1、檸檬酸循環課件1LW-1檸檬酸循環檸檬酸循環Citric Acid Cycle (TCA) 乙酰乙酰-CoA的生成的生成 檸檬酸循環反應檸檬酸循環反應 檸檬酸循環的調節檸檬酸循環的調節 乙醛酸循環乙醛酸循環- 有氧代謝的樞紐有氧代謝的樞紐 - 分解、合成兩用途徑分解、合成兩用途徑 線粒體基質中發生的、將乙酰線粒體基質中發生的、將乙酰-CoA的的2C最終氧化生成最終氧化生成CO2的一系列反應的一系列反應NP in Phys/Med 1953 for his discovery of the citric acid cycle 檸檬酸循環課件216-1 細胞呼吸的三個主要階段細胞呼吸的三個主要階段

2、乙酰乙酰-CoA生成生成 - 胞胞液液/線粒體線粒體乙酰乙酰-CoA氧化氧化(檸檬酸循環檸檬酸循環) - 線粒體基質線粒體基質(真核類真核類) - 胞液胞液(原核類原核類)電子傳遞電子傳遞 & 氧化磷酸化氧化磷酸化 - 線線粒體內膜粒體內膜(真核類真核類) - 質質膜膜(原核類原核類)檸檬酸循環課件3 酵解產生的丙酮酸首先要酵解產生的丙酮酸首先要被轉運進線粒體內，然后被轉運進線粒體內，然后才能被其脫氫酶系氧化脫才能被其脫氫酶系氧化脫羧而轉換成羧而轉換成乙酰乙酰-CoA(but not for those produced by FA or AA) qh9-3a 真核生物的檸檬酸循環真核生物的檸

3、檬酸循環 酶系分布在線粒體基質酶系分布在線粒體基質檸檬酸循環課件416-21. 乙酰乙酰-CoA的生成的生成總總反應反應 = 丙酮酸在線粒體內的丙酮酸在線粒體內的 不可逆氧化脫羧不可逆氧化脫羧丙酮酸脫氫酶復合體丙酮酸脫氫酶復合體(PDH)檸檬酸循環課件516-4- 硫辛酰基硫辛酰基的氧化態的氧化態-還原態還原態 互變可用作互變可用作H或酰基載體或酰基載體- 砷酸鹽砷酸鹽有毒：與之共價結合有毒：與之共價結合 而阻斷還原態而阻斷還原態-氧化態互變氧化態互變 丙丙酮酸脫氫酶復合體酮酸脫氫酶復合體 (PDH = 3 enzymes + 5 cofactors) E1: 丙丙酮酸脫氫酶酮酸脫氫酶 硫硫胺

4、素焦磷酸胺素焦磷酸(TPP) E2: 二二氫硫辛酰轉乙酰基酶氫硫辛酰轉乙酰基酶 硫硫辛酸辛酸, 輔輔酶酶A (CoA) E3: 二二氫硫辛酰脫氫酶氫硫辛酰脫氫酶 FAD, NAD+硫辛酸與硫辛酸與E2-Lys共價結合共價結合檸檬酸循環課件6G18.17/18 硫胺素焦磷酸是維生素硫胺素焦磷酸是維生素B1衍生物衍生物乙酰乳酸乙酰乳酸丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛 -裂解裂解 -縮合縮合噻唑環噻唑環嘧啶環嘧啶環易失去而形成高反易失去而形成高反應活性的負碳離子應活性的負碳離子(cf. Fig. 10-9)復習復習檸檬酸循環課件7巰基乙胺巰基乙胺(酰化酰化/去酰化部位去酰化部位) 泛酸泛酸 (B3)3-P-AD

5、P酯酯 CoA是泛酸衍生物是泛酸衍生物 G18.23CoA酰化形成的硫酯鍵為酰化形成的硫酯鍵為高能鍵高能鍵，在親核攻擊下要，在親核攻擊下要比氧酯更容易將酰基轉移比氧酯更容易將酰基轉移磷酸泛酰巰基乙胺磷酸泛酰巰基乙胺通常用作通常用作酰基載體酰基載體參與反應參與反應(活化酰基活化酰基)(pantos = everywhere)* Deficiencies are only for severe malnutrition(cf. Fig. 11-4)復習復習檸檬酸循環課件816-5 PDH結構結構 (牛腎細胞牛腎細胞)60 E2 = 20 trimers- 各酶拷貝數及復合體各酶拷貝數及復合體 大小

