1、氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH1 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析 彭花萍彭花萍 E-mail: 儀器分析實驗儀器分析實驗 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH2 目的要求：目的要求： 1、了解高效液相色譜的基本原理、了解高效液相色譜的基本原理 2、了解高效液相色譜儀的結構及正確使用、了解高效液相色譜儀的結構及正確使用 3、學習外標法測定組分的含量、學習外標法測定組分的含量 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH3 色譜起源色譜起源 石油醚石油醚 碳酸碳酸鈣顆鈣顆粒粒 色素色素混合物混合物 色色譜譜 分離分離組組分分 植物的石油醚提取液在 碳酸鈣吸附劑填充的玻 璃管中

2、分離出葉綠素及 其他色素 流動相：流動相：攜帶樣品流過攜帶樣品流過 整個系統的流體整個系統的流體 固定相：固定相：靜止不動的一靜止不動的一 相，色譜柱相，色譜柱 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH4 色譜法分離的基本原理：色譜法分離的基本原理： 各組分性質結構差異各組分性質結構差異 與固定相相互作用差異與固定相相互作用差異 隨流動相移動的速度不等隨流動相移動的速度不等 反復多次分配平衡反復多次分配平衡(吸附吸附解吸解吸) 保留時間不同保留時間不同 達到分離效果達到分離效果 A+B+C A B C C B A C B A C CB 色譜洗脫過程與色譜圖色譜洗脫過程與色譜圖 t，min AB C

3、信號信號 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH5 0.00.51.01.52.02.53.0min 0 100 200 300 400 500 mV Methyl Paraben Ethyl Paraben Propyl Paraben Butyl Paraben 色譜法：利用組分在兩相間分配系數不同而進行分色譜法：利用組分在兩相間分配系數不同而進行分 離的技術離的技術 色譜定義色譜定義 v色譜是一種色譜是一種分離分離技術技術. . v色譜的主要目的是對混合物中的目標物色譜的主要目的是對混合物中的目標物分離分離和和定量定量 色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產色譜圖即色譜柱流出物通過檢測器時所產

4、 生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為生的響應信號對時間的曲線圖，其縱坐標為 信號強度，橫坐標為保留時間信號強度，橫坐標為保留時間。 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH6 保留體積保留體積V VR R 調整保留體積調整保留體積V VR R 死體積死體積V V0 0 峰面積峰面積 相對保留值相對保留值 保留指數保留指數 V=t.FcV=t.Fc；FcFc為流動相流速為流動相流速 保留值保留值 區域寬度區域寬度 WW1/2 1/2=2.335 =2.335 W=4W=4 W1/2 W 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH7 液相色譜液相色譜 按流動相與固定相的分子聚集狀態分類按流動相與固定相的分子

5、聚集狀態分類 流動相流動相 固定相固定相 氣體氣體 (gas,G) 液體液體 (liguid,L) 超臨界流體超臨界流體 (supercrttical fluid,SF) 固體固體(solid,S)GSCLSCSFSC 液體液體(liguid,L)GLCLLCSFLC 化學鍵合相化學鍵合相 (bonded phase,BP) GBPCLBPCSFBPC 氣相色譜氣相色譜液相色譜液相色譜超臨界色譜超臨界色譜 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH8 液相色譜液相色譜：以：以液體液體作為流動相的色譜分離方法作為流動相的色譜分離方法 適用于高沸點、大分子、強極性和熱穩定性差的化合物的適用于高沸點、大分子

6、、強極性和熱穩定性差的化合物的 分析分析 流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用流動相具有運載樣品分子和選擇性分離的雙重作用 HPLC 是一種區別于經典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段：是一種區別于經典液相色譜，基于儀器方法的高效能分離手段： 高精度、耐高壓的輸液泵高精度、耐高壓的輸液泵 高性能的色譜柱高性能的色譜柱 高靈敏度的檢測器高靈敏度的檢測器 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH9 HPLC特點特點 分離性能好分離性能好 靈敏度高（靈敏度高（10-910-12 g） 選擇性高（同分異構，旋光異構）選擇性高（同分異構，旋光異構） 分析速度快分析速度快 進樣量?。ㄟM樣量?。?-1

