1、 自制多聚胺陽離子脂質體轉染效率及細胞毒性的評價 作者：孫瑞琳，金發光，吳道澄，吳紅，劉彬，溫德升 【關鍵詞】 多聚胺陽離子脂質體；制備；轉染 Evaluation of transfection efficiency and cytotoxicity of selfprepared polyamine cationic liposome 【Abstract】 AIM: To evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity of polyamine cationic liposomeprepared by : PCL with pol

2、yamine cationic lipids TCChol and neutral phospholipid DOPE at a molar ratio of 31 was prepared, and PCL or Lipofectamine 2000 mediated by the plasmid PIRES2EGFP was transfected into HeLa cells or Hep2 cells, and the expression of EGFP was determined by fluorescence survival fraction was determined

3、by MTT to evaluate the transfection efficiency and cytotoxicity after transfection. RESULTS: The transfection efficiency of PCL prepared with TCChol and DOPE at a molar ratio of 31 was a few lower than that of Lipofectamine 2000, but the cytotoxicity of the former was less than the latter. CONCLUSIO

4、N: PCL has a sound transfection activity and less cytotoxicity compared with Lipofectamine is shown to be promising for gene transfection and gene therapy. 【Keywords】 polyamine cationic liposome; preparation; transfect 【摘要】 目的： 評估制備的多聚胺陽離子脂質體轉染哺乳動物細胞的轉染效率及細胞毒性. 方法： 多聚胺陽離子脂質TCChol與中性磷脂DOPE以31摩爾比，制備多聚

5、胺陽離子脂質體，通過轉染以增強型綠色熒光蛋白為報告基因的質粒PIRES2EGFP入HeLa細胞, Hep2細胞，倒置熒光顯微鏡下檢測轉染細胞的報告基因表達，通過MTT法，檢測細胞存活分數，并以Lipofectamine2000為對照，評價制備陽離子脂質體轉染效率及細胞毒性. 結果： 多聚胺陽離子脂質體轉染效率略低于Lipofectamine 2000，但細胞毒性較低,為一種相對高效低毒的陽離子脂質體. 結論： 多聚胺陽離子脂質體為一種相對高效低毒的陽離子脂質體，在基因轉染和基因治療方面具有較廣闊的前景. 【關鍵詞】 多聚胺陽離子脂質體；制備；轉染 0引言 基因治療能否成功最重要的影響因素是基因

6、轉染載體. 陽離子脂質體能與目的基因以靜電作用相結合，可攜帶的外源基因容量較大, 且不含抗原成分，細胞毒性低，可被機體降解，能多次反復轉染，因此成為一種有臨床應用潛力的基因轉染載體1. 多聚胺陽離子脂質體 易與核酸形成靜電復合物而自由通過親脂性膜，因此，是陽離子脂質體中效果較好的核酸運載載體2. 本研究旨在以Invitrogen公司陽離子脂質體Lipofectamine2000為對照，轉染帶有增強型綠色熒光蛋白EGFP質粒PIRES2EGFP入HeLa細胞或Hep2細胞，通過熒光顯微鏡觀察報告基因的表達，評價PCL的轉染效率，通過MTT法檢測細胞存活分數，評價自制PCL的細胞毒性. 1材料和方

7、法 材料TCChol， 二油酰磷脂酰乙醇胺DOPE， Lipofectamine 2000 ，質粒PIRES2EGFP，感受態細胞DH5均由我校免疫教研室楊安鋼教授惠贈，質粒微量抽提試劑盒，DMEM培養基，胎牛血清，24孔培養板，96孔培養板，MTT. 方法 的制備3-4TCChol溶于適量氯仿后，分別與DOPE以11，31摩爾比混合， 在茄形瓶中振蕩搖勻使形成一層薄膜，真空除去有機溶劑，同時加Hepes，水浴超聲約510 min制備PCL，透射電鏡檢測后4保存. 質粒DNA提取與純化5質粒PIRES2EGFP轉化感受態細胞DH5, 37, 200 r/min搖菌過夜，質粒微量抽提試劑盒提取質

8、粒，取少許稀釋后，紫外分光光度計，以洗脫液為調零孔，測量A230 nm, A260 nm，A280 nm，以A260 nm/A230 nm, A260 nm/A280 nm為合格質粒，-20保存備用.體外細胞轉染6-7轉染前1 d，胰酶消化HeLa細胞，Hep2細胞并計數，按12105/孔接種于24孔培養板中，置37, 50 mL/L孵箱中培養使其在轉染日密度為80%. 對于每孔細胞，使用50 L無血清DMEM培養基稀釋 g質粒，按照脂質體與質粒不同質量比分別用50 L無血清DMEM培養基稀釋陽離子脂質體，每組4孔，在10 min內同稀釋的質粒混合并靜置30 min，形成PCL/DNA復合物，

9、Lipofectamine2000/DNA復合物. 用滴管吸去含血清培養基，用無血清DMEM培養基漂洗細胞2次,替換為 mL無血清培養基, 分別將復合物加入到每孔中，搖動培養板，輕輕混勻以使復合物充分散開. 在37，50 mL/L的CO2中孵育，5 h后換含100 mL/L胎牛血清DMEM培養液.基因轉染效率測定轉染后48 h，倒置熒光顯微鏡.細胞毒性檢測MTT試驗轉染后12 h將各孔細胞分別吸出，按1104/孔傳至96孔培養板，至48 h每孔加入5 g/L MTT, 37，50 mL/L的CO2中繼續孵育4 h后將上清液吸棄并加入 DMSO，以無血清 DMEM 為調零孔，以未轉染細胞為對照組

