1、PCR實驗室設計說明 PCR實驗室分為四個區域，進入各工作區域必須嚴格按照單一方向進行，不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開各工作區域時，不得將工作服帶出，四區域分別為：1.試劑配制區n2.樣品處理區n3.核酸擴增區n4.產物分析區n如使用全自動分析儀，區域可適當合并,三四區可合并為擴增產物分析。各區的功能是：1.1.1 試劑準備區：擴增試劑的配制、分裝和保存。1.1.2 樣品處理區：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。1.1.3 擴增產物分析區：擴增產物的測定、結果分析、登記及報告。1.2 擴增前區與擴增后區應嚴格分開，須使用不同的房間，兩區之間最好有一定的間隔。

2、1.3 使用商品化試劑盒可在樣品處理區進行少量試劑配制。 1.4 在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區和試劑準備區可設在同一房間內：1.4.1 在生物安全柜內操作。1.4.2 每個實驗人員、實驗組分別使用各自的試劑及耗材。1.4.3 盛放污染材料的器皿密封并一次性使用。1.4.4 用有效的方法對操作區域和共享器具在實驗前后進行清潔及消毒。設計要求： PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式,現要主要是以組合形式為主流。完成一組PCR實驗，通常應經過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應增加樣品粉碎過程。一、分散形式PCR實驗室 所謂分散形式PCR

3、實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。二、組合形式PCR實驗室 所謂組合形式PCR實驗室, 是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統具有一定的要求。各室在入口處設緩沖間，以減少室內外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染,可以通過控制進風風量大于排風風量達到正壓效果。核酸擴增室及產物分析室應呈微負壓，以防含核酸的

4、氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風風量大于進風風量達到負壓效果。在理想情況下，PCR實驗室緩沖間內，可設置正壓，使室內空氣不流向室外，室外空氣不流向室內。PCR實驗室進風由原有中央空調控制，要求將中央空調風口安裝到指定定點，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。如果使用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。 各個區域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。實驗室的墻體，包括頂棚，

5、應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。如果使用熒光PCR儀，擴增室和產物分析室可以合并。若房間進深允許，可設PCR內部專用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。 各個區域之間應具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產生假性結果。實驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿足無縫隙、無滲漏、光潔

6、、耐腐蝕的要求。主要設備試劑準備區儀器設備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等，加樣器、天平除了要專用外，還應有定期校準。試劑分裝應在超凈臺中進行擴增反應混合液應使用分子生物學級的，試劑制備好后應有質檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。標本制備區 儀器設備主要有生物安全柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等擴增區擴增區的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機、可移動紫外燈。擴增儀需進行校準。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴增效果的影響。分析區本區所使用的儀器設備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等潔凈實驗區的緩沖間部分面積不能超過主實驗室的八分之一,這

7、是有規定的.1、 主體結構：主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結構牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。2、 標準的四區分隔和氣壓調節：將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增，產物分析四個獨立的實驗區。整個區域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區設置有緩沖區，同時各區通過氣壓調節，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產物對人員和環境的污染。可打開緩沖區，緩沖區和 PCR 擴增區的排風扇往外排氣，在實驗區的外墻上和各扇門上都安裝有風量可調的回風口，空氣通過回風口向室內換氣。3、 消毒：在三個實驗

8、區和三個緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。在試劑準備區和標本制備區 還設置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。4、 不銹鋼傳遞窗：試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。5、 地面地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。6、 照明燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。在建設的過程中應注意：規范的安裝流程和全面的服務流程。嚴格按照規范科學設計的安裝流程。安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進線位置，電話網絡線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通

9、風孔、進水管和下水管的位置等，理想狀態的空間尺寸樣本處理區三、工作區域及設備要求 （一） 試劑儲存和準備區 1、2-8C和-15C冰箱 2、混勻器 3、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 4、移動紫外燈（近工作臺面） 5、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 6、專用工作服和工作鞋 7、專用辦公用品 （二） 標本制備區 1、2-8C冰箱、-20C或-80C冰箱 2、高速臺式冷凍離心機 3、混允器 4、水浴箱或加熱模塊 5、微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 6、可移動紫外燈（近工作臺面） 7、生物安全柜 8、消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離

10、心管和加樣器吸頭（帶濾心） 9、專用工作服和工作鞋 10、專用辦公用品 如需處理大分子DNA，應具有超聲波水浴儀。 （三） 擴增反應混合物配制和擴增區 1、 核酸擴增儀 2、 微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 3、 可移動紫外燈（近工作臺面） 4、 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、耐高壓處理的離心管和加樣器吸頭（帶濾心） 5、 專用工作服和工作鞋 6、 專用辦公用品 (四)擴增產物分析區 視檢驗方法不同而定。基本儀器設備如下： 1、 微量加樣器（覆蓋1-1000ul） 2、 可移動紫外燈（近工作臺面） 3、 消耗品：一次性手套、一次性吸水紙、加樣器吸頭（帶濾心） 4、 專用工作服和工作鞋

