1、基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程細菌染色技術細菌染色技術基礎生物學實驗（三）基礎生物學實驗（三）基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程目的要求目的要求1. 學習微生物涂片，染色的基本技術，掌握學習微生物涂片，染色的基本技術，掌握細菌的染色法。細菌的染色法。2. 初步認識細菌的形態特征。初步認識細菌的形態特征。3. 鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操鞏固顯微鏡（油鏡）的使用方法和無菌操作技術。作技術。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程微生物染色的染料微生物染色的染料 是一類苯環上帶有發色基團和助色基團的是一類苯環上帶有發色基團和助色基團的有機化合物。有機化合物。 染

2、料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料染料通常都是鹽，分酸性染料和堿性染料兩大類。兩大類。 在微生物染色中，堿性染料較常用，如常在微生物染色中，堿性染料較常用，如常用的美藍（即亞甲藍）、結晶紫、堿性紫用的美藍（即亞甲藍）、結晶紫、堿性紫復紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于復紅、番紅（即沙黃）、孔雀綠等都屬于堿性染料。堿性染料。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程v在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞在中性、堿性或弱酸性溶液中，細菌細胞通常帶負電荷；通常帶負電荷；v而堿性染料在電離時，其分子的染色部分而堿性染料在電離時，其分子的染色部分帶正電荷；帶正電荷；v帶正電荷的堿性染料染色部分很容易與

3、帶帶正電荷的堿性染料染色部分很容易與帶負電荷細菌細胞結合使細菌染色。負電荷細菌細胞結合使細菌染色。微生物染色原理微生物染色原理基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程材材 料料1. 菌種菌種 2. 染色劑染色劑3. 儀器或其他用具：儀器或其他用具： 顯微鏡顯微鏡 酒精燈酒精燈 載玻片載玻片 接種環接種環 香柏油香柏油 酒精酒精+乙醚乙醚 擦鏡紙擦鏡紙 生理鹽水等。生理鹽水等。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程涂片涂片干燥干燥固定固定染色染色水洗水洗鏡檢鏡檢簡單染色方法簡單染色方法干燥干燥基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程革蘭氏染色革蘭氏染色 菌種菌種: : 參考菌：參考

4、菌：g+：staphylococcus aureus, g-: escherichia coli 儀器儀器 顯微鏡；顯微鏡； 材料材料 載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，載玻片，香柏油，二甲苯，擦鏡紙，吸水紙，染色缸等。吸水紙，染色缸等。 染料染料 草酸銨結晶紫染色液，路哥氏草酸銨結晶紫染色液，路哥氏(lugol)(lugol)碘液，碘液，95%95%乙醇，乙醇，0.5%0.5%番紅染色液；番紅染色液；基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程革藍氏陽性和陰性菌細胞壁成分比較革藍氏陽性和陰性菌細胞壁成分比較成分成分 占細胞壁干重的占細胞壁干重的% 革藍氏陽性菌革藍氏陽性菌 革藍氏陰性菌革藍氏陰

5、性菌肽聚糖肽聚糖 含量很高（含量很高（50-9050-90） 含量很低（含量很低（1010）磷壁酸磷壁酸 含量較高（含量較高（5050） 無無類脂質類脂質 一般無（一般無（ 2 2） 含量較高（含量較高（2020）蛋白質蛋白質 無無 含量較高含量較高基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程革藍氏染色的意義革藍氏染色的意義 細菌分類鑒定細菌分類鑒定 指導臨床用藥指導臨床用藥基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程微生物分類鑒定的特征微生物分類鑒定的特征v形態學形態學和生理生化特征和生理生化特征v血清學實驗和噬菌體分型血清學實驗和噬菌體分型v氨基酸序列和蛋白質分析氨基酸序列和蛋白質分析v核

6、酸堿基組成和序列分析核酸堿基組成和序列分析基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程形態學特征形態學特征v培養特征、菌落的形狀、大小、顏色、表培養特征、菌落的形狀、大小、顏色、表面特征、光澤等面特征、光澤等v細胞形態：形狀、大小、排列方式細胞形態：形狀、大小、排列方式v特殊結構：鞭毛、芽孢、孢子、莢膜等特殊結構：鞭毛、芽孢、孢子、莢膜等v細胞內涵物細胞內涵物v染色反應：革藍氏染色、抗酸性染色染色反應：革藍氏染色、抗酸性染色v運動性運動性基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程方法方法v涂片涂片v初染初染v媒染媒染v脫色脫色v復染復染v鏡檢鏡檢基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程涂

7、片涂片v要用活躍生長期的幼培養物作革蘭氏染色要用活躍生長期的幼培養物作革蘭氏染色; ;v注意練習無菌操作；注意練習無菌操作；v在載玻片上滴半滴生理鹽水；在載玻片上滴半滴生理鹽水；v取菌不要貪多，接種環上肉眼可見菌苔痕取菌不要貪多，接種環上肉眼可見菌苔痕跡即可；跡即可；v菌苔在生理鹽水中涂片要均勻，局部不宜菌苔在生理鹽水中涂片要均勻，局部不宜過厚過厚, ,以免脫色不完全造成假陽性。以免脫色不完全造成假陽性。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程 初染初染 將玻片置于玻片擱架上，加草酸將玻片置于玻片擱架上，加草酸銨結晶紫染色液銨結晶紫染色液( (加量以蓋滿菌膜為度加量以蓋滿菌膜為度) )，染

