1、生物環境工程實驗生物環境工程 實驗指導生命科學與工程學院目 錄實驗一 生化需氧量(BOD5)的測定 4學時實驗二 固定化酵母細胞對Cr6+的生物吸附 5學時實驗三 酚降解菌的篩選 2學時實驗四 酚降解菌的分離 2學時實驗五 酚降解菌對酚的降解能力測定 3學時實驗六 氧化亞鐵硫桿菌脫除煤炭中的無機硫 5學時實驗一 生化需氧量(BOD5)的測定一、實驗目的1、掌握稀釋法測定BOD5的原理和方法。2、掌握碘量法測定水中溶解氧含量的原理和方法。二、實驗原理生化需氧量是指在規定的條件下，微生物分解水中的某些可氧化的物質，特別是分解有機物的生物化學過程消耗的溶解氧。稀釋法測定BOD5是將水樣經過適當稀釋后

2、，使其中含有足夠的溶解氧供微生物5d生化需氧的要求，將此水樣分成兩份，一份測定培養前的溶解氧；另一份放入20恒溫箱內培養5d后測定溶解氧，兩者的差值即為BOD5。測定水中的溶解氧是利用硫酸錳在堿性溶液中生成二價錳的氫氧化物，二價錳的氫氧化物被水中溶解氧氧化成四價錳，并生成氫氧化物沉淀，而在酸性溶液中，氫氧化物沉淀生成四價錳化合物，其將KI氧化而析出I2。析出I2的摩爾數與水中溶解氧的當量數相等，因此可用硫代硫酸鈉的標準溶液滴定。根據硫代硫酸鈉的用量，計算出水中溶解氧的含量。其反應式如下。MnSO4+2NaOHMn(OH)2(白色) + Na2SO42Mn(OH)2 +O22MnO(OH)2(棕

3、色)MnO(OH)2+2H2SO4Mn(SO4)2 +3H2OMn(SO4)2 +2KIMnSO4+I2+K2SO4I2+2Na2S2O32NaI+Na2S4O6三、實驗器材與試劑1、樣品污水處理廠生物處理排放水2、器材恒溫培養箱（201），5-20L細口玻璃瓶，碘量瓶，移液管，滴定管，1000-2000mL 量筒，容量瓶，抽氣泵，虹吸管，特制攪拌棒（在玻璃棒下端安裝一個2mm厚，大小和量筒相匹配的有孔橡皮片）。3、試劑K2HPO4，KH2PO4，Na2HPO47H2O，NH4Cl，MgSO47H2O，CaCl2，FeCl36H2O，HCl，NaOH， MnSO44H2O，KI，K2Cr2O7

4、，H2SO4，Na2CO3，可溶性淀粉，pH試紙。（1）磷酸鹽緩沖溶液：將0.85g KH2PO4，2.175g K2HPO4，3.34g Na2HPO47H2O和 0.17g NH4Cl溶于一定量的蒸餾水中，定容至100mL。此溶液的 pH 值應為 7.2。 （2）MgSO4溶液：將2.25g MgSO47H2O溶于一定量的蒸餾水中，定容至 100mL。（3）CaCl2溶液：將 2.75g CaCl2溶于一定量的蒸餾水中，定容至 100mL。 （4）FeCl3溶液：將 0.13g FeCl36H2O溶于一定量的蒸餾水中，定容至500mL。（5） 0.5mol/L HCl溶液：將4 mL（=1

5、.18g/ mL）HCl溶于一定量的蒸餾水中，定容至 100mL。（6）0.5mol/L NaOH溶液：將 2g NaOH溶于一定量的蒸餾水中，定容至100mL。（7）MnSO4溶液：稱取48g MnSO44H2O溶于30-40mL蒸餾水中，若有不溶物，應過濾，定容至100mL。（8）堿性KI溶液：稱取50g NaOH溶于30-40mL蒸餾水中，冷卻；另稱取15g KI溶于20mL蒸餾水中；將兩種溶液混合均勻，并定容至100mL。如有沉淀，則放置過夜后，傾出上清液，貯于棕色瓶內，用橡皮塞塞緊，避光保存。此溶液酸化后，遇淀粉應不呈藍色。（9）1%淀粉溶液：稱取1g可溶性淀粉，用少量水調成糊狀，然

