1、大腸桿菌感受態細胞的制備 標簽： tr.,Ca.,co. 分類： 細胞技術 感受態細胞 來源： 實驗管理實驗概要 大腸桿菌感受態細胞的 CaCl2 法制備及質粒轉化 實驗原理 處于對數生長期的細菌經 CaCl2 處理后接受外源 DNA 的能力顯著增加。細菌處于容易吸 收外源 DNA 的狀態叫感受態。 在自然條件下， 很多質粒都可通過細菌接合作用轉移到新的宿主內， 但在人工構建的質粒載 體中，一般缺乏此種轉移所必需的 mob 基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞 的接合轉移。 如需將質粒載體轉移進受體細菌， 需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態， 以 攝取外源 DNA 。 轉化( Tran

2、sformation )是將外源 DNA 分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種 手段，它是微生物遺傳、 分子遺傳、 基因工程等研究領域的基本實驗技術。 轉化過程所用的 受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體 ( R-,M- )，它可以容忍外源 DNA 分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些 特殊方法(如電擊法， CaCl2 ，RbCl(KCl) 等化學試劑法)的處理后，細胞膜的通透性發生 了暫時性的改變，成為能允許外源 DNA 分子進入的感受態細胞 ( Compenent cells )。進入 受體細胞的 DNA 分子通過復制、 表達實現

3、遺傳信息的轉移， 使受體細胞出現新的遺傳性狀。 將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子( Transformant ，即帶有異 源 DNA 分子的受體細胞)。目前常用的感受態細胞制備方法有 CaCl2 和 RbCl(KCl) 法， RbCl(KCl) 法制備的感受態細胞轉化效率較高，但 CaCl2 法簡便易行，且其轉化效率完全可 以滿足一般實驗的要求， 制備出的感受態細胞暫時不用時， 可加入占總體積 15%的無菌甘油 于-70 C保存(半年)， 因此 CaCI2法使用更廣泛。 主要試劑 (1) 0.1moI/L CaCI2 溶液 (2) LB 液體培養基 (3) 30% 甘油：

4、 30mL 甘油溶于 100mL 蒸餾水，高壓滅菌。 主要設備 (1) 超凈工作臺 (2) 冷凍離心機 (3) 恒溫搖床 70 C冰箱 (5) 10mL 移液管 (6) 吸耳球 (7) 1mL、200 yL移液槍(配套槍頭) (8) 50mL 離心管 (9) 1.5mL 離心管 實驗材料 (1) 大腸桿菌 DH5a (R-, M- , Amp-) 實驗步驟 (一) 受體菌的培養 (1)從 LB 平板上挑取新活化的 E. coli DH5 單菌落，接種于 35mL LB 液體培養基中，37 C 下振蕩培養過夜( 12h 左右)。 將該菌種懸液以 1:100 的比例接種，取 250 yL菌液轉接到

5、 25mL LB 液體培養基中，37 C 振蕩培養 23h至 OD600 = 0.5 左右。 (二) 感受態細胞的制備(注意：以下操作在超凈工作臺完成。) (1) 將菌液轉入 50mL 離心管中，冰上放置 10min 。 (2) 在 4 C下，4000r/min 離心 10min。棄去上清，將管倒置 1min 以便培養液流盡。 (3) 用冰上預冷的 0.1mol/L 的 CaCl2 溶液 10mL 輕輕懸浮細胞，冰上放置 30min 。 04 C 4000r/min 離心 10min，棄去上清，加入 2mL 預冷的 0.1mol/L 的 CaCI2 溶液， 輕輕懸浮細胞，冰上放置(務必冰上放置

6、)。 (注意：以上操作完成了新鮮感受態細胞的制 備) (三) 感受態細胞的分裝與凍存 (1) 在 2mL 制備好的感受態細胞中加入 2mL30% 甘油(即 1:1 體積，甘油終濃度 15%)。 (2) 將此感受態細胞分裝成每份 200 y L (1.5mL dorf 管)，液氮速凍，快速轉入-70 C冰箱保 存。(如果沒有液氮，可以將分裝的感受態細胞直接轉入 -70 C冰箱保存。) 注意事項 、細胞的生長狀態和密度 最好從-70 C或-20 C甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。不要用已 經 過多次轉接，及貯存在 4 C的培養菌液。細胞生長密度以每毫升培養液中的細胞數在 5X10

