1、移植腎功能減退患者腎組織中環(huán)孢素A測定及其意義摘要目的：探討免疫組織化學(xué)EnVision方法在移植腎功能減退患者腎組織中檢測環(huán)孢素A（CsA）的可能性及其意義。方法：收集我院1988年至1998年間腎移植術(shù)后長期服用CsA、血肌酐增高，臨床表現(xiàn)為移植腎功能減退的患者11例，在B超引導(dǎo)下從移植腎上極、下極穿刺活檢，正常腎組織作為對照組。采用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)檢測CsA及多藥耐藥P-gp蛋白在移植腎組織中的表達(dá)，觀察其在組織切片中的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果：本組11例腎移植患者中，有8例（72.7）CsA陽性，對照組CsA為陰性；CsA以腎小管陽性率最高（72.7），小血管次之（45.5），腎小球最低（

2、27.3）。P-gp在移植腎組織中也以腎小管表達(dá)最高（81.8），小血管次之（27.2），腎小球最低（18.1）。CsA和P-gp在移植腎組織中表達(dá)具有一致性，二者同時(shí)陽性以腎小管最高，共7例（63.6）。患者血中環(huán)孢素濃度超過正常值的次數(shù)，與環(huán)孢素在移植腎組織中的陽性率不一致。腎移植后時(shí)間的長短與移植腎組織中CsA和P-gp表達(dá)程度不相關(guān)。結(jié)論：檢測移植腎腎組織中CsA的表達(dá)，有可能成為腎移植術(shù)后監(jiān)測CsA腎毒性的一個(gè)重要指標(biāo)，而同時(shí)檢測多藥耐藥P-gp蛋白在移植腎組織中的表達(dá)，則可以提高診斷準(zhǔn)確性。關(guān)鍵詞腎移植免疫組織化學(xué)環(huán)孢素 CLINICAL SIGNIFICANCE OF CYCLO

3、SPORINE A DETECTION IN RENAL ALLOGRAFTSFAN JieWANG XianghuiXU DaWANG YaominXIAO JiaquanLIU YongNI CanrongTANG Xiaoda（Department of Urology，Shanghai First People?s Hospital，Shanghai，200080）OBJECTIVE To study the relationship between cyclosporine A nephrotoxicity and renal allograft dysfunction by det

4、ecting cyclosporine A（CsA）in renal allografts METHODOLOGY Eleven patients on triple immunosuppressive therapy（CsA，axathioprien and steroid）with renal graft dysfunction after transplantation（increased serum creatinine190 molL）underwent allograft biopsyUnder the guidance of B mode ultrasound，a protoco

5、l biopsy of the renal graft was performed and autopsy tissue sections from normal kidney served as control groupThe expressions of cyclosporine A and P-gp in renal allografts were detected by using immunohistochemical staining technique in 9 cases of chronic rejection，1 case of early acute rejection

6、，and 1 case having no lesion in histological examinationLight microscopy examination and localization of CsA and P-gh in the graft specimen were evaluated with respect to the patterns of histologic lesion RESULTS The expression of CsA was positive in eight out of 11 renal transplant recipients with

7、allograft dysfunction，and was all negative in the control groupThe incidence of the expression of CsA was 72.7（811）in renal tubule，45.5（511）in arteriol and 27.3（311）in glomeruli respectivelyThe expression of P-gp in renal tubule was 81.8（911），in arteriol 27.2（311）and in glomeruli 18.1（211）respective

8、lyThe incidence of the expression of CsA and P-gp（predominantly in renal tubule）was 63.6（711）7 of 11 renal transplant recipients who underwent the protocol biopsy had CsA nephrotoxicity proved by histological examination CONCLUSION Combined detection of cyclosporine A and P-gp is of clinical signifi

9、cance in the diagnosis of cyclosporine A nephrotoxicityKey words kidney transplantation immunohistochemistry cyclosporine A環(huán)孢素A（CsA）腎毒性是急、慢性移植腎功能減退的原因之一，但CsA腎毒性常難以與其它影響移植腎功能減退的危險(xiǎn)因素相鑒別。我們利用免疫組織化學(xué)的方法研究CsA在腎功能減退患者移植腎組織中的分布，以探索利用免疫組織化學(xué)方法在移植腎組織中檢測CsA的可能性，為診斷CsA腎毒性提供新的方法。另外，CsA能夠誘導(dǎo)腎臟等組織細(xì)胞多藥耐藥蛋白（P-gp）的表達(dá)增加

10、1，因此聯(lián)合檢測移植腎組織中CsA、P-gp的表達(dá)，則有可能提高診斷CsA腎毒性的準(zhǔn)確性。1對象和方法11臨床資料我院1988年至1998年間腎移植患者11例，臨床表現(xiàn)為移植腎功能減退，其臨床資料見表1，所有病例均在我院接受長期隨訪。以4例腎癌手術(shù)切除后的腎組織無癌區(qū)，(病理證實(shí)為正常腎組織)，作為對照組。對照組活檢取材大小為0.4cm0.6cm0.7cm。實(shí)驗(yàn)組分別在B超引導(dǎo)下從移植腎上極、下極穿刺活檢，組織塊大小約為1.50cm0.05cm0.01cm，每例取23個(gè)組織塊。活檢組織用100 gL的甲醛溶液固定，脫水，石蠟包埋，同時(shí)作HE染色。12試劑121P-gp混合單抗JSB，C219，

