1、細胞是一切生命活動的基本結構和功能單位。細胞是一切生命活動的基本結構和功能單位。 uMuller于1838年觀察到脊椎動的腫瘤細胞能在體內自發地融合產生多核的腫瘤細胞。uVirchow于1858年描述了正常組織、發炎組織以及腫瘤組織中的多核細胞現象。uLuginbuhl于1873年觀察到天花病人的血液中也有多核的血細胞存在。uLange于1875年第一個觀察到脊椎動物（蛙類）的血液細胞發生融合的過程。uCienkawski(1876)、Buck(1877)、Geddes(1880)在無脊椎動中發現了細胞合并現象。u1958年日本學者岡田（Okada）發現仙臺病毒具有觸發動物細胞融合的效應。u1

2、974年華裔加拿大學者高國楠創立了聚乙二醇（PEG）化學融合法。u1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴細胞和骨髓瘤細胞而產生能分泌預定單克隆抗體的雜交瘤細胞。u20世紀80年代出現了電融合技術。生物種類生物種類細胞來源細胞來源成功年代成功年代煙草兩個種間苷藍青菜大豆馬唐草矮牽牛龍面花大麥花生大麥大豆小麥矮牽牛油菜大豆玉米大豆大豆野豌豆大麥蠶豆大豆草香木犀酵母菌雞大豆煙草大豆秋水仙人胡蘿卜番茄馬鈴薯人小鼠葉葉葉根愈傷組織葉葉花瓣種子種子葉懸浮細胞葉花瓣葉懸浮細胞葉懸浮細胞懸浮細胞懸浮細胞葉根懸浮細胞葉原生質體血紅細胞懸浮細胞葉懸浮細胞葉腹水癌細胞原生質體葉根尖纖維肉瘤

3、細胞畸胎瘤細胞197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972197219721972幾種細胞融合成功的例子幾種細胞融合成功的例子植物融合細胞成長狀態對比植物融合細胞成長狀態對比,右瓶為地面融合的右瓶為地面融合的細胞，左瓶中為太空微重力環境下融合的細胞細胞，左瓶中為太空微重力環境下融合的細胞 動物細胞融合實驗使用的小白鼠 病毒促使細胞融合的主要步驟如下：病毒促使細胞融合的主要步驟如下：用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖用滅活的病毒誘導的動物細胞融合過程示意圖 u聚乙二醇(PEG)結構為：HOH2C（CH20CH2）n

4、CH2OH，分子量大于 200小于6000者均可用作細胞融合劑。uPEG濃度以W/W；如將10克PEG與10mlEagLe氏液混合（假定1ml 培養液為1g重)，即成50PEG溶液。uPEG經高壓滅菌后，與溫熱的Engle氏液混合。u通常用分子量低于1000的PEG作融合劑最好，50PEG溶液能產生 最多雜交細胞。uPEG溶液在pH6.0時細胞融合率最高。2、聚乙二醇（、聚乙二醇（PEG）法）法聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法細胞融合過程）法細胞融合過程PEG的作用機理的作用機理： 由于由于PEG分子具有輕微的負極性，分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等故可以與

5、具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成形成H鍵，從而在在質膜之間形成分子橋，其結果是使鍵，從而在在質膜之間形成分子橋，其結果是使細胞質膜發生粘連進而促使質膜的融合；另外，細胞質膜發生粘連進而促使質膜的融合；另外，PEG能能增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發生融合增加類脂膜的流動性，也使細胞的核、細胞器發生融合成為可能。成為可能。 PEG誘導融合的特點誘導融合的特點：其優點是融合成本低，勿需特殊其優點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細

6、胞有毒害。可能對細胞有毒害。 聚乙二醇（聚乙二醇（PEG）法）法細胞融合步驟細胞融合步驟（1）將兩種不同親本細胞各5l06混勻；（2）離心沉淀，吸去上清液；（3）加1ml 50PEG溶液，用吸管吹打，使之與細胞接觸1分鐘；（4）加9ml 培養液，離心沉淀，吸去上清液；（5）加5ml 培養液，分別接種5個直徑60mm平皿，每個平皿加培養 液至 5ml，37的CO2培養箱中培養。（6）624小時后，換成選擇培養液篩選雜交細胞。3、電融合法、電融合法 電融合法是80年代出現的細胞融合技術，在直流電脈沖的誘導下，細胞膜表面的氧化還原電位發生改變，使異種細胞粘合并發生質膜瞬間破裂，進而質膜開始連接，直到