7、7 個左右為佳。即應用對數期或對數生長前期的細菌，可通過測定培養液的 OD600 控制。對 TG1 菌株，OD600 為 0 . 5 時，細胞密度在 5X107 個/ml 左右。(應注意 OD600 值與細 胞數之間的關系隨菌株的不同而不同)。密度過高或不足均會使轉化率下降。 此外，受體 細胞一般應是限制 -修飾系統缺陷的突變株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變株。并 且受體細胞還應與所轉化的載體性質相匹配。 、試劑的質量 所用的 CaCI2 等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于 4 C。 、防止雜菌和雜 DNA 的污染 整個操作過程均應在無菌條件下進行，所用器皿， 如

8、離心管， 移液槍頭等最好是新的， 并經 高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、 DNA 酶或雜 DNA 所污染， 否則均會影響轉化效率或雜 DNA 的轉入。 、整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。 人人都愛 protocol 。 蛋白的純化 1. 菌液離心 取出三角瓶，倒入離心管中 離心(6000rpm,10min,4 C )，離心之后，倒去上清. 2. 細胞重懸 加上 2mL 的 lysis buffer 洗沉淀 ,重懸細胞 . lysis buffer 配方是 HEPES (2M,PH 7.0)200 卩隔 cl (4M) 500 卩 IDTT

9、3 卩 IBrij 100 卩 I, PMSF 200 卩 l,H2O 19ml,共 20ml 體系. 3 .初步溶解 加入溶菌酶 20 卩1 (100mg/ml )于重懸液中，然后冰浴 20min.再用 1.5ml EP 管分裝. 4. 冷凍 將分裝后的菌體放入-80 C冰箱里冷凍約 20min （或者使用液氮快速冷凍細胞懸液）后 ，取 出待其融化。 5. 細胞破碎 融化之后破碎細胞 ，用超聲波細胞粉碎機破碎 ，每次 10s， interval 20s， 20 次.若量大可用壓榨 機來破碎 . 6. 離心 離心細胞破碎液，12500rpm,1h,4 C，然后收集上清并轉另一個 1.5ml 管

10、再加 100 卩 I 1M Tris -HCl buffer（PH 8.0） 到上清中。（堿性有利于蛋白的獲得）可以先放 -80. 7. 純化上清 準備 Ni 柱 在試管中加上空柱，緩慢滴加 300 1的 Ni 柱于空柱中，待其完全沉淀（每 300 1樹脂液中有 5%Ni-NTA agnose ）。再用 2ml 的 AT buffer 平衡柱子（大約 1h ）。 AT buffer 配方： Tris- HCI 1M PH8.0 1000 卩 l，NaCI 4M 1000 卩 I，Brij 20 卩 I，DTT 3 卩 I，H2O 18ml. 上樣 加 2mI 上清到 Ni 柱中 ，并用 2mI

11、 AT buffer 沖洗 .（注意緩慢滴加 ） 洗脫樣品 加上 1ml 的 salt washing buffer 沖洗，其配方是 AT buffer 8mI,NaCI 5M 2mI,Brij 100 卩 I. 再加上 1mI 的 ImidazoIe buffer （AT buffer 9.8mI ，ImidazoIe 1M 0.2mI ）沖洗 ，洗去非特 異性蛋白。 再洗脫目的蛋白 用 300 1的 Elution buffer 沖洗，獲得所需的特異性蛋白 .Elution buffer 配方：AT buffer 7.5mI，ImidazoIe 1M 2.5mI. 8. 純化細胞破碎液的沉

12、淀 用 urea buffer 重懸細胞沉淀，在常溫溫育 1h,再離心（12500rpm 1h 4 C）,收集上清，重復上 清純化步驟.urea buffer 的配方是 Tris- HCI 1M PH8.0 1000 卩 I,NaCI 4M 1000 卩 I, Brij 20 卩 I, DTT 3 I, urea 8M 18ml.其余 buffer 均用 urea buffer 來配置. 9.SDS-PAGE 的鑒定 配膠（根據此蛋白的大小（55KD ），配置 12%的膠） 下 層 膠 的 配 方 :Acr/Bis 4.44ml, 下 層 膠 緩 沖 液 PH8.8 3.75ml,TEMED7

13、 卩 l,10%APS75 卩 l,ddH2O6.8ml. 上 層 膠 的 配 方 是 : Acr/Bis0.75ml, 上 層 膠 緩 沖 液 PH6.8 1.5ml,TEMED 4 卩 l,10%APS37.5 卩 l,ddH2O3.75ml. 配置樣品 每管加樣品 2 卩 l,5 x loading buffer 4 畫加 ddH2O 補全 20 卩 1 體系.混合好 loading buffer 和樣品后，在 100 C下煮約 5min,然后置室溫下冷卻后上樣。 樣品 1 ：純化上清；樣品 2 ：純化沉淀； 對照 1 ：未純化上清；對照 2 ：未純化沉淀；對照 3：標準甘油激酶 上樣