11、C494為丹麥DAKO公司產(chǎn)品，150稀釋。122環(huán)孢素A單抗瑞士Norvatis公司產(chǎn)品。123其它試劑EnVisionKit為丹麥DAKO公司產(chǎn)品。13實(shí)驗(yàn)方法石臘切片常規(guī)脫臘，PBS緩沖液沖洗，微波抗原修復(fù)，然后用3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化酶，PBS洗33min，依次加入一抗（CsA單抗或P-gp混合單抗），4過夜，PBS洗33min，再滴加EnVision多聚物酶復(fù)合物孵育37 30min。0.05%DAB+0.03%H2O2顯色，蘇木素復(fù)染，逐級脫水，透明封片，光鏡觀察。用PBS代替一抗作陰性對照，HE染色明確病理診斷。14免疫組織化學(xué)染色結(jié)果判定141P-gp表達(dá)?：50%以上的

12、腎小管、腎小球細(xì)胞及小血管呈陽性表達(dá)；?：25%50的腎小管、腎小球細(xì)胞及小血管呈陽性表達(dá)；+：25%以下的腎小管、腎小球細(xì)胞及小血管呈陽性表達(dá)；正常（）：內(nèi)散在個(gè)別陽性細(xì)胞，一般少于10。142CsA表達(dá)?：50%以上的腎小管、腎小球細(xì)胞及小血管陽性；?：25%50的腎小管、腎小球細(xì)胞及小血管陽性；+：25%以下的腎小管、腎小球細(xì)胞及小血管陽性；正常(-)：內(nèi)散在個(gè)別陽性細(xì)胞，一般少于10%。Table1Therelevantclinicaldataofthe11recipientswithgraftdysfunctionPatient numPatientAgeTXDateCMVIgGIn

13、creasedserumlipidsserumCr（molL）proteinuriaDopplerUSPathologyUTobstructionRI14488-12-13（）480（）（）NormalCR22892-04-30（）580（）（）NormalCR33493-10-01（）300（）（）NormalCR44194-04-26（）250（）（）NormalCR52094-07-29（）370（）（）NormalCR64095-06-01（）240（）（）NormalCR72895-12-06（）190（）（）NormalCR82496-07-06（）340（）（）NormalCR9

14、2997-09-27（）360（）（）NormalCR103898-09-01（）280（）（）NormalNorejection112898-09-23（）270（）（）NormalEarlyAR 2結(jié)果21移植腎組織中CsA分布（附b）。本組11例腎移植功能減退患者中，有8例（72.7）CsA陽性，對照組CsA為陰性。CsA陽性率在腎小管為72.7%(811)，小血管為45.5%(511)，腎小球?yàn)?7.3（311)(表2)。22P-gp在移植腎組織中表達(dá)（附a）。在腎小管表達(dá)為81.8%(911)，小血管為27.2%(311)，腎小球?yàn)?8.1（211）（表2）。23CsA和P-gp在移

15、植腎組織中分布具有一致性，二者同時(shí)分布在腎小管最多，共7例（63.6）。24患者血中環(huán)孢素濃度超過正常值2的次數(shù)，與CsA在移植腎組織中分布不一致。其中2例CsA陰性的患者，血中濃度曾經(jīng)超過正常范圍。腎移植手術(shù)時(shí)間的長短與移植腎組織中CsA和P-gp表達(dá)強(qiáng)度也無相關(guān)性（Spearman等級相關(guān)分析，r0.17，P0.05）。25對照組CsA在正常腎組織中表達(dá)均為陰性，P-gp表達(dá)分別為2例（），1例（），1例（）。 Fig1 Histochemical staining of CsA and P-gp in renal allograft biospy tissue sectionsaP-gp

16、（132） bCsA（132） cP-gp control（66） dCsAcontrol（33） Table2TheexpressionofCsAandP-gpinrenalallograftPatient numberMonthsafterTXCsAP-gpTimesofincreasedCsAdetectionTubulesGlomeruliVesselsTubulesGlomeruliVessels1120()（）()()（）()0276()()()()(+)（）7（359.2632.2）358（）（）（）()（）（）1（429.3）447（）（）（）（）（）（）3（402.9476.