6、隨物種不同而異大小隨物種不同而異E. coli:24 E124 E212 E3自學自學檸檬酸循環課件916-6 PDH作用機制作用機制乙酰基乙酰基轉酯生成轉酯生成 乙酰乙酰-CoA和完全和完全 還原態硫辛酰基還原態硫辛酰基-為下一輪反應再生出氧化態硫為下一輪反應再生出氧化態硫辛酰基，并將底物的辛酰基，并將底物的2e傳遞給傳遞給NAD+羥乙基羥乙基氧化為氧化為乙酰基乙酰基，由半還原態，由半還原態硫辛酰基攜帶，為活化態乙酰基硫酯硫辛酰基攜帶，為活化態乙酰基硫酯(氧化能驅動高能乙酰硫酯的形成氧化能驅動高能乙酰硫酯的形成)丙酮酸脫羧生成丙酮酸脫羧生成羥乙基羥乙基-TPP(限速限速)substrate

7、channeling(cf. Fig. 11-1)檸檬酸循環課件10 TPPs role in pyruvate decarboxylationTPP負碳離子負碳離子對對丙酮酸的羰基丙酮酸的羰基C發動親核攻擊發動親核攻擊(羰基加成羰基加成)脫羧化形成的負脫羧化形成的負離子可經由噻唑離子可經由噻唑環共振穩定環共振穩定質子化形成的質子化形成的羥羥乙基乙基TPP經由堿經由堿催化而斷裂釋出催化而斷裂釋出乙醛，隨即經酸乙醛，隨即經酸催化返回催化返回TPP去質子化成去質子化成TPP負碳離子負碳離子B:(cf. p304 &Fig. 10-10)復習復習檸檬酸循環課件11小結：乙酰小結：乙酰-CoA生成生成

8、LW-2- 在在丙酮酸脫氫酶復合體丙酮酸脫氫酶復合體的催化下，糖酵解產生的丙酮酸的催化下，糖酵解產生的丙酮酸 被轉化成乙酰被轉化成乙酰-CoA，是為檸檬酸循環的起始底物，是為檸檬酸循環的起始底物- PDH復合體由復合體由三種酶三種酶的多份拷貝組成：的多份拷貝組成：丙酮酸脫氫酶丙酮酸脫氫酶E1 (+TPP)，二氫硫辛酰轉乙酰基酶二氫硫辛酰轉乙酰基酶E2 (+硫辛酸和硫辛酸和CoA)， 以及以及二氫硫辛酰脫氫酶二氫硫辛酰脫氫酶E3 (+FAD和和NAD+)- E1先催化丙酮酸先催化丙酮酸脫羧脫羧生成羥乙基生成羥乙基-TPP，然后將羥乙基，然后將羥乙基 氧化氧化成乙酰基，移除的成乙酰基，移除的e將結

9、合在將結合在E2上的硫辛酰上的硫辛酰-S-S- 還原還原，并將乙酰基在兩個，并將乙酰基在兩個-SH之一上之一上酯化酯化成硫酯成硫酯- E2催化乙酰基催化乙酰基轉酯轉酯給給CoA而生成乙酰而生成乙酰-CoA- E3催化硫辛酰氧化態二硫橋的催化硫辛酰氧化態二硫橋的再生再生，e則依次傳遞給則依次傳遞給 FAD和和NAD+檸檬酸循環課件124C縮縮合合6C2C氧氧化脫羧化脫羧5C氧氧化脫羧化脫羧4C= 八步酶促反應八步酶促反應- 四步四步氧化反應氧化反應將能量高效將能量高效 儲存在儲存在NADH和和FADH2中中底底物水平磷酸化物水平磷酸化P30-112. 檸檬酸循環檸檬酸循環異構異構(脫水脫水-水合