8、色染色1-2min1-2min。傾去染色液，用自來水小心。傾去染色液，用自來水小心地沖洗。地沖洗。 媒染媒染 滴加滴加(lugol)(lugol)碘液，染碘液，染1-2min1-2min，水，水洗。洗。 脫色脫色 滴加滴加95%95%乙醇，脫色乙醇，脫色20-25s20-25s立即水立即水洗，以終止脫色。洗，以終止脫色。 復染復染 滴加蕃紅，染色滴加蕃紅，染色2-3min2-3min，水洗。，水洗。最后用吸水紙輕輕吸干。最后用吸水紙輕輕吸干。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程 干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為干燥后，置油鏡觀察。被染成紫色者即為革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌(g )；被

9、染成紅色者是；被染成紅色者是革蘭革蘭氏陰性菌氏陰性菌(g-)。 基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程革蘭氏陰性菌革蘭氏陰性菌基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程革蘭氏陽性菌革蘭氏陽性菌基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程作業作業 實驗報告實驗報告基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程1、涂片、涂片1.取一塊干凈的載玻片平放在載玻片架上，在載取一塊干凈的載玻片平放在載玻片架上，在載玻片中央滴一滴生理鹽水（或蒸餾水）；玻片中央滴一滴生理鹽水（或蒸餾水）；2.無菌操作無菌操作從試管中生長有瓊脂斜面上挑取少許從試管中生長有瓊脂斜面上挑取少許菌苔；菌苔；3.將挑取的菌苔沾入

10、載玻片中央生理鹽水中混勻將挑取的菌苔沾入載玻片中央生理鹽水中混勻并涂成薄膜。并涂成薄膜。注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不注意：載玻片要潔凈無油跡；滴生理鹽水和取菌不宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。宜過多；涂片要涂抹均勻，不宜過厚。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程2、干燥、干燥v 將涂好菌膜的載玻片平放在載玻片架上，將涂好菌膜的載玻片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥。室溫下自然干燥。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程3、固定、固定v手持已經自然干燥的涂好菌膜的載玻片，手持已經自然干燥的涂好菌膜的載玻片，涂面朝上，在酒精燈火焰上通過涂面朝上，在酒精燈火焰上通過2

11、 23 3次，熱次，熱固定細菌細胞。固定細菌細胞。原理：加熱使細菌細胞的蛋白質凝固、使細原理：加熱使細菌細胞的蛋白質凝固、使細菌細胞質凝固，從而固定細菌細胞形態，菌細胞質凝固，從而固定細菌細胞形態，并使之牢固附著在載玻片上。并使之牢固附著在載玻片上。注意：熱固定溫度不宜過高，否則會改變甚注意：熱固定溫度不宜過高，否則會改變甚至破壞細胞形態。至破壞細胞形態。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程4、染色、染色v將將熱固定的細菌熱固定的細菌涂片平放于在載玻片架上，涂片平放于在載玻片架上，滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄滴加染液于涂片上（染液剛好覆蓋涂片薄膜為宜）。膜為宜）。v染色時間：染

12、色時間：呂氏堿性美藍染色呂氏堿性美藍染色12min；石炭酸復紅染色約石炭酸復紅染色約1min草酸銨結晶紫染色約草酸銨結晶紫染色約1min。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程5、水洗、水洗v將將細菌細菌涂片上染液倒入廢液缸中；涂片上染液倒入廢液缸中；v手持手持細菌染色細菌染色涂片，置于廢液缸上方，用涂片，置于廢液缸上方，用洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無洗瓶中自來水沖洗涂片，直至流下的水無色為止。色為止。注意：水洗時，不要直接沖洗涂面，而應使注意：水洗時，不要直接沖洗涂面，而應使水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，水從載玻片的一端流下。水流不宜過急，過大，以免涂片薄膜脫落。過大，以

13、免涂片薄膜脫落。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程6、干燥、干燥v自然干燥：將染好色的細菌涂片平放在載自然干燥：將染好色的細菌涂片平放在載玻片架上，室溫下自然干燥；玻片架上，室溫下自然干燥；v吹干：將染好色的細菌涂片平放在載玻片吹干：將染好色的細菌涂片平放在載玻片架上，用電吹風冷風或低溫熱風吹干；架上，用電吹風冷風或低溫熱風吹干；v吸干：將染好色的細菌涂片平放在一張吸吸干：將染好色的細菌涂片平放在一張吸水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細菌涂水紙上，上面覆蓋一張吸水紙，將細菌涂片兩面水分吸干。片兩面水分吸干。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程7、鏡檢、鏡檢 涂片干后鏡檢。涂片干后鏡檢。 注意：涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀注意：涂片必須完全干燥后才能用油鏡觀察。察。 防止水的折射，以便于觀察。防止水的折射，以便于觀察。基礎生物學實驗基礎生物學實驗精品課程精品課程microbiological ste