuǎn)運(yùn)方式。簡(jiǎn)單擴(kuò)散的條件： 膜兩側(cè)存在濃度差；外來(lái)化合物有脂溶性；是非解離狀態(tài)2）濾過(guò) filtration: 膜孔濾

4、過(guò)指化學(xué)物通過(guò)細(xì)胞膜上的親水性孔道透過(guò)細(xì)胞膜的過(guò)程。親水性孔道：由嵌入脂質(zhì)雙分子層中的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)親水性氨基酸組成，不同的細(xì)胞膜，其孔徑大小不一，小腸上皮細(xì)胞4a ， 腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞為40 a。動(dòng)力：滲透壓梯度和液體靜壓。在它們的作用下，大量水及分子直徑小于孔道的化學(xué)物可經(jīng)膜孔道，透過(guò)生物膜，完成其生物轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程。2、特殊轉(zhuǎn)運(yùn)1）主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)：不溶于脂質(zhì)的親水性化合物由低濃度處透過(guò)生物膜向高濃度處移動(dòng)并引起消耗能量的過(guò)程。特點(diǎn)：逆濃度梯度轉(zhuǎn)運(yùn)；通過(guò)載體；需消耗能量；具有一定的選擇性，存在競(jìng)爭(zhēng)性抑制，可飽和；2）易化擴(kuò)散（facilitated diffusion):指某些不易溶于脂質(zhì)的親水性化

5、合物，透過(guò)生物膜由高濃度處向低濃度處轉(zhuǎn)移的過(guò)程。其機(jī)理：化合物與膜上的蛋白質(zhì)或酶構(gòu)成的載體結(jié)合（與主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)相同），只能由高向低轉(zhuǎn)移，它不需消耗代謝能量。3）膜動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)：指細(xì)胞與外界環(huán)境之間進(jìn)行的某些顆粒物或大分子物質(zhì)交換過(guò)程。 此過(guò)程需要耗能。吞噬（phagocytosis)胞飲(pinocytosis)胞吐（exocytosis）氣溶膠（aerosol)指固體或/和液體微粒穩(wěn)定地懸浮于氣體介質(zhì)中形成的分散體系，其中的氣體介質(zhì)稱為連續(xù)相，微粒稱為分散相，其成分復(fù)雜，大小不一。分布的原因1）體內(nèi)各種屏障：血腦屏障，由中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毛細(xì)血管壁構(gòu)成，為緊密融合在一起的扁平內(nèi)皮細(xì)胞，管外包裹的星形膠質(zhì)細(xì)

6、胞。胎盤屏障2）與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合a血漿中各種蛋白質(zhì)均有結(jié)合其他化學(xué)物的功能，特別是白蛋白的結(jié)合量最高。b不同的化合物與血漿蛋白質(zhì)結(jié)合的量不同，結(jié)合型的化合物由于分子量大，不能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，暫無(wú)生物效應(yīng)，不能被代謝排泄，可延緩消除過(guò)程和延長(zhǎng)化合物的毒作用。作用：兩重意義，即急性中毒的保護(hù)作用，使血液濃度降低；離開接觸后，由于血液濃度下降，貯存庫(kù)中的毒物重新就會(huì)釋放進(jìn)入血液，具有潛在的危害。主要與清蛋白濃度、結(jié)合親和力、與內(nèi)源性物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合的差異3）與組織成分的結(jié)合指組織中的一些特殊結(jié)合蛋白，包括各種蛋白質(zhì)、粘多糖、核蛋白及磷脂。特殊的親和力，co與血紅蛋白；百草枯與肺肝、腎組織：金屬硫蛋白4）脂肪

7、和骨骼中的貯存脂溶性的有機(jī)物易于分布和蓄積在脂肪組織內(nèi)；鉛、氟易于貯存在骨骼中；雙重性，降低血中毒物的濃度；重新釋放，將造成潛在的危害共氧化 ：指氫過(guò)氧化物的還原和其他底物氧化生成脂質(zhì)氫過(guò)氧化物的過(guò)程葡糖醛酸結(jié)合是ii相反應(yīng)中最普遍進(jìn)行的一種，由udp-葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶催化。谷胱甘肽結(jié)合，是由谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶催化的gsh結(jié)合反應(yīng)。它在親電子化合物解毒及自由基解毒中起著重要作用生物轉(zhuǎn)化的復(fù)雜性1)多樣性：a一種外來(lái)化合物在體內(nèi)可能有多種不同的代謝轉(zhuǎn)化途徑，生成各種不同的代謝產(chǎn)物。b同一化合物經(jīng)不同的代謝，產(chǎn)生的毒性作用可能不同c化合物在體內(nèi)的生物轉(zhuǎn)化類型取決于化合物的性質(zhì)、劑量、環(huán)境及機(jī)體的

