1、【基礎研究】脊髓灰質炎病毒 sabin2 株結構蛋白 vp1 在昆蟲桿狀病毒表達系統中的表達劉金花董關木安祺曹守春孔艷【 摘要 】 目的 在昆蟲桿狀病毒表達系統中表達脊髓灰質炎病毒（poliovirus，pv）sabin2 株結構蛋白 vp1。方法從sabin2 疫苗原液中 rt-pcr 擴增 pv 結構蛋白 vp1 基因，克隆入 pfastbac1 質粒，轉化含桿狀病毒穿梭載體 bacmid 的 e. coli dh10bac，獲得重組桿狀病毒表達質粒 bacmid-vp1，在脂質體介導下轉染 sf9 昆蟲細胞，獲得重組桿狀病毒 rbac-vp1。將第 2 代 rbac-vp1 感染 sf9

2、 細胞，間接免疫熒光法檢測 vp1 蛋白的表達，并優化感染條件。結果 重組桿狀病毒表達質粒 bacmid-vp1 轉 化子可擴增出 3 203 bp 的目的片段；第 2 代 rbac-vp1 的滴度為 6 107 pfu ml，其感染的 sf9 細胞在熒光顯微鏡下可見綠色熒 光，以不同 moi 的 rbac-vp1 感染 sf9 細胞，vp1 蛋白表達量差別不大，而在 96 h 內，隨著感染時間的延長，vp1 蛋白的表達量逐 漸升高。結論 在昆蟲桿狀病毒表達系統中成功表達了 pv sabin2 株結構蛋白 vp1，為脊髓灰質炎亞單位疫苗的研制奠定了基 礎?！娟P鍵詞】 脊髓灰質炎病毒；sabin

3、2 株；vp1 蛋白；桿狀病毒【中國圖書分類號】 r373 2 2 q786 【文獻標識碼】 a 【文章編號】 1004-5503（2011）06-0625-04expression of structural protein vp1 of poliovirus sabin2 strain in insectbaculovirus expression systemliu jin-hua，dong guan-mu，an qi，cao shou-chun，kong yan（national institutes for food and drug control，beijing 100050，c

4、hina）【abstract】 objective to express the structural protein vp1 of poliovirus（pv）sabin2 strain in insect baculovirus expression system methods vp1 gene was amplified by rt-pcr from the bulk of pv vaccine prepared with sabin2 strain，and cloned into vector pfastbac1 the constructed recombinant plasmid

5、 pfast-vp1 was transformed to e coli dh10bac carrying baculovirus shuttle plasmid bacmid，and the obtained recombinant plasmid bacmid-vp1 was transfected to sf9 insect cells in mediation of liposome to prepare recombinant baculovirus rbac-vp1 the sf9 cells were infected with rbac-vp1 of passage 2 and

6、 determined for expression of vp1 by ifa，based on which the condition for infection was optimized results the target gene fragment at a length of 3 203 bp was amplified from the transformants of bacmid-vp1 the rbac-vp1 of passage 2 reached a titer of 6 107 pfu ml，with which the infected sf9 cells sh

7、owed green fluorescence under fluorescent microscope the expression levels of vp1 in sf9 cells infected with rbac-vp1 at various mois showed no significant difference，which increased gradually with the increasing time for infection within 96 hconclusion the structural protein vp1 of pv sabin2 strain

8、 was successfully expressed in insect baculovirus expression system，which laid a foundation of development of poliovirus subunit vaccine【key words】 poliovirus（pv）；sabin2 strain；vp1 protein；baculovirus脊髓灰質炎是由脊髓灰質炎病毒（poliovirus，pv）感染引起的以肢體麻痹為主的急性腸道傳染病， 主要影響 5 歲以下兒童，目前尚無特效治療方法，只 能采用疫苗預防。由于口服脊髓灰質炎減毒活疫苗

9、存在疫苗相關麻痹型脊髓灰質炎（vaccine-associated paralytic poliomyelitis，vapp）和疫苗衍生脊髓灰質炎 病毒（vaccine-derived poliovirus，vdpv）的風險，而 用減毒株生產的滅活疫苗，其抗原性及免疫原性均 不理想，嚴重制約了疫苗的大規模生產，因此有必 要開發新型疫苗。pv 屬于小 rna 病毒科腸道病毒屬，病毒基因組為單股正鏈 rna，基因組長約 7 500 bp，由 5端 非編碼區、多聚蛋白編碼區、3端非編碼區和 3端 poly（a）尾 4 個部分組成。其中，多聚蛋白編碼區編 碼產生 1 個多聚蛋白前體，分為 p1、p2