7、閉和成完整的膜，形成融合體。電融合法的優點：電融合法的優點：u融合率高、重復性強、對細胞傷害小；u裝置精巧、方法簡單、可在顯微鏡下觀察或錄像觀察融合過程；u免去PEG誘導后的洗滌過程、誘導過程可控性強。電融合的基本過程：電融合的基本過程：細胞膜的接觸：細胞膜的接觸：當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通當原生質體置于電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；膜的擊穿：膜的

8、擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈沖就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。 電融合誘導法原理示意圖電融合誘導法原理示意圖第二節第二節 動物細胞培養技術及其應用動物細胞培養技術及其應用4、激素、激素5、酶、酶6、病毒殺蟲劑、病毒殺蟲劑7、腫瘤特異性抗原、腫瘤特異性抗原8、單克隆抗體、單克隆抗體9、細胞本身、細胞本身 （anchoraged-independent cell ） 缺點：缺點： （1）提供激素及低分子量營養物。）提供激素及低分子量營養物。（2）提供結合蛋

9、白質，能識別維生素、脂類、）提供結合蛋白質，能識別維生素、脂類、 金屬和其他激素等。金屬和其他激素等。（3）有些情況下，結合蛋白能與有毒金屬和熱）有些情況下，結合蛋白能與有毒金屬和熱 原結合，起到解毒作用原結合，起到解毒作用（4）起酸堿度緩沖劑作用。）起酸堿度緩沖劑作用。（5）提供蛋白酶抑制劑，使細胞傳代時使用的）提供蛋白酶抑制劑，使細胞傳代時使用的 胰蛋白酶失活，保護細胞不受損傷。胰蛋白酶失活，保護細胞不受損傷。血清對實驗的負面影響：血清對實驗的負面影響： 空氣提升式生物反應器兩種構型：空氣提升式生物反應器兩種構型： 內循環式、外循環式內循環式、外循環式 空氣流速一般控制在空氣流速一般控制在

10、0.010.06m3/m3.min,反應器高徑比一般為反應器高徑比一般為(3:1)(12:1) （1）沒有移動部件，產生的湍動溫和而均勻，）沒有移動部件，產生的湍動溫和而均勻，剪切力相當小，細胞損傷率比較低。剪切力相當小，細胞損傷率比較低。 （2）完全密封，便于無菌操作，不易污染。）完全密封，便于無菌操作，不易污染。 （3）設計簡單，便于放大生產。）設計簡單，便于放大生產。 （4）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體）直接噴射空氣供氧，氧傳遞速率高，液體循環量大，使細胞和營養成分能均勻地分布于培養循環量大，使細胞和營養成分能均勻地分布于培養基中。基中。（3 3）、中空纖維生物反應器）、中空纖維

11、生物反應器 第三節第三節 植物細胞培養技術及其應用植物細胞培養技術及其應用葉綠體線粒體細胞壁細胞膜液泡細胞質光面內質網細胞核粗面內質網高爾基體二、植物細胞培養的二、植物細胞培養的 誘導期誘導期對數增殖對數增殖 轉換轉換 衰減期衰減期 靜靜 止止0 40 80 120 160 200 細細胞胞濃濃度度(g/L)培養時間培養時間(h)植物細胞生長曲線植物細胞生長曲線植物細胞培養與微生物培養的比較植物細胞培養與微生物培養的比較特性特性 微生物微生物 植物細胞植物細胞大小大小 2 mm3 3 10105 5 mm3 3 單一細胞單一細胞 經常經常 一般以群體發育一般以群體發育由單細胞生長成細胞群由單細

12、胞生長成細胞群 是是 少有少有加成時間加成時間 大于大于1 1h 1d d接種濃度接種濃度 小小 細胞在培養液中濃度為細胞在培養液中濃度為5% 5% 20% 20%染色體數目染色體數目 單或雙倍體單或雙倍體 單、雙、多及不定倍體混合生長單、雙、多及不定倍體混合生長切力切力 不敏感不敏感 敏感敏感單一培養的變異單一培養的變異 安定安定 變異很大變異很大發育發育 可形成孢子或假菌絲可形成孢子或假菌絲 形成器官或胚形成器官或胚通氣需求通氣需求 高，高，1 1 2 2m3/m3.min 低，低，0.2 0.30.3m3/m3.min 產物形成產物形成 進入菌絲進入菌絲 進入液泡進入液泡 有有13種植物