8、因素，即影響毒性作用的因素。2）連續(xù)性：外來(lái)化合物在體內(nèi)的代謝轉(zhuǎn)化常常是多個(gè)反應(yīng)連續(xù)進(jìn)行的。3）兩重性：生物轉(zhuǎn)化的結(jié)果有解毒和增毒兩種。當(dāng)然，大多數(shù)是解毒。4） 代謝飽和:外來(lái)化合物在體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化，由酶催化進(jìn)行的，當(dāng)其濃度到一定程度，也就是說(shuō)代謝過(guò)程所需的基質(zhì)可能被耗盡；代謝酶能力有限；造成單位時(shí)間內(nèi)代謝產(chǎn)物不再隨底物增加而增加，有可能發(fā)生代謝途徑的改變，這種代謝途徑被飽和的現(xiàn)象稱代謝飽和（metablic saturation)。5)代謝酶的誘導(dǎo)與抑制:酶的誘導(dǎo)（induction)指有些外來(lái)化合物可使某些代謝酶合成增加并伴有活力增強(qiáng)的現(xiàn)象。抑制（inhibition)則是表現(xiàn)為活力下降影響

9、毒性的因素可分為四大類：毒物、機(jī)體、接觸條件及外界環(huán)境。基礎(chǔ)毒性分類：根據(jù)接觸毒物的時(shí)間長(zhǎng)短分為急性毒性、短期重復(fù)劑量毒性、亞慢性毒性、慢性毒性。相應(yīng)所進(jìn)行的觀察和評(píng)價(jià)毒效應(yīng)的試驗(yàn)即為急性毒性試驗(yàn)、短期重復(fù)劑量毒性試驗(yàn)、亞慢性毒性試驗(yàn)、慢性毒性試驗(yàn)。急性毒性作用的有關(guān)參數(shù) 以死亡為終點(diǎn)（上限參數(shù)） 絕對(duì)致死劑量或濃度（ld100 或lc100)半數(shù)致死劑量或濃度（ld50 或lc50) 最小致死劑量或濃度（mld, ld01或mlc,lc01 )最大非致死劑量或濃度（mnld, ld0或mnlc,lc0 ) 非致死性指標(biāo)為檢測(cè)終點(diǎn)（下限參數(shù)） 急性毒性loael(觀察到有害作用的最低劑量） 急

10、性毒性noael(未觀察到有害作用的劑量）為什么進(jìn)行替代試驗(yàn)？ 動(dòng)物保護(hù);降低試驗(yàn)成本;縮短試驗(yàn)周期 3r：替代，減少，優(yōu)化蓄積作用的意義1.是外源化學(xué)物產(chǎn)生亞慢性、慢性毒作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.是評(píng)價(jià)外源化學(xué)物是否可能產(chǎn)生慢性中毒的重要指標(biāo)。3.在制訂衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，蓄積毒性的大小是選擇安全系數(shù)的重要考慮因素之一。4.耐受也是蓄積毒性的表現(xiàn)之一。亞慢性、慢性毒性試驗(yàn)劑量與設(shè)組原則：設(shè)3個(gè)劑量組和1個(gè)陰性（溶劑）對(duì)照組。設(shè)及劑量時(shí)應(yīng)考慮人類的實(shí)際接觸量。高劑量：動(dòng)物表現(xiàn)出明顯的中毒效應(yīng)，不發(fā)生或僅有個(gè)別死（10% )。中間劑量：動(dòng)物出現(xiàn)輕度中毒效應(yīng)，應(yīng)相當(dāng)于最小有作用劑量水平（loael).低劑量：無(wú)

11、中毒反應(yīng),應(yīng)相當(dāng)于最大無(wú)作用劑量水平(noael)。要高于人得實(shí)際接觸水平。對(duì)照組：排除混雜因素劑量組間的組距24倍，最大不超過(guò)10倍。劑量設(shè)計(jì)參考原則和方法n 對(duì)能求出ld50的化學(xué)物： 參考同一動(dòng)物種屬品系和同一染毒途徑的短期毒性資料，最高劑量組為1/10- 1/20ld50，最低劑量至少為人體攝入量的3倍。再設(shè)中間劑量。n 對(duì)食品藥品等毒性很低的化學(xué)物：藥品以臨床用藥量的10,30,100倍（大鼠）食品以人體攝入量的100，200,300倍（大鼠）l 慢性毒性試驗(yàn):參考亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)。急性毒性作用概念及急性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)康?亞慢性毒性作用概念及亞慢性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)康?慢性毒性作用概念及慢