10、水合)脫氫脫氫水合水合脫氫脫氫再生再生草酰乙酸草酰乙酸在該酶系反應中在該酶系反應中 底物底物(被消耗被消耗) 輔助因子輔助因子(可再生可再生)檸檬酸循環課件13P30-12反應反應 乙酰乙酰-CoA與草酰乙酸縮合成檸檬酸與草酰乙酸縮合成檸檬酸- 檸檬酸合酶檸檬酸合酶- 乙酰基乙酰基甲基甲基C與草酰與草酰 乙酸乙酸C2羰基羰基縮合縮合- 生成酶結合中間物生成酶結合中間物 檸檬酰檸檬酰-CoA反應機制反應機制 (cf. p309)其高能硫酯鍵水解使其高能硫酯鍵水解使反應不可逆反應不可逆Pro-C*檸檬酸循環課件1416-9The mechanism for citrate synthase rea

11、ctionEssentially a Claisen condensation, involving a thioester (acetyl-CoA) & a ketone (oxaloacetate)H2OCoA自學自學(cf. Fig. 11-6)檸檬酸循環課件15P30-13- 烏烏頭酸酶頭酸酶 (烏烏頭酸水合酶頭酸水合酶)- 反反應應 = 脫脫水水+水合水合- 凈凈效應效應 = H與與OH互換互換 (for a new carbonyl group: 3rd 2nd alcohol)反應反應 檸檬酸經由順檸檬酸經由順-烏頭酸異構化成異檸檬酸烏頭酸異構化成異檸檬酸less than 10

12、% at pH 7.4 & 25 因因異檸檬酸被快速消耗而異檸檬酸被快速消耗而使該反應能使該反應能正向進行正向進行Pro-C*檸檬酸循環課件1616-10iron-sulfur center in aconitase Role = both in binding of substrate at active site & in catalytic addition or removal of H2O* *prochiral Cbut aconitase can identify its two different carboxymetheyl groupshelpful for putting

13、 citrate in active site自學自學(cf. p311 for KDHsreaction & Fig. 11-7)檸檬酸循環課件17P30-14反應反應 異檸檬酸氧化脫羧成異檸檬酸氧化脫羧成 -酮戊二酸酮戊二酸- 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶- 1st次次脫氫脫氫(NADH)- 1st次次(氧化氧化)脫羧脫羧反應機制反應機制 (cf. p311, as for 6-P-葡糖酸葡糖酸-D)草酰琥珀酸草酰琥珀酸為不穩定酮酸，容易脫羧為不穩定酮酸，容易脫羧有助于穩定脫羧后短有助于穩定脫羧后短暫形成的暫形成的烯醇烯醇中間物中間物氧化氧化脫羧脫羧重排重排NADP依賴性酶依賴性酶主要分布

14、于胞液主要分布于胞液檸檬酸循環課件18P30-15- -酮酮戊二酸脫氫酶戊二酸脫氫酶 (KDH, PDH in Fig. 11-1)- 2nd次次脫氫脫氫(NADH)- 2nd次次(氧化氧化)脫羧脫羧- -酮戊二酸酮戊二酸氧化的能量部分被儲存于琥珀酰氧化的能量部分被儲存于琥珀酰-CoA的的硫酯鍵硫酯鍵中中反應反應 -酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酰酮戊二酸氧化脫羧成琥珀酰-CoA(KDH)檸檬酸循環課件19P30-16- 琥珀酰琥珀酰-CoA合成酶合成酶 (琥琥珀酸硫激酶珀酸硫激酶)- 硫酯鍵硫酯鍵的斷裂被用于驅動的斷裂被用于驅動GTP (animal) 或或ATP中中磷酸酐鍵的形成磷酸酐鍵的形成=

15、以以NTP形式保存能量的形式保存能量的底物水平磷酸化底物水平磷酸化反應反應 琥珀酰琥珀酰-CoA轉化成琥珀酸轉化成琥珀酸盡管其盡管其 -磷酰基很容磷酰基很容易轉移給易轉移給ADP以形成以形成ATP，但其主要功能，但其主要功能還是還是用作蛋白質合成用作蛋白質合成中的磷酰基供體中的磷酰基供體檸檬酸循環課件2016-12琥珀酰琥珀酰-CoA合成酶合成酶反應機制反應機制A phosphoryl group replaces CoA in succinyl-CoA bound to enzyme, forming a high-energy acyl phosphateSuccinyl phosphat

16、e donates its phosphoryl group to enzymes His246, forming a high-energy phosphohistidyl enzymeThe phosphoryl group is transferred from His246 to GDP/ADP, forming GTP/ATP.琥珀酰琥珀酰-P-E磷酰磷酰-His-E自學自學 磷酸解磷酸解(cf. Fig. 11-8)檸檬酸循環課件21P30-17a- 琥珀酸琥珀酸脫氫酶脫氫酶- 該循環中該循環中惟一惟一(共價共價)結合在線粒體結合在線粒體 內膜或質膜上的酶，具有內膜或質膜上的酶，具