6、后加入剛煮沸的100mL水（也可加熱1-2min）。冷卻后加入0.1g水楊酸或0.4氯化鋅防腐。（10）K2Cr2O7標準溶液（1/6K2Cr2O7=0.025mol/L）：稱取1.2258g在105110烘干2h的K2Cr2O7，溶解后轉入1000mL容量瓶內，用水稀釋至刻度、搖勻。（11）（1+5）H2SO4：將1份體積的H2SO4，慢慢滴加到5份體積的水中，邊滴加邊攪拌。（12）0.025mol/L Na2S2O3溶液：稱取6.25g Na2S2O35H2O，溶于經煮沸冷卻的水中，加入0.2g Na2CO3，稀釋至1000mL，儲于棕色試劑瓶內，使用前用0.0250mol/L K2Cr2

7、O7標準溶液標定。四、實驗步驟1、水樣的采集、存儲和預處理采集水樣于適當大小的玻璃瓶中（根據水質情況而定），用玻璃塞塞緊，且不留氣泡。采樣后，需在2h內測定；否則，應在4或4以下保存，且應在采集后10h內測定。水樣的pH若超出6.5-7.5范圍時，可用0.5mol/L氫氧化鈉溶液或0.5mol/L鹽酸溶液調節pH值至近于7，但用量不要超過水樣體積的0.5%。若水樣的酸度或堿度很高，可改用高濃度的堿或酸進行調節中和。2、稀釋水的制備在 5-20L 玻璃瓶內裝入一定量的水，控制水溫在 20左右。然后用無油空氣壓縮機或薄膜泵，將此水曝氣 2-8h，使水中的溶解氧接近飽和，也可以鼓入適量純氧。瓶口蓋以

8、兩層經洗滌晾干的紗布，置于 20培養箱內放置數小時，使水中的溶解氧量達到8mg/L。臨用前向每升水中加入CaCl2溶液、FeCl3溶液、MgSO4溶液、磷酸鹽緩沖溶液各1mL，并混合均勻。稀釋水的pH 值應為7.2，其 BOD5應小于 0.2 mg/L。3、水樣的稀釋及分裝根據確定的稀釋倍數，用虹吸法沿筒壁先引入部分稀釋水于1000 mL量筒中，然后加入所需水樣，再引入稀釋水（或接種稀釋水）至1000mL，用帶膠板的玻璃棒小心上下攪勻。攪拌時勿使玻璃棒的膠板露出水面，防止產生氣泡。將稀釋好的水樣沿瓶壁慢慢到到入兩個預先編號、體積相同的碘量瓶中，直到充滿后溢出少許為止，蓋嚴并水封，注意瓶內不能有

9、氣泡。另取兩個有編號的相同的碘量瓶用同樣的方法加入稀釋水作為空白對照。4、培養將稀釋的水樣，稀釋水空白各取一瓶放入20+1的培養箱內培養5d，培養過程中需每天添加封口水。5、溶解氧的測定 采用碘量法分別測定培養前后水樣及稀釋水空白的溶解氧的值。測定方法如下：（1）取下瓶塞，立即用移液管加入1mL MnSO4溶液。加注時，應將吸量管插入液面下約10mm，切勿將移液管中的空氣注入瓶中。以同樣的方法加入2mL堿性KI溶液，蓋上瓶塞，注意瓶內不能留有氣泡。然后將碘量瓶顛倒混合3次，靜置。待生成的棕色沉淀物下降至瓶高一半時，再顛倒混合均勻。繼續靜置，待沉淀物下降至瓶底后，輕啟瓶塞，立即用移液管插入液面以

10、下加入2mL（1+5）硫酸。小心蓋好瓶塞顛倒搖勻，此時沉淀應溶解；若溶解不完全，可再加入少量（1+5）H2SO4溶液至溶液澄清且呈黃色或棕色（因析出游離碘）。置于暗處反應5min。（2）從碘量瓶內取出2份50.0mL水樣，分別置于2個250mL錐形瓶中，用Na2S2O3溶液滴定至溶液呈淡黃色時，加入1%淀粉溶液1mL，繼續滴定至藍色剛好消失為止，即為終點，記錄Na2S2O3用量。6、計算（1）溶解氧濃度的計算溶解氧濃度C1V181000/V2式中：C1Na2S2O3溶液的濃度(mol/L)； V1消耗的Na2S2O3溶液的體積(mL)； 8氧的摩爾質量(1/2O，g/mol)； V2水樣的體積