14、添加樣品 上樣 20 卩 I,同時加上 Marker,10 卩 l. 電泳 加上足夠的電泳緩沖液 （1 x ）,要加在兩板內外 ,一定要浸沒過板 ,形成電流通路 .調好電壓進行 電泳約 1h后,loading buffer 條帶跑到底，便可停止. 考馬斯亮藍染色 將電泳后的 PAGE 膠取下放入容器中 ,加入 50ml 雙蒸水或去離子 水,加熱至沸騰后停止 繼續在脫色搖床上搖動 5min, 棄去水溶液 . 加上染色液 ,以浸沒膠面為準 ,加熱沸騰后保持狀態 30-60s, 停止加熱后繼續在脫色搖床 上搖動 10min, 棄去染色液 . 加入約 50ml 的水 ,再加熱至沸騰后保持沸騰狀態 30

15、-60s, 停止加熱后在搖床上要 5-10min, 換水可完成脫色 若要得到無背景的染色膠 ,可重復脫色步驟或將膠放在水中過夜 鎳柱。 用不同濃度的咪唑洗脫。 因為咪唑和組氨酸都帶正電， 可在咪唑逐漸加大濃度的條件 下洗脫目的蛋白。 protocol 里有啊。 分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質： 1）分子大小； 2）溶 解度； 3）電荷； 4）吸附性質； 5）對其它分子的生物學親和力等進行分離 . 常見的分離提純蛋白質的方法有： 1、鹽析與有機溶劑沉淀 ：在蛋白質溶液中加入大量中性 鹽 ,以破壞蛋白質的膠體性質 ,使蛋白質從溶液中沉淀析出 ,稱為鹽析 .常用的中性鹽

16、有：硫酸 銨、氯化鈉、硫酸鈉等 .鹽析時 ,溶液的 pH 在蛋白質的等電點處效果最好 .凡能與水以任意比 例混合的有機溶劑 ,如乙醇、甲醇、丙酮等 ,均可引起蛋白質沉淀 .2、電泳法 ：蛋白質分子在 高于或低于其 pI 的溶液中帶凈的負或正電荷 ,因此在電場中可以移動 .電泳遷移率的大小主要 取決于蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小 .3、透析法 ：利用透析袋膜的超濾性質 ,可將大分 子物質與小分子物質分離開 .4、層析法 ：利用混合物中各組分理化性質的差異 ,在相互接觸的 兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離 .主要有離子交換層析 ,凝膠層析 ,吸附層 析及親和層析等 ,其中凝膠層析

17、可用于測定蛋白質的分子量 .5、分子篩 ：又稱凝膠過濾法 ,蛋 白質溶液加于柱之頂部 ,任其往下滲漏 ,小分子蛋白質進入孔內 ,因而在柱中滯留時間較長 ,大 分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出 ,因此不同大小的蛋白質得以分離 .6、超速離心： 利用物 質密度的不同 ,經超速離心后 ,分布于不同的液層而分離 .超速離心也可用來測定蛋白質的分 子量，蛋白質的分子量與其沉降系數 S 成正比 蛋白純化過程中 ,過完柱子后的上清稱為什么 ? 我們稱為流穿液 . 蛋白過鎳柱純化的原理和步驟是什么？ Ni 柱中的氯化鎳可以與有 His （組蛋白）標簽的蛋白結合 ，也可以與咪唑結合 步驟是：過柱子前可以選擇 N

18、i 柱重生 ，也就是往柱子里倒氯化鎳 ，一個柱長體積就行了 ，然后 平衡柱子，拿你自己的 buffer,給蛋白提供最適的環境，我一般平衡 4 個柱長，然后蛋白上樣，你可 以讓他自己掛 ，這樣掛柱子的效果好一些 ，如果流速太慢 ，可以加個恒流泵 ，但是一定不能太快 ， 太快掛柱效果差 ，當然你也可以選擇循環掛柱 ，就是恒流泵的一頭接你裝蛋白的燒杯 ，從柱子 中留下來的液體還用同一個燒杯接回去 .掛完之后 ，按理想來講 ，你的蛋白在 Ni 柱中與 Ni 就結 合了，雜蛋白多數在燒杯里 ，留下來了 ，當然肯定有少量雜蛋白也掛上了 ，這時候你要梯度洗脫 ， 拿咪唑和你的 buffer 配，一般從 0 20mM 40mM.100mM 這樣洗脫（當你不知道你的蛋白大概 在什么時候出來的時候）我指的是咪唑的終濃度咪唑加入之后，會和蛋白爭奪與 Ni 的結合位 點，雜蛋白、你的目的蛋白 ，會在不同的濃度被洗脫下來 ，洗完之后 ，你可以用 200