13、必需的元素種植物必需的元素 N、P、K、Ca、Mg、S、Fe、B、Mn、Cu、Zn、Mo、Cl，前前6種為大量元素，后種為大量元素，后7種種屬微量元素。屬微量元素。I雖不是植物生長所必需的，但幾雖不是植物生長所必需的，但幾乎所有組織培養基中都有，有些培養基還加入乎所有組織培養基中都有，有些培養基還加入Co、Ni、Ti、Be，、，、Al等元素。等元素。 。 這些物質不是植物細胞生長所必需的，這些物質不是植物細胞生長所必需的，但對細胞生長有益。如活性炭可以降低組織培但對細胞生長有益。如活性炭可以降低組織培養物的有害代謝物濃度，對細胞生長有利。液養物的有害代謝物濃度，對細胞生長有利。液體培養基中加入

14、瓊脂糖，可改善培養細胞的供體培養基中加入瓊脂糖，可改善培養細胞的供氧狀況。氧狀況。 植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，植物天然汁液如西瓜汁、生梨汁等，它們的作用是供給一些必需的微量營養成它們的作用是供給一些必需的微量營養成分、生理活性物質和生長激素物質等。分、生理活性物質和生長激素物質等。 2 2、光、光 植物細胞代謝產物的合成受光質和植物細胞代謝產物的合成受光質和光量的調節。光量的調節。 對于黃酮、黃酮醇、花色素苷、萘對于黃酮、黃酮醇、花色素苷、萘醌、多酚、揮發油、萜烯和其他次級代醌、多酚、揮發油、萜烯和其他次級代謝的合成和積累來講，光質和光量具有謝的合成和積累來講，光質和光量具有重要的影響。

15、重要的影響。 最適生長溫度最適生長溫度25253030，此外，溫，此外，溫度對培養基成分的利用速度也有一定的度對培養基成分的利用速度也有一定的影響。影響。 KessellKessell和和CarrCarr在驗證溶解氧對攪動通氣在驗證溶解氧對攪動通氣培養的胡蘿卜細胞生長和分化的影響時，發現培養的胡蘿卜細胞生長和分化的影響時，發現有一個臨界氧水平。在臨界水平之上，生長不有一個臨界氧水平。在臨界水平之上，生長不受溶解氧的影響，根據干重或細胞數目計算的受溶解氧的影響，根據干重或細胞數目計算的生長呈指數增加。而低于這個臨界值時，干重生長呈指數增加。而低于這個臨界值時，干重增加呈線性，而細胞數目仍以指數形

16、式增加。增加呈線性，而細胞數目仍以指數形式增加。 1 1 組織培養：組織培養： 植物細胞工業規模的培養首先是細胞生物量的植物細胞工業規模的培養首先是細胞生物量的增長，細胞即為重要的產品之一。如人參細胞制增長，細胞即為重要的產品之一。如人參細胞制成人參細胞粉，既是保健食品原料，也可作為藥成人參細胞粉，既是保健食品原料，也可作為藥材，其中除含人參皂苷（人參皂苷含量材，其中除含人參皂苷（人參皂苷含量7%，超，超過了原植物過了原植物 ）外，還）外，還含有天然人參所不具有的酶含有天然人參所不具有的酶類及其活性成分，其保健作用優于天然人參。類及其活性成分，其保健作用優于天然人參。 日本曾用煙草細胞培養收集

17、煙草細胞作為煙日本曾用煙草細胞培養收集煙草細胞作為煙草原料。草原料。2 2、初級及次級代謝物的生產、初級及次級代謝物的生產化合物化合物細胞來源細胞來源作用作用紫草素紫草素紫草細胞紫草細胞抗炎劑，食用色素抗炎劑，食用色素辣椒素辣椒素朝天椒細胞朝天椒細胞食品，化妝品色素食品，化妝品色素甘草精甘草精甘草細胞甘草細胞甜味劑甜味劑香豆素香豆素薰衣草細胞薰衣草細胞香料香料薄荷醇薄荷醇薄荷細胞薄荷細胞香料香料黃連素黃連素黃連細胞黃連細胞止瀉藥止瀉藥類胰島素類胰島素苦瓜細胞苦瓜細胞治療糖尿病治療糖尿病毛地黃毒素毛地黃毒素毛地黃細胞毛地黃細胞強心藥強心藥利血平利血平羅夫杉細胞羅夫杉細胞降血壓藥降血壓藥奎寧堿奎寧