17、有3個個Fe-S 中心簇和中心簇和1個個共價結合共價結合的的FAD- 3rd次脫氫次脫氫(FADH2)反應反應 琥珀酸氧化成延胡索酸琥珀酸氧化成延胡索酸強強烈烈抑抑制制丙二酸丙二酸(with stronger oxidant FAD)檸檬酸循環課件22p612b反應反應 延胡索酸水合生成延胡索酸水合生成L-蘋果酸蘋果酸- 延胡索酸延胡索酸(水合水合)酶酶- 反式反式雙鍵水合雙鍵水合 = 反式反式添加添加OH和和H+馬來酸馬來酸(順丁烯二酸順丁烯二酸)負碳離子負碳離子轉化態轉化態該酶具有高度立體特異性該酶具有高度立體特異性檸檬酸循環課件23Two possible mechanisms for

18、the fumarase reaction18O exchange experiment proved this is the true storyG20.18protonation of double bond to form an intermediate carbonium ion- 正碳離子機制正碳離子機制- 負碳離子機制負碳離子機制attacked by H2O or OH to give a carbanion, followed by protonation復習復習檸檬酸循環課件24P30-18- 蘋果酸蘋果酸脫氫酶脫氫酶- 雖然雖然平衡大大有利于逆行，但由于草酰乙酸持續被平衡大

19、大有利于逆行，但由于草酰乙酸持續被高度放能的高度放能的 檸檬酸合酶反應檸檬酸合酶反應所移除，所移除，該該反應在完整細胞中仍為正向進行反應在完整細胞中仍為正向進行- 4th次次脫氫脫氫(NADH)反應反應 L-蘋果酸氧化成草酰乙酸蘋果酸氧化成草酰乙酸OAA 106M檸檬酸循環課件2516-13 檸檬酸循環結算檸檬酸循環結算總總反應：反應：Acetyl CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 2 H2O 2 CO2 + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP + CoA相當于相當于檸檬酸循環課件26t16-1葡萄糖有氧氧化全程中的輔酶還原及葡萄糖有氧氧化全程

20、中的輔酶還原及ATP生成總結算生成總結算(cf. Tab. 11-2)檸檬酸循環課件27H12.5The plane of symmetry of succinate means that the 2 halves of the molecule are chemically equivalent; thus, carbon atoms from acetyl CoA are uniformly distributed in the 4-C intermediates leading to oxaloacetate. Carbon atoms from acetyl CoA that ente

21、r in one turn of the cycle are thus lost as CO2 only in the 2nd and subsequent turns.檸檬酸循環檸檬酸循環 每輪循環中釋出的并非該輪反應每輪循環中釋出的并非該輪反應 開始時以乙酰基形式進入的開始時以乙酰基形式進入的2C自學自學(cf. p315)檸檬酸循環課件2820-5 (3rd)通過通過TCA循環后循環后總會有總會有2C以以CO2的形式脫下，的形式脫下，不能不能凈產生草酰乙酸凈產生草酰乙酸無論其來源如何，無論其來源如何，乙酰乙酰-CoA都不能都不能在動物體內在動物體內用作為用作為糖異生的前體糖異生的前體檸檬

22、酸循環課件2916-15 回補反應可以補充回補反應可以補充 檸檬酸循環中間物檸檬酸循環中間物- 各中間物被合成途徑各中間物被合成途徑 抽調用作前體的速率抽調用作前體的速率 一般與回補速率處于一般與回補速率處于 動態平衡動態平衡- 脊椎類肝、腎的主要脊椎類肝、腎的主要 回補反應為回補反應為丙酮酸羧丙酮酸羧 化化(乙酰乙酰-CoA可別構可別構 激活該酶激活該酶TCA加速加速)Anaplerotic Reactions(cf. p317)(cf. Fig. 11-10)檸檬酸循環課件3016-16 丙酮酸羧化酶作用機制丙酮酸羧化酶作用機制(輔基生物素輔基生物素=1C載體載體)- 1st階段階段()