10、和 p3 區，p1 區可經蛋白酶水解產生衣殼蛋白 vp1、vp2、vp3 和 vp4，5 個拷貝的 vp1、vp2、vp3 和 vp4 構成了五聚 體，12 個五聚體構成二十面體核殼1。pv 的多數中 和抗原位點位于結構蛋白 vp1 上2 ，為此，本文在 昆蟲桿狀病毒表達系統中表達了 pv sabin2 株結構 蛋白 vp1，為脊髓灰質炎亞單位疫苗的研制奠定了 基礎?；痦椖浚簢铱萍贾斡媱潱?008bai54b03）作者單位：中國食品藥品檢定研究院（北京 100050）通訊作者：董關木，e-mail：gmdongnicpbporgcn1. 材料與方法1. 1 菌株、質粒及細胞感受態 e.

11、coli dh10bac 購自美國 invitrogen 公 司；pgem-t easy 載體系統購自 promega 公司；感受 態 e. coli dh5 購自天根生化科技（北京）有限公 司；桿狀病毒表達載體 pfastbac1 和 sf9 昆蟲細胞由 本院細胞室樊金萍惠贈。1. 2 sabin2 疫苗原液由北京天壇生物股份有限公司惠贈。1. 3 主要試劑轉染試劑 cellfectin reagent、昆蟲細胞培養基 sf-900sfm 和 1. 3x sf900 購自美國 invitrogen 公 司；la taq 熱啟動 dna 聚合酶購自 takara 公司； 逆轉錄試劑盒購自 pr

12、omega 公司；限制性內切酶購 自 new england 公司；fitc 標記的山羊抗兔 igg 及 堿性磷酸酶標記的山羊抗兔 igg 購自 sigma 公司； 抗型脊髓灰質炎病毒兔血清由本院病毒三室惠贈。1. 4 vp1 基因的擴增及克隆根據 genbank 中登錄的 pv sabin2 vp1 基因序 列（x00595）設計兩條引物，序列如下：上游：5-ag- gcctatgggaattggtgacatga-3（ 下劃線部分為 stu酶切位點），下游：5-ctcgagttaataagtcg- ttaatccc-3（下劃線部分為 xho酶切位點），擴 增片段大小為 921 bp，引物由上

13、海生工生物工程技 術服務有限公司合成。提取 sabin2 疫苗原液中病毒 基因組 rna，逆轉錄合成 cdna。以合成的 cdna 為 模板，使用 la taq 熱啟動 dna 聚合酶擴增 vp1 基 因，反應條件為：94 3 min；94 30 s，56 30 s，72 1 min，共 30 個循環；72 5 min。pcr 產物經 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，回收 vp1 基因片段，與 pgem- t easy 載體連接，轉化感受態 e. coli dh5，挑取陽 性單克隆，提取質粒 pgem-vp1，送 invitrogen 公司測序。1. 5 重組桿狀病毒表達質粒的構建用 stu及 xho雙酶

14、切質粒 pgem-vp1，回收 vp1 基因片段（903 bp），連接至經相同酶酶切的 pfastbac1 質粒的多克隆位點，連接產物轉化感受態 e. coli dh5，挑取陽性單克隆，提取質粒 pfast-vp1， 轉化含桿狀病毒穿梭載體 bacmid 的感受態 e. coli dh10bac，與 bacmid 發生位點特異性轉座，通過卡 那霉素、慶大霉素、四環素抗性及藍白斑篩選，挑取4 個克隆，應用 m13 引物（上游：5-cccagtcacgacgttg taaaacg-3，下游：5-agcggataacaatttcacacagg-3）進行 pcr 鑒定，擴增片段大小為 3 203 bp

15、（2 300 bp 903 bp），反應條件：93 3 min；94 55 s，55 45 s，725 min，共 30 個循環；72 7 min。將鑒定正確的重組表達質粒命名為 bacmid-vp1。1. 6 重組桿狀病毒的制備用轉染試劑 cellfectin reagent 將鑒定正確的重 組桿狀病毒表達質粒 bacmid-vp1 轉染對數生長期 的 sf9 細胞，27培養 4 d，待細胞出現典型細胞病變 時收獲培養上清，即為第 1 代重組桿狀病毒 rbac- vp1。用第 1 代 rbac-vp1 感染 sf9 細胞，獲得第 2 代 重組桿狀病毒，采用噬斑形成法檢測病毒滴度：將病 毒 1