18、堿金雞納樹金雞納樹抗瘧疾抗瘧疾長春花堿長春花堿長春花長春花治療白血病治療白血病可卡因可卡因古柯植物古柯植物抗阿米巴病抗阿米巴病尼古丁尼古丁煙草煙草殺蟲藥殺蟲藥嗎啡嗎啡罌粟罌粟止痛藥止痛藥九、植物細胞培養的幾個技術難題九、植物細胞培養的幾個技術難題 植物細胞生產周期一般為植物細胞生產周期一般為25 3535d d， 由于生產效率低，設備周轉慢，能源、勞力由于生產效率低，設備周轉慢，能源、勞力 消耗多，因而成本高。消耗多，因而成本高。 成塊后使細胞生長速度變慢，細胞的性成塊后使細胞生長速度變慢，細胞的性質有差異，有效成分的含量不一樣，影響產質有差異，有效成分的含量不一樣，影響產品的質量的產量，另外

19、造成管路堵塞等麻煩。品的質量的產量，另外造成管路堵塞等麻煩。 選用松散易分散的起始材料，培養過程選用松散易分散的起始材料，培養過程中隨時除去細胞團塊，提高生長素的濃度向中隨時除去細胞團塊，提高生長素的濃度向培養基中加入培養基中加入EDTA-NaEDTA-Na螯合劑和果膠酶等。螯合劑和果膠酶等。 包括特異性免疫包括特異性免疫( (Specific Specific immunity)immunity)和非特異性免疫。和非特異性免疫。 一、免疫系統一、免疫系統 當機體受到抗原刺激后，一當機體受到抗原刺激后，一類小淋巴細胞類小淋巴細胞- -依賴胸腺的依賴胸腺的T T細胞細胞發生增生、分化，直接攻擊靶

20、細發生增生、分化，直接攻擊靶細胞或間接地釋放一些淋巴因子，胞或間接地釋放一些淋巴因子，從而使機體達到免疫的過程。從而使機體達到免疫的過程。 細胞免疫：細胞免疫： 單克隆抗體：單一的特異性抗體即為單一單克隆抗體：單一的特異性抗體即為單一B細胞克隆抗體，細胞克隆抗體，B型淋巴細胞的增生過程是一個型淋巴細胞的增生過程是一個無性繁殖過程，即由一個無性繁殖過程，即由一個B細胞分裂而形成的細細胞分裂而形成的細胞 群 ， 稱 為 一 個 克 隆 。 單 克 隆 抗 體胞 群 ， 稱 為 一 個 克 隆 。 單 克 隆 抗 體(Monoclonal antibody,McAb) 也稱為單抗。也稱為單抗。 多克

21、隆抗體多克隆抗體(Polyclonal antibody) ：多多種種B型淋巴細胞產生的多種抗體的混合物。型淋巴細胞產生的多種抗體的混合物。 19751975年，英國年，英國Milstein Milstein 和和KohlorKohlor將經將經綿羊細胞免疫的小鼠脾綿羊細胞免疫的小鼠脾B B淋巴細胞與小鼠骨淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞在仙臺病毒的誘導下進行融合，利髓瘤細胞在仙臺病毒的誘導下進行融合，利用用HATHAT選擇性培養基篩選出融合后形成的雜選擇性培養基篩選出融合后形成的雜交細胞，這種細胞既有小鼠骨髓瘤細胞在體交細胞，這種細胞既有小鼠骨髓瘤細胞在體外培養條件下大量繁殖的本領，又有外培養條件下

22、大量繁殖的本領，又有B B淋巴淋巴細胞分泌特異性抗體的能力，使得單克隆抗細胞分泌特異性抗體的能力，使得單克隆抗體在體外生產成為可能。體在體外生產成為可能。1 1 、新型診斷試劑：、新型診斷試劑：紅細胞表面的糖蛋白：紅細胞表面的糖蛋白：A、B型型AB型：兩種都帶型：兩種都帶O型：兩種血型物質都不帶型：兩種血型物質都不帶 法國輸血中心還研制出了可分辯法國輸血中心還研制出了可分辯A型、型、B型、型、AB型血型的單克隆抗體診斷盒。型血型的單克隆抗體診斷盒。 單克隆抗體可用在體內定位診斷上，單克隆抗體可用在體內定位診斷上，不同的癌癥或腫瘤在體內所表現出的癌不同的癌癥或腫瘤在體內所表現出的癌抗原或瘤抗原不