23、碳酸氫鹽在活性碳酸氫鹽在活性 位點位點1被活化為被活化為 CO2并用于使生并用于使生 物素羧化物素羧化- 2nd階段階段() CO2在活性位點在活性位點2 被重新釋出并與被重新釋出并與 丙酮酸縮合成草丙酮酸縮合成草 酰乙酸酰乙酸Avidin可與之結合可與之結合而阻斷其吸收而阻斷其吸收復習復習檸檬酸循環課件31LW-3小結：檸檬酸循環小結：檸檬酸循環- 該循環是一種幾乎存在于所有物種的該循環是一種幾乎存在于所有物種的中心異化途徑中心異化途徑， 其其酶系酶系在真核和原核類分別位于線粒體和胞液中；在真核和原核類分別位于線粒體和胞液中； 糖、脂及蛋白降解而得的各種化合物都能通過該途徑糖、脂及蛋白降解而

24、得的各種化合物都能通過該途徑 最終氧化成最終氧化成CO2 - 循環由循環由八步連續反應八步連續反應組成：從組成：從乙酰乙酰-CoA與與草酰乙酸草酰乙酸 縮合成縮合成檸檬酸檸檬酸開始，逐步將其轉化回草酰乙酸，期間開始，逐步將其轉化回草酰乙酸，期間 經由兩步氧化脫羧釋出經由兩步氧化脫羧釋出 2CO2；乙酰基氧化釋放出的；乙酰基氧化釋放出的 能量分別儲存于能量分別儲存于 3 NADH、1 FADH2和和 1 GTP/ATP- 該循環為該循環為異化異化/同化兩用同化兩用途徑：任何可以轉化成循環中途徑：任何可以轉化成循環中 4C/5C中間物的化合物都能經由該循環被氧化，而各中間物的化合物都能經由該循環被

25、氧化，而各 中間物亦可用作多種生物合成的反應前體；由中間物亦可用作多種生物合成的反應前體；由丙酮酸丙酮酸 羧化酶羧化酶等催化的等催化的填補反應填補反應可以補充被調用的中間物可以補充被調用的中間物檸檬酸循環課件3216-18 通過對通過對丙酮酸脫氫酶復丙酮酸脫氫酶復 合體的合體的別構抑制別構抑制和和激活激活 以調控進入循環的以調控進入循環的 乙酰乙酰-CoA流量流量 循環酶系的循環酶系的產物抑制產物抑制， 主要為三步高放能反應：主要為三步高放能反應： - 檸檬酸合酶檸檬酸合酶 - 異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶 - -酮戊二酸脫氫酶復合體酮戊二酸脫氫酶復合體(cf. p320 & Fig. 11-

26、12)3. 檸檬酸循環的調節檸檬酸循環的調節提供最適提供最適ATP & NADH檸檬酸循環課件33G20.28= 植物和細菌中的檸檬酸循環支路植物和細菌中的檸檬酸循環支路凈凈轉化：轉化：2 乙乙酰酰-CoA + NAD+琥琥珀酸珀酸 + 2 CoA + NADH + H+(4C)1st個個乙酰乙酰-CoA2nd個個乙酰乙酰-CoA蘋果酸蘋果酸合酶合酶異檸檬酸異檸檬酸裂合酶裂合酶乙醛酸乙醛酸脊椎動物缺乏脊椎動物缺乏- 乙酸鹽乙酸鹽在植物、某些在植物、某些 低等無脊椎動物和微低等無脊椎動物和微 生物中既可用作富能生物中既可用作富能 燃料，亦可用作糖類燃料，亦可用作糖類 合成所必需的合成所必需的PEP源源(cf. Fig. 11-11)4. 乙醛酸循環乙醛酸循環檸檬酸循環課件34 乙醛酸循環與檸檬酸乙醛酸循環與檸檬酸 循環之間的相關聯系循環之間的相關聯系- 通過繞行檸檬酸循環中通過繞行檸檬酸循環中 兩步脫羧反應，乙醛酸兩步脫羧反應，乙醛酸 循環可由循環可由 2 乙酰乙酰-CoA 凈得凈得 1 琥珀酸琥珀酸/草酰乙酸草酰乙酸- 經由經由琥珀酸琥珀酸在這兩個在這兩個 循環間的中介，植物循環間的中介，植物 即可將脂肪氧化產物即可將脂肪氧化產物 轉