16、0 倍系列稀釋后接種于 6 孔板中的 sf9 細胞，病毒吸附 2 h 后，加入第 1 層瓊脂糖覆蓋物，27培養5 d，再加入第 2 層含中性紅的瓊脂糖覆蓋物，7 10 d后觀察噬斑并計數，按下式計算病毒滴度。病毒滴度（pfu ml） 噬斑數 稀釋倍數 （1 每孔 接種病毒量）1. 7 vp1 蛋白在 sf9 細胞中表達的檢測采用間接免疫熒光法。將第 2 代 rbac-vp1 以10 moi 感染 24 孔板中的 sf9 細胞，待細胞出現典型細胞病變時（3 4 d），棄去培養基，加入 80冷丙酮固定 20 min；pbs 洗滌 3 次，每次 5 min，加入抗型脊髓灰質炎病毒兔血清（1 100

17、稀釋），37孵育 2 h；pbs 洗滌 3 次，每次 5 min，加入 fitc 標記的山羊抗兔 igg（1 80 稀釋），37孵育 1 h；pbs 洗滌 3 次，熒光顯微鏡下觀察。1. 8 感染條件的優化將第 2 代 rbac-vp1 分別以 1、3、5、7、10 moi 感 染 sf9 細胞，感染后 96 h 收集細胞；以 1 moi rbac- vp1 感染 sf9 細胞，分別于感染后 48、72、96 h 收集細 胞。使用 ripa 組織 細胞裂解液裂解細胞，13 000 g 離心 5 min 去除細胞碎片，取上清，經 sds-page 分 離蛋白，電轉膜至 pvdf 膜上，5 bsa

18、 封閉過夜；加 入抗型脊髓灰質炎病毒兔血清（1 100 稀釋），37 振蕩孵育 2 h；tbst 洗滌 3 次，每次 5 min，加入堿性 磷酸酶標記的山羊抗兔 igg（15 000 稀釋），37 振蕩孵育 1. 5 h；tbst 洗滌 3 次，每次 5 min，tbs 洗 滌 1 次，5 min，加入 bcip nbt 顯色液顯色。2.結果2. 1 vp1 基因的鑒定vp1 基因擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳分析，可 見 921 bp 的特異片段，大小與預期一致，見圖 1。測 序結果表明，目的基因片段與 genbank 中登錄的sabin2 vp1 基因相比，核苷酸序列同源性為 99. 3，氨基酸

19、序列同源性為 99. 3。bp1m bp10 0007 5005 0002 5001 0009212 501：vp1 基因 pcr 產物；m：dna marker dl15000圖 1 sabin2 vp1 基因 pcr 產物的電泳圖fig 1. electrophoretic profile of pcr product of vp1 gene of sabin2 straina，c：可見光（a：空白對照，c：rbac-vp1 感染的細胞）；b，d：熒光（b：空白對照，d：rbac-vp1 感染的細胞）圖 3 vp1 蛋白在 sf9 細胞中表達的間接免疫熒光檢測（ 200）fig 3. if

20、a of vp1 expressed in sf9 cells（ 200）2. 2 重組桿狀病毒表達質粒的鑒定pcr 結果表明，4 個克隆中有 3 個可擴增出3 203 bp 的目的片段，見圖 2。mr12345678m9mr95 00072 00055 00043 00034 00026 000bp1234m bp33 10015 00010 0007 5005 0002 5001 0002503 20317 0001 5：rbac-vp1 moi 分別為 1、3、5、7 和 10；6 8：感染時間分別為 96、72 和 48 h；9：空白對照；m：蛋白質 marker圖 4 不同感染條件下

21、 vp1 蛋白表達量的 western blot分析fig 4. analysis of expression levels of vp1 under various conditions by western blot1 3：陽性克隆的 pcr 產物；4：陰性克隆的 pcr 產物；m：dna marker dl15000圖 2 重組桿狀病毒表達質粒的 pcr 鑒定fig 2. identification of recombinant baculovirus expression vector by pcr3.討論由于脊髓灰質炎疫苗在全世界范圍內的大規模 應用，脊髓灰質炎病例自 1988 年