11、(mL)。（2）BOD5的計算BOD5(mg/L)=(C2-C3)-(B1-B2)f1/f2式中：C2水樣在培養前的溶解氧濃度(mg/L)； C3水樣經5天培養后，剩余溶解氧濃度(mg/L)； B1稀釋水培養前的溶解氧濃度(mg/L)； B2稀釋水培養后的溶解氧濃度(mg/L)；f1 稀釋水在培養液中所占比例；f2 水樣在培養液中所占比例。五、注意事項1、本方法適用于測定BOD5大于或等于2mg/L，最大不超過6000 mg/L的水樣。當水樣BOD5大于6000 mg/L，會因稀釋帶來一定的誤差。2、若樣品中的有機物含量較多，BOD5的質量濃度大于6mg/L，樣品需要適當稀釋后測定；對不含或含

12、微生物少的工業廢水，如酸性廢水、堿性廢水、高溫廢水、冷凍保存的廢水或經過氯化處理等的廢水，在測定BOD5時應進行接種，以引進能分解廢水中有機物的微生物當廢水中存在難以被一般生活污水中的微生物以正常的速度降解的有機物或含有劇毒物質時，應將馴化后的微生物引入水樣中進行接種。3、接種液：可選用以下任一方法，以獲得適用的接種液。 （1）城市污水，一般采用生活污水， 在在室溫下放至一晝夜，取上層清液使用。 （2） 表層土壤浸出液，取 100g 花園土壤或植物生長土壤，加入 1L 水，混合并靜置 10min ，取上清液供用。（3） 用含城市污水的河水或湖水。 （4） 污水處理廠的出水。 （5） 當分析含有

13、難于降解的廢水時， 在排污口下游 3-8km 處取水樣作為廢水的馴化接種液。如無此種水源，可取中和或經適當稀釋后的廢水進行連續曝氣、每天加入少量該種廢水，同時加入適量表層土壤或生活污水，使能適應該種廢水的微生物大量繁殖。當水中出現大量絮狀物，或檢查其化學需氧量的降低值出現突變時，表明適用的微生物已進行繁殖，可用作接種液。一般馴化過程需要 3-8 天。 4、接種稀釋水：取適量接種液，加于稀釋水中，混勻。每升稀釋水中接種液加入量生活污水為 1-10mL；表層土壤浸出液為20-30mL；河水、湖水為 10-100mL。接種稀釋水的 pH 值應為 7.2，其 BOD5值宜在 0.3-1.0 mg/L

14、之間為宜。接種稀釋水配制后應立即使用。5、測定一般水樣的 BOD5時，硝化作用很不明顯或根本不發生。但對于生物處理池出水，則含有大量硝化細菌。因此，在測定 BOD5時也包括了部分含氮化合物的需氧量。對于這種水樣，如只需測定有機物的需氧量，應加入硝化抑制劑，如丙烯基硫脲（ATU，C4H8N2S）等。6、確定稀釋倍數，稀釋比根據水中有機物的含量來確定。較為清潔的水樣不用稀釋；污染嚴重的水樣，稀釋1001000倍；常規沉淀過的污水，稀釋20100倍；受污染的河水，稀釋04倍、原則上以培養后減少的溶解氧占培養前的溶解氧的4070為宜。7、f1，f2的計算，如培養液的稀釋比為3%，即3分水樣，97分稀釋

15、水，則f1=0.97，f2=0.03。8、為保證微生物生長的需要，稀釋水中還應加入一定量的無機營養鹽和緩沖物質。9、Na2S2O3溶液濃度的標定方法在250mL碘量瓶中加入25mL蒸餾水、0.5g碘化鉀、10.00mL 0.0250mol/L重鉻酸鉀溶液和5mL（1+5）硫酸，搖勻，加塞后置于暗處5min，用待標定的硫代硫酸鈉溶液滴定至淺黃色，然后加入1淀粉溶液1.0mL，繼續滴定至藍色剛好變為淡綠色為止，記錄用量。平行做3份，取平均值。硫代硫酸鈉的物質的量濃度C1為 C1=C210/V1式中： C2重鉻酸鉀標準溶液的濃度（mol/L）； V1消耗的硫代硫酸鈉溶液的體積(mL)。 六、思考題1