23、同，可以獲得各種特異抗原或瘤抗原不同，可以獲得各種特異的單克隆抗體，再采用合適的同位素標的單克隆抗體，再采用合適的同位素標記表使特異的單克隆抗體上帶有放射性記表使特異的單克隆抗體上帶有放射性標記。標記。 單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正單克隆抗體在腫瘤治療方面目前正顯示著巨大的優勢，其中治療效果較好顯示著巨大的優勢，其中治療效果較好的有白血病、淋巴瘤、腎癌、肉瘤、黑的有白血病、淋巴瘤、腎癌、肉瘤、黑色素瘤、肝癌以及胃腸道腫瘤等。色素瘤、肝癌以及胃腸道腫瘤等。 1、放射性核素標記的抗體治療藥物 抗體作為放射性核素的導向載體，操作簡單、用量小，且能觀察到藥物在體內的分布和藥物動力學，放射性標記的抗體

24、有較大的殺傷范圍，有利于克服腫瘤表面抗原的異質性，對腫瘤細胞的殺傷也不依賴抗原抗體結合后的吸收作用，由于分子量小，容易穿透到達腫瘤部位。 2、抗癌藥物偶聯的抗體藥物 （1）、常用抗癌藥 氨甲喋呤、阿霉素、絲裂霉素、環磷酰胺等，以人血清白蛋白為中間載體，可明顯提高每分子抗體所攜帶的氨甲喋呤量，使體外細胞毒性提高倍。 （2）、抗體類藥物的逆轉耐藥性 腫瘤細胞對抗原藥物可產生多藥耐藥性。 毒素偶聯的抗體藥物 1、免疫毒素及其換代制品 毒素和抗體的交聯物稱為免疫毒素免疫毒素。 第一代免疫毒素是包含有A、B鏈的完整的毒素和抗體的交聯物，應用有限， 第二代免疫毒素利用抗體或抗體片段與毒素作用，在體內有一定

25、的抗腫瘤作用； 第三代免疫毒素重組免疫毒素，特異性好，穩定性強，滲透性好，免疫原性低，可大量制備。 2、免疫毒素的制備 來源:主要是細菌毒素和植物毒素。 載體種類：小分子抗體FV和SCFV；細胞生長因子可與細胞膜上的受體結合；激素，可識別細胞表面的受體；CD4可識別HIV表達的糖蛋白。 先克隆出細胞基因，再利用基因重組技術去除毒素中非特異性結合部位基因，經過改造的毒素基因再與載體基因的互補DNA重組，轉入受體菌中表達，形成融合蛋白，再經純化可得到重組的免疫毒素。 3、免疫毒素的臨床應用 可用于治療腫瘤、自身免疫病、并能克服組織移植排斥反應，可單獨給藥也可包裹在脂質體及其他微粒中給藥，在胞漿物質

26、代謝中發揮作用，相對分子量小，滲透力強、效果好。 抗HBsAg的單克隆抗體生產工藝 抗乙型肝炎表面抗原(HBsAg)單克隆抗體是專一性識別HBsAg的單一抗體，能與HBsAg產生免疫反應。 臨床上用于檢測乙型肝炎病毒的感染并用于生產預防乙肝的免疫制劑，目前生產抗HBsAg的單克隆抗體技術有基因工程與細胞工程。 免疫大鼠脾淋巴細胞與大鼠骨髓瘤的IR983F細胞融合技術制造抗HBsAg單克隆抗體的工藝。 (1)(1)工藝流程工藝流程 大鼠骨髓瘤細胞+免疫大鼠脾淋巴細胞 融合混合物 雜種細胞混合物 雜交瘤克隆系 細胞種質 培養液 粗制McAb 層析液 濃縮液 McAb精品 (2)工藝過程工藝過程 培

27、養基：培養基： 大鼠骨髓瘤IR983 F細胞系的培養基為改良的改良的 (DMEM)培培養基。養基。 使Eagle培養基中15種氨基酸濃度增加1倍， 8種維生素濃度增加3倍而成，用于細胞培養，提高了細胞生長效果。 其中尚需10%滅活小牛血清，1%非必需氨基酸，0.1molL丙酮酸鈉，1%谷氨酰胺及50mgmI慶大霉素；雜交瘤細胞篩選系統用含HAT的DMEM培養基。 飼養細胞制備： 在細胞融合前23天，取健康大鼠處死，向腹腔內注入10mlDMEM培養液 輕壓腹腔使細胞懸浮，打開腹壁皮膚，暴露腹膜，提起腹膜中心，插入注射針頭，吸出全部細胞懸液； 500g離心5min，用pH7.4，0.1molL磷酸