10、，酶聯免疫檢測儀測A490 nm，并計算細胞存活分數.統計學處理： 采用軟件進行統計學分析，數據均以xs表示，組間比較采用成組t檢驗，P 2結果 轉染效率評價 轉染HeLa細胞、Hep2細胞后48 h熒光顯微鏡觀察. A： PCL轉染HeLa細胞后48 h；B： PCL轉染Hep2細胞后48 h；C： Lipofectamine 2000轉染HeLa細胞后48 h；D： Lipofectamine 2000轉染Hep2細胞后48 h. 圖1PCL或Lipofectamine 2000轉染PIRES2EGFP入HeLa細胞或Hep2細胞10 分別比較PCL與Lipofectamine 2000轉

11、染HeLa細胞，Hep2細胞48 h后轉染效率，結果表明，PCL轉染效率略低于Lipofectamine 2000. aP 圖2PCL, Lipofectamine 2000轉染PIRES2EGFP入HeLa細胞、Hep2細胞轉染效率比較 細胞毒性評價MTT法分別比較PCL，Lipofectamine 2000轉染HeLa細胞48 h后存活分數，分別為%，%，經統計學分析，二者有顯著性差異；檢測PCL, Lipofectamine2000轉染后Hep2細胞48 h后存活分數分別為%, %, 經統計學分析，二者有顯著性差異. 結果表明，PCL細胞毒性低于Lipofectamine 2000. 3

12、討論 影響基因轉染效率的因素很多3，包括細胞種類，轉染時間，載體結構，脂質體/DNA復合物內部凈電荷數量8，脂質體粒徑大小等方面，此外Li等9認為脂質體DNA復合物中兩者比例對基因轉染效率也有重要的影響. 我們在前期試驗中制備四種PCL，并按照PCL與DNA 的不同質量比，通過轉染質粒PIRES2EGFP入HeLa細胞，檢測轉染后不同時間的轉染效率和細胞存活分數，發現轉染后48 h，轉染效率最高，陽離子脂質體與DNA結合比例為341時，同時篩選出相對高效低毒PCL. 本研究利用前期制備并篩選出的PCL，采用前期實驗篩選的PCL與DNA比例，轉染時間等12下一頁 參數，通過轉染攜帶綠色熒光蛋白報

13、告基因的質粒PIRES2EGFP進入HeLa細胞，Hep2細胞，通過熒光顯微鏡檢測EGFP的表達，反映PCL的轉染效率，研究發現，本實驗制備的PCL轉染效率略低于Lipofectamine2000. 轉染HeLa細胞、Hep2細胞，前者轉染效率較高，其機制尚不清楚，考慮可能與細胞攝取能力有關，但尚不能認為HeLa細胞攝取任何脂質體的能力均強于Hep2細胞. 通過MTT法檢測細胞存活分數，實驗發現，轉染后48 h, PCL組較Lipofectamie 2000組表現出較小的細胞毒性，考慮PCL同Lipofectamine 2000相比，其疏水基團前者為膽固醇，后者為兩條長鏈脂肪酸鏈，而膽固醇成分

14、同細胞膜結構成分類似有關，因此細胞毒性較小. 同時有學者報道，多聚胺膽固醇陽離子脂質以膽固醇基團替代兩條長鏈脂肪酸后，從而親水基團與膽固醇基團形成“T”空間結構3， 且與DNA形成的復合物更穩定10，從而提高由其組成的載體的轉染效率.綜上所述，本實驗中成功制備的PCLTCCholDOPE 31具有轉染效率較高，細胞毒性較小的特點，在基因治療方面具有廣闊的應用前景. 【參考文獻】 1 Ropert as a gene delivery systemJ. Braz J Med Biol Res, 1999,32:163-169. 2 Lee ER, Marshall J, Siegel CS, e

15、t al. Detailed analysis of structures and formulations of cationic lipids for high efficient gene transfer to the lungJ. Hum Gene Ther, 1996,7:1701-1717. 3 Judith K, Guy C, Veeraiah B, et al. Novel polyaminolipids enhance the cellular uptake of oligonucleotidesJ. J Biol Chem, 1995,270:31391-31396. 4

16、 Xiang G, Leaf H. A novel cationic liposome reagent for efficient transfection of mammalian cellsJ. Biochem Biophys Res Commun,1991,179:280-285. 5 J.薩姆布魯克， 弗里奇，T. 曼尼阿蒂斯.分子克隆實驗指南M. 2版. 北京： 科學出版社，1992：16-19. 6 Choi JS, Lee EJ, Jang HS, et al. New cationic liposomes for gene transfer into mammalian cel

17、ls with high efficiency and low toxicityJ. Bio Chem, 2001, 12:108-113. 7 Kim YJ, Kim TW, Chung H, et al. The effects of serum on the stability and the transfection activity of the cationic lipid emulsion with various oilsJ. Int J Pharm, 2017,252:241-252. 8 韓一生，胡蘊玉，金格樂，等.脂質體介導下重組pcDNA3Hbmp3轉染兔關節軟骨細胞的條件J.第四軍醫大學學報，2001,22:987-990. 9 Li W, Ishida T, Okada Y, et al. Increased gene express