16、、測定BOD的方法有哪些？七、參考文獻1、程樹培環境生物技術實驗指南南京：南京大學出版社，1995 實驗二 固定化酵母細胞對Cr6+的生物吸附一、實驗目的1、掌握用海藻酸鈉制備固定化酵母細胞的方法。2、掌握用國標（GB7467-87）測定溶液中Cr6+的原理和方法。二、實驗原理將海藻酸鈉溶液與細胞液混合，此混合液滴加到CaC12溶液中，CaC12中的鈣離子與海藻酸根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定在凝膠顆粒中的微小空格中。在酸性溶液中，水樣中呈現強氧化性的Cr6+ (以Cr2O72-計)將二苯碳酰二肼氧化為二苯縮二氨基脲，生成的二苯縮二氨基脲再與Cr6+還原產物Cr3+形成紫

17、紅色絡合物，OCNHNHC6H5NHNHC6H5二苯碳酰二肼+Cr6+OCNHNHC6H5N = NC6H5二苯縮二氨基脲+Cr3+紫色絡合物在一定范圍內，該紫紅色絡合物色度與Cr6+的含量成線性關系，其吸光度與濃度的關系符合朗伯-比爾定律，在540nm波長處有最大吸收，因此，可以用分光光度法測定溶液中Cr6+含量。三、實驗器材與試劑1、樣品含Cr6+溶液，活性干酵母。2、器材三角瓶，玻璃棒，試管，燒杯，容量瓶，量筒，電子天平，30恒溫培養箱，注射器，恒溫水浴鍋，分光光度計，離心機。3、試劑H2SO4，H3PO4，K2Cr2O7，CaCl2，海藻酸鈉，二苯碳酰二肼，丙酮。（1）（1+1）H2S

18、O4溶液：將H2SO4溶液緩緩加入同體積的蒸餾水中，混勻。（2）（1+1）H3PO4溶液：將H3PO4溶液與等體積的蒸餾水混合。（3）鉻標準貯備液：稱取于110干燥2h的K2Cr2O7 0.28290.0001g， 用水溶解后，移入1000mL容量瓶中，用水稀釋至標線，搖勻。此溶液1mL含0.10mg Cr6+。（4）鉻標準溶液：稱取25.00mL鉻標準貯備液置于500mL容量瓶中，用水稀釋至標線，搖勻。此溶液1mL含5.00g Cr6+。使用當天配制此溶液。（5）顯色劑：稱取二苯碳酰二肼 (C13H14N4O) 0.2g，溶于50mL丙酮中，加水稀釋至100mL，搖勻，貯于棕色瓶，置冰箱中。

19、色變深后，不能使用。四、實驗步驟（一）固定化酵母細胞的制備1、酵母細胞活化取1g活性干酵母，放入50mL的小燒杯中，加入蒸餾水15 mL，用玻璃棒攪拌，使酵母細胞混合均勻，放置1h左右使其活化。2、CaCl2溶液的配制稱取0.83g無水CaCl2，放人200mL的燒杯中，加入150mL的蒸餾水，使其充分溶解，待用。3、海藻酸鈉溶液配制 稱取0.8g海藻酸鈉，放入50mL小燒杯中，加人20mL蒸餾水，于恒溫水浴鍋中加熱直至完全溶化，用蒸餾水定容至15mL，并冷卻至室溫。4、海藻酸鈉溶液與酵母細胞混合 將溶化好的海藻酸鈉溶液冷卻后，加人已活化的醉母細胞液，進行充分攪拌，使兩者混合均勻。5、酵母細胞

20、固定化將混合好的溶液轉移至注射器中，以恒定的速度緩慢地將溶液滴加到CaCl2溶液中，觀察液滴在CaCl2溶液中形成凝膠珠的情形。將這些凝膠珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右，過濾，稱取凝膠珠的濕重W。（二）Cr6+的吸附將100mL，Cr6+濃度為50mg/L的重鉻酸鉀溶液加入到250mL的錐形瓶中，再加入固定有酵母細胞的凝膠珠，置于搖床（30，140r/min）上振蕩0.5h，過濾，測定濾液中Cr6+的殘余濃度，計算Cr6+的吸附率和吸附量。（三）Cr6+的測定1、標準曲線的制作 向一系列50mL比色管中分別加入0、0.20、0.50、1.00、2.00、4.00、6.00、8.00、1