28、緩沖液洗滌2-3次； 收集細胞，用含10小牛血清、100Uml青霉素和鏈霉素及HAT的DMEM培養液制成106細胞ml懸浮液； 使用24孔板時，每孔加0.1ml，當使用96孔板時，則制成2x105細胞ml的懸浮液，每孔加0.1ml， 然后置37的CO2培養箱中溫育，備用。 親本細胞準備：親本細胞準備： 取對8氮鳥嘌呤抗性的Louc大鼠非分泌型漿細胞瘤IR983F細胞，用常規方法制成細胞懸浮液，按1.5x105細胞ml接種量接種于DMEM培養液中，于37CO2培養箱中培養至對數生長期，經常規消化分散法用DMEM培養液制成細胞懸浮液，即為待融合用骨髓瘤細胞骨髓瘤細胞親本，備用。 另取HBsAg用p

29、H7.4，0.1molL磷酸緩沖液溶解并稀釋成20gml的溶液，加等體積福氏完全佐劑充分乳化后，取2ml注入Louc大鼠腹腔，2周后進行第2次免疫，3個月后于融合前34天進行加強免疫，3次免疫的劑量和注射途徑均相同，唯第3次免疫時不加福氏佐劑， 于細胞融合前處死大鼠，用碘酒棉球及酒精棉球先后對右上腹部消毒，剖開腹部，用無菌剪刀與鑷子取出脾臟脾臟，用pH7.4，0.1molL磷酸緩沖液洗去血液，在無菌燒杯或培養皿中切成1mm3小塊，再用磷酸緩沖液洗滌34次，直至澄清，傾去洗滌液， 加入組織塊56倍體積(質量體積)的0.25%胰蛋白酶溶液(pH7.67.8)于37度保溫，消化20一40min，每1

30、0min輕搖消化瓶1次，直至組織塊松軟為止，傾去胰蛋白酶溶液，再用上述磷酸緩沖液洗滌35次，然后加入少量磷酸緩沖液用10ml吸管吹打分散，至大部分組織塊分散為細胞， 用兩層無菌紗布過濾，未分散的組織塊再加少量磷酸緩沖液吹打和分散，合并細胞濾液，離心收集細胞并用磷酸緩沖液洗滌23次，然后用無血清的DMEM培養液稀釋制成細胞懸浮液，即為免疫大鼠脾淋巴細胞親本，備用。 固定化抗大鼠K輕鏈單抗的制備： 本法所用載體也為Sepharose 4B，其活化方法與制備固定化t-PA相同 取30g活化的Sepharose 4B懸浮于100ml，pH10.2，0.025mol/L硼酸緩沖液中，另取1g抗大鼠K輕鏈

31、的McAb(MARK-1)溶于25ml硼酸緩沖液， 然后加至上述已活化的Sepharose 4B懸浮物中，于10度攪拌反應1620h，將其裝柱(直徑2cm*50cm)并用10倍柱床體積(體積體積)的上述硼酸緩沖液以56mlmin流速洗滌柱床，收集流出液， 測A280并根據流出液計算偶聯效率然后依次用5倍柱床體積(體積體積)的pH10，0.1mol/L乙醇胺溶液及pH8.0，0.1molL硼酸緩沖液充分洗滌 最后用pH7.4，0.1mo/L磷酸緩沖液洗至流出液A280小于0.01，即得抗HBsAg McAb的親和吸附劑，將其轉移至含0.01NNaN3的pH7.4，0.1mol磷酸緩沖液中，于4貯

32、存，備用。 細胞融合：細胞融合： 取107個IR983 F細胞與108個免疫大鼠脾淋巴細胞于50mi離心管中，混勻，在4度下，1500rmin離心810min，用巴斯德吸管小心吸去上清液，輕彈管底，使沉淀的細胞松動， 于37度水浴中保溫，并于lmin內輕輕滴加0.8ml 50%PEG4000，同時用吸管尖輕輕攪動6090s，然后于2min內緩慢滴加20mlDMEM培養液，1500rmin離心810min，吸去上清液，然后再用含20%小牛血清的DMEM培養液稀釋至50ml，制成細胞懸浮液， 得細胞融合混合物.取25ml融合混合物加至兩塊含飼養細胞的24孔微量培養板中，每孔加0.5ml； 余下25

