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文檔簡介

1、3（1）反向）反向PCR技術技術(Inverse PCR, IPCR)：（2）錨定）錨定PCR技術技術(Anchored PCR, APCR)：（ 3）不對稱）不對稱PCR技術技術(asymmetric PCR)：（ 4）反轉錄）反轉錄PCR技術技術(reverse transcription PCR, RT-PCR)：（5）巢式）巢式PCR技術技術(NEST-PCR)：（6）多重）多重PCR技術技術(multiplex PCR)：（7）重組）重組PCR技術：技術：（8）原位）原位PCR技術：技術： （9）熒光定量實時）熒光定量實時PCR技術技術 技術技術 （1）反向）反向PCR技術技術(In

2、verse PCR, IPCR)：反向反向PCR是克隆已知序列旁側序列的一是克隆已知序列旁側序列的一種方法。種方法。 一種在已知序列中無 切點的限制性內切酶消化基因組DNA。 酶切片段自身環化。 以環化的DNA作為模板，用一對與已知序列兩端特異性結合的引物，擴增夾在中間的未知序列。 擴增產物是線性的DNA片段，大小取決于上述限制性內切酶在已知基閑側翼DNA序列內部的酶切位點分布情況。用不同的限制性內切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA，再通過反向PCR獲得未知片段 。cDNA末端快速擴增技術（rapid amplification of cDNA ends，RACE） 通過通過RT-PCR技

3、術由已知部分技術由已知部分cDNA序列來得到序列來得到完整的完整的cDNA5和和3端，包括單邊端，包括單邊PCR和錨定和錨定PCR。1.基于蛋白質保守性的兼并引物的設計及基于蛋白質保守性的兼并引物的設計及ORF保守區保守區RT-PCR克隆；克??；2. 3-RACE3. 5-RACE1.基于蛋白質保守性的兼并引物的設計及基于蛋白質保守性的兼并引物的設計及ORF保守區保守區RT-PCR克??；克??；利用ncbi搜索不同物種中同一目的基因的蛋白或cDNA編碼的氨基酸序列因為密碼子的關系，不同的核酸序列可能表達的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。 對所找到的序列進行多序列對。確定合適的保守區域 設計簡并引物至少需要上下游各有一個保守區域，且兩個保守區域相距50 400個aa為宜，使得pcr產物在1501200bp之間，最重要的是每一個保守區域至少有6個aa殘基，因為每條引物至少18bp左右。利用軟件設計引物 RAG，YCT，MAC，KGT，SCG，W AT，H ACT，B CGT，ACG， DA/G

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