21、0.00mL鉻標準溶液，用水稀釋至刻度線。分別加入0.5mL H2SO4溶液和0.5mL H3PO4溶液，搖勻。加入2mL顯色劑，搖勻。放置10min后，以試劑空白做參比，在540nm波長處測定吸光度。以Cr6+含量為橫坐標，對應的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。2、Cr6+的測定取1mL樣品溶液加入50mL比色管中，加蒸餾水稀釋至刻度，分別加入0.5mL硫酸溶液和 0.5mL磷酸溶液，搖勻，再加入2mL顯色劑，搖勻。放置10min后，在540nm波長處，用10或30mm的比色皿，以試劑空白做參比（參照標準曲線），測定吸光度。 （四）計算根據測得的吸光度從標準曲線上查出相應的Cr6+含量，再按以

22、下公式計算細胞對 Cr6+的吸附率和吸附量：吸附率（%）=（CiCf）/Ci100%吸附量（mg/g）=(CiCf)V/W式中：CiCr6+的起始濃度（mg/mL）；CfCr6+的最終濃度（mg/ mL）；V 溶液體積（mL）；W 吸附劑濕重（g）。五、注意事項1、選用的干酵母要具有較強的活性，而且物種單一。2、海藻酸鈉的濃度涉及到固定化細胞的質量。如果海藻酸鈉濃度過高，將很難形成凝膠珠；如果濃度過低，形成的凝膠珠所包埋的酵母細胞的數目少，影響實驗效果。3、海藻酸鈉在水中溶解的速度較慢，需要通過加熱促進其溶解。4、溶化好的海藻酸鈉溶液必須冷卻至室溫，否則會因溫度過高殺死酵母菌。5、海藻酸鈉膠體

23、在CaCl2這種電解質的作用下，發生聚沉，形成凝膠珠，需穩定30min左右。6、如果制作的凝膠珠顏色過淺、呈白色，說明海藻酸鈉的濃度偏低，固定的酵母細胞數目較少；如果形成的凝膠珠不是圓形或橢圓形，則說明海藻酸鈉的濃度偏高，制作失敗，需要再作嘗試。7、檢驗凝膠珠的質量是否合格，可以使用下列方法：（1）用鑷子夾起一個凝膠珠放在實驗桌上用手擠壓，如果凝膠珠不容易破裂，沒有液體流出，就表明凝膠珠的制作成功。（2）在實驗桌上用力摔打凝膠珠，如果凝膠珠很容易彈起，也能表明制備的凝膠珠是成功的。8、如樣品液有顏色，則要進行色度校正后才能測定吸光度。六、思考題1、什么是活化？七、參考文獻1、國家環境保護總局，

24、水和廢水監測分析方法編委會編.水和廢水監測分析方法(第四版) M.北京:中國環境科學出版社，2002實驗三 高效苯酚降解菌的篩選及其性能測定一、實驗目的1、掌握微生物分離純化的基本操作；2、掌握用選擇性培養基從環境中分離苯酚降解菌的原理和方法；3、掌握微生物對酚降解能力的測定方法；4、掌握4-氨基安替比林法測定苯酚含量的方法。二、實驗原理在工業廢水的生物處理中，對污染成分單一的有毒廢水，可以選育特定的高效菌株進行處理。這些高效菌株以有機污染物作為其生長所需的能源、碳源或氮源，從而使有機污染物得以降解，具有處理效率高、耐受毒性強等優點。苯酚是一種在自然條件下難降解的有機物，其長期殘留于空氣、水體

25、、土壤中，會造成嚴重的環境污染，對人體、動物有較高毒性。本實驗通過篩選苯酚降解菌來處理含酚廢水，將苯酚降解為為二氧化碳和水，消除對環境的污染。 + COOHCH2CH2COOH CH3COOH CO2+H2O從環境中采樣后，在以苯酚為唯一碳源的培養基中，經富集培養、分離純化、降解實驗和性能測定，可篩選出高效酚降解菌。三、實驗器材與試劑1、樣品實驗土樣采自校園污水處理廠。2、器材恒溫培養箱、恒溫搖床、分光光度計、比色皿、試管、250mL三角瓶、100mL容量瓶、培養皿、涂布玻棒、量筒、天平、滅菌鍋、酒精燈、接種環、棉花、棉線、牛皮紙、pH試紙。3、試劑葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、苯酚、四硼酸鈉（Na