17、3）548NANANA()（）（）2（339.3356.0）638()（）()()（）()4（394.8867.9）731()()()（）（）（）4（305.0379.8）829()（）()()()（）099()()（）()（）（）3（377.4487.7）104()（）（）()（）()7（315.7438.2）110.5()（）（）()（）（）1（504.9） TX：transplantation；NA：datanotavailable 3討論環(huán)孢素的應(yīng)用使人腎存活率有了顯著提高，但CsA腎毒性卻成為移植腎功能減退的重要因素之一。腎移植術(shù)后腎功能減退通常由急性排斥、慢性排斥、CsA導(dǎo)致的腎毒

18、性以及其它腎臟疾病引起3，4，臨床上若急性排斥合并CsA腎毒性或慢性排斥合并慢性CsA腎中毒時(shí)則難以鑒別。急性CsA中毒的診斷可通過監(jiān)測血中濃度加以判定，但CsA慢性腎毒性的診斷則比較困難，因?yàn)?5患者的CsA血濃度在正常范圍5，因此常需借助于病理檢查。CsA導(dǎo)致腎臟出現(xiàn)蔥皮樣變（或片狀纖維化）和玻璃樣動脈粥樣硬化的病理改變6，在腎小管上皮出現(xiàn)空泡樣變性，有時(shí)在線粒體內(nèi)出現(xiàn)粥樣小滴。本組711例（63.6）患者HE切片中，出現(xiàn)不同程度腎小管上皮空泡樣變性、玻璃樣變和腎小管萎縮等病理改變。這些變化說明CsA已對移植腎上皮細(xì)胞造成了損害7，8。然而，這些病理變化缺乏特異性，因此，很難單純依賴普通的

19、HE染色方法將其與排斥反應(yīng)鑒別1。因此，我們利用免疫組織化學(xué)的方法在組織中直接定位檢測CsA，以探討CsA腎毒性在移植腎功能減退中的作用，為臨床調(diào)整環(huán)孢素的使用提供參考。本組11例移植腎功能減退患者中，9例明確診斷為慢性排斥（81.8），其中6例(66.7%)檢測到CsA。即這6例慢性排斥患者可能同時(shí)合并有慢性CsA腎中毒。另外2例CsA陽性患者中，一例診斷為早期急性排斥，CsA血濃度超過正常值僅1次，經(jīng)調(diào)整免疫抑制藥物移植腎功能恢復(fù)正常；另一例病理檢查排除排斥反應(yīng)，但出現(xiàn)腎小管上皮變性、腔隙擴(kuò)張，間質(zhì)毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血等CsA慢性腎毒性的病理改變，而且CsA血濃度在短期內(nèi)多次超過正常范圍，因

20、此，慢性CsA腎中毒的可能性較大。Jette等1報(bào)道CsA能夠誘導(dǎo)多藥耐藥蛋白（P-gp）的表達(dá)增加，而對腫瘤細(xì)胞CsA則能夠阻止細(xì)胞P-gp表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性。因此，我們檢測了本組病例腎穿組織P-gp表達(dá)的情況。結(jié)果顯示，本組81.8%(911)的病例有P-gp表達(dá)，同時(shí)有P-gp和CsA表達(dá)的病例占63.6%(711例)。這可能是因?yàn)镃sA作用于移植腎組織，誘導(dǎo)P-gp的表達(dá)增加，從而發(fā)揮P-gp蛋白“泵”的功能，以將環(huán)孢素排出細(xì)胞外而達(dá)到對細(xì)胞解毒的作用1。這一現(xiàn)象提示，通過監(jiān)測移植腎組織中P-gp的表達(dá)，可以間接反應(yīng)CsA腎毒性的情況。CsA的相對不溶性使其易于沉積在

21、腎小管上皮細(xì)胞中，這是它最易導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞損傷的重要原因5。本組病例中，CsA和P-gp在腎小管表達(dá)最多，進(jìn)一步提示CsA可能主要沉積在腎小管上皮導(dǎo)致腎毒性。檢測移植腎組織中CsA和P-gp表達(dá)，為尋找診斷CsA導(dǎo)致腎毒性的方法提供了線索。為證實(shí)上述結(jié)論的正確性，除需進(jìn)一步增加病例外，尚需對應(yīng)用CsA而移植腎功能正常的移植受者腎組織進(jìn)行對照觀察研究。凡杰（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，200080）王祥慧（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，200080）徐達(dá)（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，200080）王躍閩（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，200080）肖家全（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，2

22、00080）劉永（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，200080）倪燦榮（上海第二軍醫(yī)大學(xué)免疫病理室）唐孝達(dá)（上海市第一人民醫(yī)院泌尿科上海，200080）參考文獻(xiàn)1，Jette L，Beaulieu E，Leclerc JM et alCyclosporine A treatment induces over expression of P-glycoprotein in the kidney and other tissuesAm J Physiol，1996 May，270（5 Pt 2）：F7562，朱有華，孟 鋼，閔志廉等腎移植受者環(huán)孢素A治療窗濃度的臨床研究中華泌尿外科雜志，1998，2：673，Benigni A，Bruzzi I，Mister M et alNature and mediators of renal lesions in kidney transplant patients given cyclosporine for more than one yearKidney Int，1999 Feb