11、5、 專用辦公用品5.人員和樣品的安全是由生物安全柜和定向氣流共同來保證。PCR實驗室設計規程中規定人員和樣品必須單向流動。即從 “試劑準備區到樣品制備區，再從樣品制備走向擴增區和產物分析區”，絕對不能反向流動，以辟免交叉污染。氣流方向只規定試劑準備區為微正壓或常壓，樣品制備區為常壓或負壓，擴增區和產物分析區為負壓，壓力梯度是從試劑準備到產物分析區，是高到低的。規程并沒有規定要做成全新風系統，但是為降低交叉污染的風險，建議做成全新風系統。1概述臨床基因擴增實驗又稱PCR實驗，是專門用來檢驗艾滋病、乙型肝炎、禽疫病等病毒感染性疾病的一種檢測手段。它可以通過將病毒體內所含的基因進行擴增的方法，測出

12、一些病毒含量不高的感染者體內是否含有特定的病毒。由于該檢測方法可以測出普通檢驗難以檢測出的病毒并具有靈敏度高、特異性高、快捷、對樣品要求低等優點，因此被臨床醫生廣為認可，已廣泛應用于醫院的臨床診斷和各防疫檢測部門的禽疫病診斷。但是，這種實驗需要有能保證絕對安全、配置合理的實驗室和非常規范的操作為前提。近年來對臨床基因擴增檢驗實驗室的建設越來越得到重視，因為它對檢測結果的可靠性、準確性和安全性起到至關重要的作用。本文主要從臨床基因擴增檢驗實驗室的平面布局，空調通風系統設計、氣流控制和污染的防制幾個方面對實驗室設計中的主要特點進行了闡述。臨床基因擴增檢驗實驗室設計的核心問題是如何避免污染。因此，實

13、驗室的平面布局、空調通風系統設計、氣流控制等都是圍繞這個核心問題進行的。下面就對這幾個方面分別進說明。2PCR實驗室平面布局臨床基因擴增檢驗實驗室原則上分為四個單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增反應混合物配制和擴增區、擴增產物分析區。為避免交叉污染，進入各個工作區域必須嚴格遵循單一方向進行，即只能從試劑貯存和準備區標本制備區擴增反應混合物配制和擴增區擴增產物分析區。各實驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過傳遞窗進行。PCR實驗室平面布置示意圖如圖1所示。圖1PCR實驗室平面布置示意圖3實驗室空調通風系統設計及壓力控制PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區域間交叉污染的

14、可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區的壓力要求。3.1試劑貯存和準備區該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區并沒有嚴格的要求。3.2標本制備區該區域主要進行的操作為臨床標本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定RNA時cDNA的合成。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會發生氣

15、溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動。3.3擴增反應混合物配制和擴增區該區域主要進行的操作為DNA或cDNA擴增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進行。在巢式PCR測定中，通常在第一輪擴增后必須打開反應管，因此巢式擴增有較高的污染危險性，第二次加樣必須在本區內進行。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動。個別操作如加樣等應在超凈臺內進行。3.4擴增產物分析區該區域主要進行的操作為擴增片段的測定。如使用

16、全自動封閉分析儀器檢測，此區域可不設。本區是最主要的擴增產物污染來源，因此對本區的壓力梯度的要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免擴增產物從本區擴散至其它區域。4污染的預防與控制PCR實驗室設計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結果必須作廢，需重新進行實驗。所以發生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應是預防，而不是排除。4.1工作區域的嚴格劃分（1）各個實驗區域設置合理；（2）各個實驗區域

17、要有明顯的標記（如醒目的門牌或不同的地面顏色等），以避免各個不同實驗區域設備物品、試劑等發生混淆。4.2合理的系統設置（1）合理的空調通風系統設置，盡量采用全送全排的空調系統；（2）嚴格的氣流壓力控制，保證不同的實驗區內不同的壓力要求。4.3規范的操作（1）臨床基因擴增檢驗實驗室的技術人員必須進行上崗培訓，經培訓合格后才能從事臨床基因擴增檢驗的工作；（2）在實驗操作過程中，操作者必須戴手套，并經常更換。此外，操作中使用一次性帽子也是一個有效地防止污染的措施；（3）清潔工作及時、正確。實驗工作結束后，必須立即對本區進行清潔。除常規的消毒液體對表面進行擦拭消毒或紫外線燈的照射消毒外，對一些實驗設備

18、還應進行高壓消毒處理。4.4嚴格的管理（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設置獨立的通道和進出整個實驗區的門；（2）在各個實驗區域使用帶有明顯區別標志的工作服（如不同顏色），當工作人員離開時不得將本區的工作服帶至其它區域；（3）盡量減少在實驗區內不必要的走動以減少交叉污染的可能性。（4）擴增產物分析區是最主要的擴增產物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應經消毒液浸泡消毒后統一處理，如焚燒等；（5）擴增產物分析區可能會用到某些可致基因突變和有毒物質，應特別注意實驗人員的安全防護。

19、4.5完備的實驗室配套設施完備的實驗室配套設施是保證實驗工作的必要條件，應根據各個實驗室實驗內容的不同配備相應的設備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風的比例以保證各實驗區的壓力要求。 3.1 試劑貯存和準備區 該實驗區主要進行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于標本制作的材料應直接運送至該區，不得經過其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。 對與氣流壓力的控制，本區并沒有嚴格的要求。 3.2 標本制備區 該區