26、2B4O7）、4-氨基安替比林、過硫酸銨（NH4）2S2O8）、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4、瓊脂。苯酚標準溶液：稱取分析純苯酚1.0g，溶于蒸餾水中，稀釋至1000mL，搖勻。此溶液溶度為1000mg/L。測定標準曲線時將苯酚濃度稀釋至100mg/L。Na2B4O7飽和溶液：稱取Na2B4O7 40g，溶于1L蒸餾水中，冷卻后使用，此溶液的pH值為10.1。3% 4-氨基安替比林溶液：稱取分析純4-氨基安替比林3g，溶于蒸餾水中，并稀釋至100mL，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用兩周。2% （NH4）2S2O8溶液：稱取分析出（NH4）2S2O8 2g，溶于蒸餾水中，并稀釋至100m

27、L，置于棕色瓶中，冰箱保存，可用兩周。4、培養基富集培養基：蛋白胨0.5g，K2HPO4 0.1g，MgSO4 0.05g，水1000mL，調節pH 7.2-7.4，高壓蒸汽滅菌，冷卻后視需要添加適量的苯酚。基礎培養基：K2HPO4 0.6g，KH2PO4 0.4g，NH4NO3 0.5g，MgSO4 0.2g，CaCl2 0.025g，水1000mL，調節pH 7.0-7.5，高壓蒸汽滅菌，冷卻后視需要添加適量的苯酚。四、實驗步驟（一）富集培養和馴化采集活性污泥或土樣，接種于裝有100mL富集培養基和玻璃珠并加有適量苯酚（50mg/L）的三角瓶中，30振蕩培養。待菌生長后，用無菌移液管吸取1

28、mL轉至另一個裝有100mL富集培養基和玻璃珠并加有適量苯酚的三角瓶中，如此連續轉接2-3次，每次所加的苯酚量適當增加，最后可得酚降解菌占絕對優勢的混合培養物。（二）平板分離和純化1、用無菌移液管吸取經富集培養的混合液10mL，注入90mL無菌水中，充分混勻，并繼續稀釋到適當濃度。2、取適當濃度的稀釋菌液，加一滴于固體平板（由富集培養基加入2%的瓊脂組成，倒平板時添加適量的苯酚，濃度達到200 mg/L。）中央，用無菌玻璃涂棒把滴加在平板上的菌液涂平，蓋好皿蓋，每個稀釋度做2-3個重復。3、室溫放置一段時間，待接種菌液被培養基吸收后，倒置于30恒溫箱中培養2-3d。4、挑選不同菌落形態，在含適

29、量苯酚的固體平板上劃線純化。平板倒置于30恒溫箱中培養2-3d。（三）轉接斜面將純化后的單菌落轉接至補加適量酚的試管斜面，30恒溫箱中培養2-3d。（四）降解實驗用接種環取斜面菌苔一環，接種于100mL基礎培養基中，添加適量的苯酚，30震蕩培養2-3d。（五）酚含量的測定1、標準曲線的繪制：取100mL容量瓶7只，分別加入100mg/L苯酚標準溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL，于每只容量瓶中加入Na2B4O7飽和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1mL，再加入Na2B4O7和溶液10mL，2%（NH4）2S2O8 1mL，然后用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。放置10m

30、in后將溶液轉至比色皿中，在560nm處測定吸光度，根據吸光度和苯酚的量繪制標準曲線。2、培養液中苯酚含量的測定：取經降解的培養液30 mL，離心，取上清液10 mL于100 mL容量瓶中，加入Na2B4O7飽和溶液10mL，3% 4-氨基安替比林溶液1 mL，再加入Na2B4O7飽和溶液10mL，2%（NH4）2S2O8 1mL，然后用蒸餾水稀釋至刻度，搖勻。放置10min后將溶液轉至比色皿中，在560nm處測定吸光度，從標準曲線上查得苯酚的量。（六）、計算C（苯酚，mg/L）=查得的苯酚毫克數/101000苯酚脫除率=（C1-C2）/C1100%式中：C1-降解前溶液中的苯酚濃度；C2-降