7、00 m mL） 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH10 1010 藥物分析（抗生素、維生素）藥物分析（抗生素、維生素） 臨床分析（藥物代謝）臨床分析（藥物代謝） 化學品（鄰苯二甲酸、醛、酮、藥物中間體）化學品（鄰苯二甲酸、醛、酮、藥物中間體） 環境（多環芳烴、農殘、微嚢藻毒素）環境（多環芳烴、農殘、微嚢藻毒素） 食品（孔雀石綠、蘇丹紅）食品（孔雀石綠、蘇丹紅） 生命科學（蛋白質、多肽）生命科學（蛋白質、多肽） 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH11 流動相流動相 高壓泵高壓泵 色譜柱色譜柱 檢測器檢測器 高壓輸高壓輸 液系統液系統 分離系統分離系統檢測系統檢測系統記錄系統記錄系統 A EG

8、B C D F 進樣閥進樣閥 進樣進樣 系統系統 預備柱預備柱 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH12 1212 分析前，分析前，選擇適當的色譜柱和流動相選擇適當的色譜柱和流動相，開泵開泵，沖洗柱子沖洗柱子， 待柱子達到平衡而且待柱子達到平衡而且基線平直基線平直后，用微量注射器把樣品注入后，用微量注射器把樣品注入 進樣進樣口，流動相把試樣帶入色譜柱進行口，流動相把試樣帶入色譜柱進行分離分離，分離后的組分，分離后的組分 依次依次流入檢測器的流通池流入檢測器的流通池，最后和洗脫液一起，最后和洗脫液一起排入流出物收排入流出物收 集器集器。當有樣品組分流過流通池時，檢測器把組分濃度轉變當有樣品組分流過

9、流通池時，檢測器把組分濃度轉變 成電信號，經過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。成電信號，經過放大，用記錄器記錄下來就得到色譜圖。色色 譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據。譜圖是定性、定量和評價柱效高低的依據。 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH13 美國美國AgilentAgilent美國美國WatersWaters日本島津日本島津 常用的高效液相色譜儀常用的高效液相色譜儀 LC-15C 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH14 4.2.2 高效液相色譜主要部件高效液相色譜主要部件 (1) 泵輸液系統泵輸液系統 主要部件之一，壓力：主要部件之一，壓力：1535MPa。提供高壓流動相。提供高

10、壓流動相 應具有壓力平穩，脈沖小，流量穩定可調，耐腐蝕等特性。應具有壓力平穩，脈沖小，流量穩定可調，耐腐蝕等特性。 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH15 (2) 進樣裝置進樣裝置 流路中為高壓力工作狀流路中為高壓力工作狀 態，通常使用耐高壓的態，通常使用耐高壓的六六 通閥通閥 其結構如圖所示：其結構如圖所示： 泵泵 柱柱 進樣進樣 排放排放 泵泵 排放排放 柱柱 進樣進樣 六通閥是很好的定量裝置，使得六通閥是很好的定量裝置，使得 高效液相色譜的進樣量得到準確高效液相色譜的進樣量得到準確 的控制。的控制。 定量環定量環 裝填狀態裝填狀態進樣狀態進樣狀態 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH16

11、色譜柱（色譜柱（C18柱，柱，ODS） ODS柱是一種常用的反相色譜柱，也叫柱是一種常用的反相色譜柱，也叫C18柱；由于它是柱；由于它是 長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，適合分長鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，適合分 離有機物，因此在分析工作中應用的最為廣泛。離有機物，因此在分析工作中應用的最為廣泛。 常用流動相：水、甲醇、乙腈常用流動相：水、甲醇、乙腈 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH17 目前最普遍的檢測器目前最普遍的檢測器 測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失測量通過溶液后的紫外或可見光光強度的損失 吸光度與樣品濃度呈線性關系吸光度與樣品濃度呈線性關系 在

