1、實驗二實驗二 實驗目的實驗目的1.熟悉凝集反應、沉淀反應的概念。熟悉凝集反應、沉淀反應的概念。2.了解單向瓊脂擴散實驗的原理、方法及應用。了解單向瓊脂擴散實驗的原理、方法及應用。3.掌握直接凝集反應玻片法的原理、方法及其掌握直接凝集反應玻片法的原理、方法及其用途。用途。4.掌握雙向瓊脂擴散實驗的原理、方法、結果掌握雙向瓊脂擴散實驗的原理、方法、結果判斷。判斷。1.1.直接凝集反應：直接凝集反應：顆粒性抗原顆粒性抗原與相應抗體結合后所呈與相應抗體結合后所呈現的肉眼可見的凝集現象?，F的肉眼可見的凝集現象。 。2.2.沉淀反應：沉淀反應：可溶性抗原可溶性抗原與相應抗體在適當條件下結與相應抗體在適當條

2、件下結合而出現的沉淀現象。合而出現的沉淀現象。實驗原理實驗原理 傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、 載玻片、接種環、記號筆、酒精燈；瓊脂板、載玻片、接種環、記號筆、酒精燈；瓊脂板、打孔器、針頭、毛細滴管、待測血清、打孔器、針頭、毛細滴管、待測血清、 AFPAFP陽陽性血清、性血清、AFPAFP診斷血清（兔抗人診斷血清（兔抗人AFP AFP ）等。）等。實驗材料實驗材料 實驗內容實驗內容1.1.直接凝集反應：玻片法（操作）直接凝集反應：玻片法（操作）2.2.沉淀反應：沉淀反應：（1 1）單向瓊脂擴散試驗（示教）單向瓊脂擴散試驗（示教）（2 2）雙

3、向瓊脂擴散試驗（操作）雙向瓊脂擴散試驗（操作）抗原抗體反應又稱血清學反應，主要有：抗原抗體反應又稱血清學反應，主要有：1、凝集反應、凝集反應2、沉淀反應、沉淀反應3、補體參與反應、補體參與反應4、中和反應、中和反應5、免疫標記技術、免疫標記技術常見抗原抗體反應的種類常見抗原抗體反應的種類一、凝集反應一、凝集反應 ( (一一) )概念概念 顆粒性抗原顆粒性抗原( (細菌、細胞等細菌、細胞等) )與相應抗體結合，在與相應抗體結合，在一定條件下，出現肉眼可見的一定條件下，出現肉眼可見的凝集物凝集物，稱為凝集反應。，稱為凝集反應。原理 玻片凝集試驗是一種快速簡便的檢測方法，即抗原抗體的反應在玻片上進行

4、，是一種定性的試驗。用已知抗體檢測未知抗原。 本試驗用已知的傷寒桿菌標準診斷血清鑒定未知細菌。直接凝集反應玻片法-菌種鑒定 材料 傷寒桿菌診斷血清、傷寒桿菌菌液、生理鹽水、載玻片、接種環、蠟筆、酒精燈等。取潔凈玻片1張，用蠟筆劃分2等份，如下圖所示 ；無菌操作，用接種環分別于一、二格內各加23環傷寒桿菌診斷血清、生理鹽水；用接種環取待測菌液，分別涂布于生理鹽水和傷寒血清中，混勻；輕輕搖動玻片，12分鐘后觀察結果。 操作步驟操作步驟生理鹽水生理鹽水 待測菌液待測菌液 陰性陰性傷寒血清傷寒血清 待測菌液待測菌液 ？直接凝集反應玻片法-菌種鑒定v鹽水側無凝集顆粒；v血清側出現肉眼可見的凝集塊為陽性，

5、仍為均勻一致乳濁液者為陰性。注意事項1、接種環在傷寒菌液取菌前后均需嚴格滅菌，以免出現假陽性。2、注意涂菌時，先涂生理鹽水側，以免污染血清產生錯誤結果。3、搖動玻片時不要把兩凹內液體混在一起。結果及判斷直接凝集反應玻片法-菌種鑒定 經典抗原抗體反應的一種。經典抗原抗體反應的一種。 分類分類: : 瓊脂擴散瓊脂擴散 環狀沉淀反應環狀沉淀反應 絮狀沉淀反應絮狀沉淀反應 免疫電泳免疫電泳二、沉淀反應二、沉淀反應: :沉淀線或沉淀環沉淀線或沉淀環可溶性抗原可溶性抗原相應抗體相應抗體+ 瓊脂擴散試驗：瓊脂擴散試驗： 瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時溶于瓊脂是一種含有硫酸基的多糖體，高溫時溶于水，冷卻