33、ml細胞融合混合物再用含20%小牛血清的DMEM培養液稀釋至50m1，依上法再接種兩塊24孔培養板 依此類推，每次融合混合物可按種810塊24孔培養板，按IR983 F計，每孔接種細胞數約為105個，剩余融合物棄去 若用96孔板，則每孔接種細胞數約為104個然后于37度，C02培養箱中培養至24天，每天從各孔中吸去lml原培養液，替換含20%小牛血清及HAT的DMEM培養液，繼續培養至第56天可見小克隆，至910天可見大克隆，中途不換HT培養液。 若培養液出現淡黃色，可取出一部分培養液進行抗體檢測。培養10天后改換含HT的培養液，繼續培養兩周后改用常規DMEM培養液培養。雜交瘤細胞篩選： 篩選

34、產生抗HBsAg單抗的雜交瘤細胞的方法是用AUSAB酶免疫試劑盒酶免疫試劑盒測定表達抗體的細胞， 即將包被了人HBsAg的聚苯乙烯珠與待測雜交瘤培養上清培育，然后用磷酸緩沖液洗滌34次，加入用生物素偶聯的HBsAg培育后洗滌，再加過氧化物酶標記的親和素培育，最后用鄰苯二胺(OPD)顯色，經酶標儀定量測定，以確定產生抗HBsAg單抗的陽性孔。 經檢測確定為產生抗HBsAg單抗的陽性孔細胞需進行克隆和再克隆，井經全面鑒定與分析，最后才能獲得產生抗HBsAg單抗的雜交瘤克隆系。其過程如下： 將陽性孔中的培養細胞經常規消化分散法制成細胞懸浮液，計數，用含20%小牛血清的DMEM培養液依次稀釋成5X10

35、4細胞ml，5X103細胞ml、5X102細胞m1及5X10細胞ml細胞懸液， 然后在已有飼養細胞的96孔培養板的第1一3行中，每孔接種5x10細胞ml細胞懸液0.1ml，每孔細胞數平均為5個； 余下細胞懸液再稀釋成10細胞ml，在第46行孔中每孔接種0.1ml，平均每孔細胞數為1個； 余下細胞懸液再稀釋成2細胞ml，在78行孔中每孔接種0.1ml，平均每孔0.2個細胞. 然后于37度，CO2培養箱中通入含5CO2的無茵空氣培養至第5一6天，鏡檢，記下單克隆孔，補加0.1ml培養液。 在生長良好的情況下，第13行難有單克隆，第46行偶有單克隆，第78行多為單克隆 培養至910天后有部分孔中培養

36、液上清液變淡黃色淡黃色，可能已有抗體產生。然后將陽性孔內細胞分散接種至另外的24孔板中培養，并在原版的各孔中替換另批培養液，以防污染及細胞死亡。 當新的24孔板中細胞生長良好時，即進行消化分散轉移至小方瓶中擴大培養，同時將種質進行保存。所獲的陽性培養物需按上述方法反復再克隆和全面鑒定，直至確證為陽性單克隆為止。 抗HBsAg單克隆抗體的生產： 抗HBsAg的單克隆抗體可采用人工生物反應器培養雜交瘤細胞進行生產，也可采用動物體作為生物反應器進行生產，后者又可通過誘發實體瘤及腹水瘤進行生產，本文敘述腹水瘤生產技術，其過程如下： 向健康的Louc大鼠腹腔注射1ml降植烷(Pristane)，飼養19周后，向大鼠腹腔接種5x106個雜交瘤細胞， 飼養911天后即可明顯產生腹水，待腹水量達到最大限度而大鼠又瀕于死亡之前時，處死動物，用毛細管抽取腹水，一般可得50ml左右。 同時也可取其血清分離抗體，此外也可不處死動物，而是每13天抽取1次腹水，通常每一動物可抽取10次以上，從而獲得更多單克隆抗體。 抗HBsAg單抗的分離純化： 將固定化抗大員K輕鏈的Sepharose 4BSepharose 4B親和吸附劑親和吸附劑裝柱(直徑4cmX20cm)。 用5倍柱床體積(體積體積)的9H7.4，0.1m