12、被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大在被測物的最大吸收波長處檢測時靈敏度最大 紫外檢測器紫外檢測器 朗伯朗伯比爾定律比爾定律 0 lg I Ecl I 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH18 眼藥水中的氯霉素眼藥水中的氯霉素 氯霉素滴眼液氯霉素滴眼液 用于治療由大腸桿用于治療由大腸桿 菌、流感嗜血桿菌、克雷伯菌屬、金黃菌、流感嗜血桿菌、克雷伯菌屬、金黃 色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和其他敏感色葡萄球菌、溶血性鏈球菌和其他敏感 菌所致眼部感染，如沙眼、結膜炎、角菌所致眼部感染，如沙眼、結膜炎、角 膜炎、眼瞼緣炎等。膜炎、眼瞼緣炎等。 為無色或幾乎無為無色或幾乎無 色的澄明液體。色的澄明液體。 其主

13、要成份其主要成份氯霉素氯霉素，輔料為硼酸、，輔料為硼酸、 硼沙、氯化鈉、防腐劑等硼沙、氯化鈉、防腐劑等 氯霉素氯霉素 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH19 條件：需要已知濃度的標準樣品條件：需要已知濃度的標準樣品 待測成分與雜質間分離良好待測成分與雜質間分離良好 對照品對照品 20ul 成份成份 A 樣品樣品 20uL 成份成份 A 峰面積峰面積A樣品 樣品 峰面積峰面積A對照 對照 外標一點法外標一點法 色譜定量：色譜定量： 峰面積與樣品濃度峰面積與樣品濃度 成正比。成正比。 AA CC 樣品對照 對照樣品 已知濃度已知濃度 的氯霉素的氯霉素 溶液溶液 眼藥水稀眼藥水稀 釋液釋液 氯霉素眼

14、藥水的高效液相色譜分析PH20 氯霉素含量的測定氯霉素含量的測定 精密吸取眼藥水精密吸取眼藥水10mL，用，用7:3的水的水:甲醇溶液稀釋至甲醇溶液稀釋至 250.0mL，配制成眼藥水的稀釋溶液，配制成眼藥水的稀釋溶液 1、對照品配制（、對照品配制（0.1mg/mL) 用清洗溶劑清洗微量進樣針三次，用待測溶液潤洗三次，用清洗溶劑清洗微量進樣針三次，用待測溶液潤洗三次， 吸取待測溶液約吸取待測溶液約25L，進樣，記錄，進樣，記錄5分鐘，得色譜圖。分鐘，得色譜圖。 2、眼藥水樣品配制、眼藥水樣品配制 精密稱取精密稱取25.0mg氯霉素樣品，用氯霉素樣品，用5mL甲醇溶解，用甲醇溶解，用7:3的的

15、水水:甲醇溶液稀釋至甲醇溶液稀釋至250.0mL，配制成，配制成0.1mg/mL的對照品溶液的對照品溶液 3、色譜測試、色譜測試 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH21 色譜條件：色譜條件： 色譜儀色譜儀 島津島津LC-15C高效液相色譜高效液相色譜 色譜柱色譜柱 C18柱（柱（5m，1504.6mm） 柱溫柱溫 室溫室溫 流動相流動相 甲醇甲醇 水（水（ 70 30 ） 流速流速 1.000ml/min 波長波長 272nm 氯霉素眼藥水的高效液相色譜分析PH22 色譜操作步驟：色譜操作步驟： 1、依次打開檢測器、泵的開關、依次打開檢測器、泵的開關 2、打開電腦主機，打開操作界面、打開電腦主機，打開操作界面 3、排氣泡、排氣泡 4、設置色譜條件，打開泵開關、設置色譜條件，打開泵開關 5、讓流動相沖洗色譜系統，至色譜基線水平，約半小時、讓流動相沖洗色譜系統，至色譜基線水平，約半小時 6、基線調零，填寫數據文件名及信息、基線調零，填寫數據文件名及信息 7、單次運行，進樣并記錄數據、單次運行，進樣并記錄數據 8、數據處理