22、以來減少了 99以2. 3 重組桿狀病毒的滴度經檢測，第 2 代 rbac-vp1 的滴度為 6 107 pfu ml。2. 4 vp1 蛋白在 sf9 細胞中的表達熒光顯微鏡觀察顯示，rbac-vp1 感染的 sf9 細 胞可見綠色熒光，而空白對照細胞未見熒光，見圖3。 表明 rbac-vp1 感染的 sf9 細胞可表達 vp1 蛋白。2. 5 感染條件優化western blot 結果表明，以不同 moi rbac-vp1 感染 sf9 細胞，vp1 蛋白表達量差別不大；而感染后 收獲時間不同，vp1 蛋白的表達量有明顯差異，在96 h 內隨著感染時間的延長，vp1 蛋白的表達量逐 漸升高

23、。見圖 4。上3。目前世界上應用的脊髓灰質炎疫苗有兩種：口服脊髓灰質炎減毒活疫苗（oral poliovirus vaccine，opv）和滅活脊髓灰質炎疫苗（inactivated poliovirusvaccine，ipv）。opv 在全世界范圍內的大規模應用 大大降低了脊髓灰質炎的發病率，但其存在疫苗相 關麻痹型脊灰和疫苗衍生脊灰病毒循環的風險，因 此必須停止使用，以徹底根除脊灰4。目前國際上 使用的 ipv 均是采用經甲醛滅活的野毒株生產的傳 統滅活疫苗，而 sabin 株滅活后制備的 ipv 其抗原 性會發生變化，致使其免疫原性較差5。昆蟲桿狀病毒表達系統是一種成熟的表達系 統，桿狀

24、病毒基因組具有可容納大量外源基因的能dcba力，可在細胞培養基中高密度大量表達外源蛋白，而且桿狀病毒的宿主范圍窄，不感染人類，該表達系統 能對病毒結構蛋白進行多種修飾。1989 年 urakawa 等6及 1992 年 br覿utigam 等7分別利用昆蟲桿狀 病毒表達系統成功合成了脊髓灰質炎病毒樣顆粒（virus-like particles，vlps），urakawa 等6用純化的 vlps 免疫小鼠，誘導小鼠能產生中和抗體。本實驗 在昆蟲桿狀病毒表達系統中成功表達了 pv（sabin2 株）vp1 蛋白，并對感染條件進行了優化，結果表明， moi 對 vp1 蛋白的表達量無明顯影響，而感

25、染后收 獲時間對 vp1 蛋白的表達量影響明顯，且隨著感染 時間的延長，vp1 蛋白表達量升高，可能是由于 rbac- vp1 感染 sf9 細胞后，在細胞內不斷復制繁殖，隨著 病毒量增多，vp1 蛋白的表達量也增高。本實驗為脊 髓灰質炎亞單位疫苗的研制奠定了基礎，下一步將 進一步研究表達的 vp1 蛋白的作為亞單位疫苗的 安全性、抗原性及免疫原性。參考文獻1 金奇 醫學分子病毒學m 1 版 北京：科學出版社，2001：499-5012 信洪武，郭志剛，韓進德 脊髓灰質炎病毒蛋白質及其抗原性研 究進展j 中華實驗和臨床病毒學雜志，1995，9（1）：93-963 who weekly epid

26、emiological recordj wer，2009，84（14）：109-1164 roberts l polio eradication rethinking the polio endgame j science，2009，323（5915）：7055 tano y，shimizu h，martin j，et al antigenic characterization of a formalin-inactivated poliovirus vaccine derived from live-attenuated sabin strainsj vaccine，2007，25（41）：

27、7041-70466 urakawa t，ferguson m，miuor pd，et al synthesis of immuno genic，but non-infectious，poliovirus particles in insect cells by a baculovirus expression vector j j gen virol，1989，70（pt6）：1453-14637 br覿utigam s，snezhkov e，bishop dh formation of poliovirus- like particles by recombinant baculoviruses expressing the individ ual vp0，vp3 and vp1 proteins by comparison to particles derivedfrom the expressed poliovirus polyproteinj virology，1993，192（2）：512-524（收稿日期：2011-03-25）中國生物制品大會暨第十一次全國生物制品學術研討會征文通知為了促進中國生物制品事業的發展，為專業研究人員提供交流與合作機會，中國生物制品大會暨第十一次全國生物 制品學術研討