12、性毒性實(shí)驗(yàn)?zāi)康?蓄積毒性與蓄積系數(shù);ld50;noael;loael;adi;臟器系數(shù);食物利用率化學(xué)致癌物致癌機(jī)制：遺傳毒性致癌物+非遺傳毒性致癌物（表觀遺傳毒性致癌物）代謝角度：直接致癌物+間接致癌物（前致癌物，近致癌物，終致癌物）致癌階段：引發(fā)劑+促長(zhǎng)劑+助致癌物+完全致癌物化學(xué)致癌的三階段學(xué)說(shuō);化學(xué)致癌的機(jī)制;化學(xué)致癌物的分類;判斷化學(xué)致癌物的試驗(yàn)方法2、 選擇致突變?cè)囼?yàn)的成套觀察項(xiàng)目（test battery）配套原則：1. 多種遺傳學(xué)終點(diǎn)兼顧。2.多種物種兼顧。3.體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)配合。4.體細(xì)胞與生殖細(xì)胞兼顧。致突變?cè)囼?yàn)與致癌試驗(yàn)的關(guān)系致突變?cè)囼?yàn)是致癌短期篩檢試驗(yàn)中的一種，可檢出遺

13、傳毒性致癌物。但也能出現(xiàn)假陽(yáng)性如遺傳毒性非致癌物和假陰性如非遺傳毒性致癌物。1. 發(fā)育毒性（developmental toxicity）：指出生前后接觸有害因素，子代個(gè)體發(fā)育為成體之前誘發(fā)的任何有害影響。具體表現(xiàn)為u (1)發(fā)育生物體死亡：吸收胎、流產(chǎn)、死胎、u (2)生長(zhǎng)改變： 生長(zhǎng)遲緩：生長(zhǎng)發(fā)育指標(biāo)低于正常對(duì)照均值的2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差u (3)結(jié)構(gòu)異常：畸形，包括外觀畸形，骨骼畸形，內(nèi)臟畸形。u (4)功能缺陷：出生后個(gè)體免疫，神經(jīng)行為缺陷，兒童早期腫瘤2.發(fā)育毒理學(xué)（developmental toxicology)： 研究出生前暴露于環(huán)境有害因子導(dǎo)致的異常發(fā)育結(jié)局及有關(guān)的作用機(jī)制、發(fā)病機(jī)理、

14、影響因素和毒物動(dòng)力學(xué)等。是毒理學(xué)的重要分支之一。3.畸形（malformation）：發(fā)育生物體解剖學(xué)上形態(tài)結(jié)構(gòu)的缺陷。分為嚴(yán)重畸形和輕微畸形。嚴(yán)重畸形（major malformation）：對(duì)外觀、生理功能和（或）壽命有明顯影響輕微畸形（minor malformation）：對(duì)外觀、生理功能只有輕微影響或沒(méi)有影響。4.器官形成期（critical peroid)：從胚泡著床到硬腭閉合的時(shí)期，是畸形發(fā)生的關(guān)鍵時(shí)期，也成致畸敏感期。5.致畸物(致畸原teratogen):能引起畸形的環(huán)境因子。6.致畸作用（teratogenesis）致畸物引起畸形的過(guò)程。7.致畸性(teratogenici

15、ty）：致畸物引起畸形的能力。8.變異（variation）：同一種屬的親代和子代之間或子代的個(gè)體之間，出現(xiàn)不同程度的差異。變異由遺傳和遺傳外因素控制，或由于分化改變而引起。一般變異指小的或次要的結(jié)構(gòu)改變，一般不影響正常生理功能，也不危及生命。值得注意的變異是致畸試驗(yàn)中，有劑量效應(yīng)關(guān)系異常增多的變異。9、 胚體毒性（embryotoxicity）：外源性理化因子對(duì)孕體著床前后直到器官形成期結(jié)束時(shí)的有害影響。10、胎體毒性或胎兒毒性（fetoxicity）： 對(duì)孕體器官形成期結(jié)束以后的有害影響。 11、胚胎毒性(embryo-fetal toxicity)：胚體毒性和胎體毒性的統(tǒng)稱。一般指孕體的死亡和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，不包括結(jié)構(gòu)畸形。 12、 出生缺陷（b