6、后凝固，形成凝膠，呈多孔結構，充滿水水，冷卻后凝固，形成凝膠，呈多孔結構，充滿水分，允許各種抗原抗體分子自由擴散。二者于比例分，允許各種抗原抗體分子自由擴散。二者于比例適當處相遇，發生沉淀，形成可見的沉淀帶。適當處相遇，發生沉淀，形成可見的沉淀帶。單向瓊脂擴散實驗單向瓊脂擴散實驗: : 僅抗原或抗體擴散僅抗原或抗體擴散 定量實驗定量實驗雙向瓊脂擴散實驗雙向瓊脂擴散實驗: : 抗原和抗體同時擴散抗原和抗體同時擴散 定性實驗定性實驗分類：分類：（一）單向瓊脂擴散試驗 （示教）（示教） 原理原理: 適宜濃度的抗體預先在瓊脂中混勻后制成瓊脂板，以適當距離打孔，將可溶性抗原至孔中，抗原向周圍擴散，與瓊脂

7、中抗體相遇，抗原與抗體比例適宜時，出現沉淀。沉淀環的直徑與孔中抗原濃度呈正相關，可根據沉淀環直徑大小從預先繪制成的標準曲線查出待測標本中抗原含量。 本試驗方法簡單，容易觀察結果，可測定抗原的靈敏度約為1020gml. 應用應用: 人血清中IgG、IgM、IgA和C3的定量檢測。抗原濃度抗原濃度沉淀環直徑平方沉淀環直徑平方AgAgAgAg瓊脂中含抗體瓊脂中含抗體1:101:101:201:201:401:401:801:80Ag未知未知（二）雙向瓊脂擴散試驗 （操作）（操作） 原理原理: 將可溶性抗原與相應抗體兩種溶液置于瓊脂糖凝膠的不同位置，使兩者在凝膠中各自向四周擴散,抗原與抗體相遇并在比例

8、合適處形成可見的乳白色沉淀線。 應用應用: 檢測 AFP 、HBsAg, 協助疾病診斷.材料：材料：待測血清、 AFP陽性血清、AFP診斷血清（兔抗人AFP ）、生理鹽水、瓊脂板、打孔器、針頭、毛細滴管、酒精燈。雙向瓊脂擴散法測血清中AFP甲胎蛋白（甲胎蛋白（AFP）：）： 是一種在胚胎期由肝細胞和卵黃囊合成的球蛋白，存在于胎兒血清中，出生后血清中AFP幾乎消失。正常成人血清中僅含極微量的AFP，經典的免疫學方法檢測不出。 當肝細胞發生癌變時，AFP含量增高，測血清中AFP，可協助診斷原發性肝癌。1 1、制備瓊脂板：制備瓊脂板： 1%鹽水瓊脂加熱溶化，取5ml均勻鋪與載玻片上。2 2、打孔：打

9、孔： 瓊脂凝固后，用打孔器打孔成梅花型，針頭取出孔中瓊脂。封底封底： 用酒精燈輕烤平皿底部至瓊脂剛剛要熔化為止，封閉孔的底部，以防側漏。 4 4、加樣：加樣：5 5、反應：反應： 于濕盒，37C 24h?？笰FP抗體123456123456雙向擴散法測血清中AFP操作步驟AgAgAgAgAg?Ag?Ag?Ag?AbAb3421561 1、4 4兩孔（陽性對照孔）與中心孔之間應出現清晰的乳白色沉淀線，兩孔（陽性對照孔）與中心孔之間應出現清晰的乳白色沉淀線，5 5、6 6（陰性對照孔）兩孔與中心孔之間無沉淀線。（陰性對照孔）兩孔與中心孔之間無沉淀線。3421562 2、3 3兩孔（待測血清）如與中

10、心孔之間也出現了沉淀線，且一端與兩孔（待測血清）如與中心孔之間也出現了沉淀線，且一端與相鄰的陽性對照血清形成的沉淀線相吻合，則該待測血清為陽性。相鄰的陽性對照血清形成的沉淀線相吻合，則該待測血清為陽性。如待測血清與中心孔出現了沉淀線，但與陽性對照血清的沉淀線相如待測血清與中心孔出現了沉淀線，但與陽性對照血清的沉淀線相交叉，不判為陽性。交叉，不判為陽性。如待測血清如待測血清24h24h內與中心孔間無沉淀線則為陰性。內與中心孔間無沉淀線則為陰性。雙向擴散法測血清中AFP實驗結果瓊脂板一定平整、光滑瓊脂板一定平整、光滑 ( (無氣泡無氣泡) )，瓊脂不可過厚；，瓊脂不可過厚；打孔不要劃破邊緣；打孔不要劃破邊緣；加樣要加滿而不溢出為止；加樣要加滿而不溢出為止；4 4、合理分配吸管，、合理分配吸管，AgAg、AbAb吸管