31、解后溶液中的苯酚濃度；五、注意事項1、各種培養基的配制應嚴格按配方的要求完成，尤其是苯酚的稱量和pH；2、涂布平板的菌懸液只作適度稀釋，菌濃度不必過低；3、涂布平板的菌懸液不要過多或過少，0.2mL為宜；4、平板上挑取菌落時，要挑取單菌落；5、單碳源實驗的培養基和培養條件一定要嚴格把握。六、思考題1、如何從環境中分離高效苯酚降解菌株？七、參考文獻1、張清敏. 環境生物學實驗技術，化學工業出版社，20052、王蘭. 環境微生物學實驗方法與技術，化學工業出版社，20093、劉娜等. 環境生物技術實驗，清華大學出版社，20124、孔志明等. 現代環境生物學實驗技術與方法，2005氧化亞鐵硫桿菌脫除煤

32、炭中的無機硫一、實驗目的1、掌握氧化亞鐵硫桿菌脫除煤炭中無機硫的原理和方法。2、掌握測定溶液中SO42-濃度的原理和方法。二、實驗原理氧化亞鐵硫桿菌(Thiobaciiius ferrooxidans, 簡稱T. f 菌)是一種專性好氧、嗜酸性的化能自養菌，廣泛分布在溫泉、 火山裂縫、 金屬硫化礦和煤礦的酸性礦坑水中。以S和Fe2+作為能源物質進行生命活動，在有氧和酸性條件下將 Fe2+氧化為 Fe3+、S氧化為硫酸鹽。改菌被廣泛用于生物浸礦、酸性工業廢水處理和煤炭脫硫等方面。T. f菌能吸附在煤炭中黃鐵礦的表面，在生長過程中對黃鐵礦進行氧化分解，將硫脫除，反應方程式為：2FeS2+7O2 2

33、FeSO4+2H2SO42FeSO4+ 1/2O2+ H2SO4 Fe2(SO4)3+H2OFeS2+ Fe2(SO4)3 3FeSO4+2S2S+ 3O2+2H2O 2H2SO4在酸性溶液中，BaCrO4與硫酸鹽生成BaSO4沉淀和CrO42-，反應方程式為：SO42-+BaCrO4 =BaSO4 +CrO42-將溶液用氨水中和至弱堿性后，離心分離生成的BaSO4及過量的BaCrO4沉淀。溶液呈現的黃色是SO42-所定量置換出的CrO42-的顏色，在一定范圍內，溶液的顏色與CrO42-的含量成線性關系，其吸光度與濃度的關系符合朗伯-比爾定律，在420nm波長處有最大吸收，因此可用分光光度法測

34、定SO42-的含量。三、實驗器材與試劑1、樣品煤炭2、菌種氧化亞鐵硫桿菌，西南科技大學生命科學與工程學院生物工程實驗室保存。3、器材電子天平，高速離心機，分光光度計，蒸汽滅菌鍋，超凈工作臺，生化培養箱，恒溫搖床。4、試劑K2CrO42H2O，BaCl2，K2SO4，HCl，(NH4)2SO4，KCl，MgSO47H2O，Ca(NO3)2，FeSO47H2O，氨水。種子培養基：A液：（NH4）2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，Ca(NO3)2 0.01g，蒸餾水600mL，調節pH約為2，121溫熱滅菌30min；B液：FeSO47H2O 44.2g，蒸餾水 400mL，調節pH約為2，0.22m微孔濾膜過濾除菌，現配現用。使用前將A與B液混合，調節pH約為2。發酵培養基：（NH4）2SO4 3g，KCl 0.1g，K2HPO4 0.5g，MgSO47H2O 0.5g，蒸餾水600mL，調節pH約為4，121溫熱滅菌30min。BaCrO4懸浮液：稱取K2CrO42H2O 19.42g，BaCl2 24.43g，分別溶于1 L蒸餾水中，加熱至沸騰。然后將兩種溶液共同倒入3L燒杯內，此時生成黃色BaCrO4沉淀，待沉降后，傾去清液。用約1L蒸餾水洗滌沉淀，共需洗滌5次左右。最后加蒸餾水至1L，使成懸浮液，每次使用前