1、 第一節(jié)第一節(jié) 光譜分析技術光譜分析技術 第二節(jié)第二節(jié) 電化學分析電化學分析 第三節(jié)第三節(jié) 干化學分析技術干化學分析技術 第四節(jié)第四節(jié) 電泳技術電泳技術 第五節(jié)第五節(jié) 層析技術層析技術 第六節(jié)第六節(jié) 離心技術離心技術 第七節(jié)第七節(jié) 自動生化分析技術自動生化分析技術 n本章內(nèi)容概要本章內(nèi)容概要 n教學目標和要求教學目標和要求 1 1、掌握掌握分光光度技術的基本原理及定性和定量方法。分光光度技術的基本原理及定性和定量方法。 掌握電化學分析方法基本原理掌握電化學分析方法基本原理 2 2、熟悉熟悉分光光度計的基本結構和操作方法光源檢查分光光度計的基本結構和操作方法光源檢查 和波長校正、原子分光光度計的

2、類型和影響熒光分析和波長校正、原子分光光度計的類型和影響熒光分析 的因素。的因素。熟悉熟悉離子選擇電極分類，離子選擇電極的分離子選擇電極分類，離子選擇電極的分 析方法析方法 3 3、了解了解其他光譜分析技術的基本原理及在生化檢驗中其他光譜分析技術的基本原理及在生化檢驗中 的應用。的應用。 n分光光度技術的基本原理分光光度技術的基本原理 n分光光度計的基本結構分光光度計的基本結構 n分光光度計的操作方法分光光度計的操作方法 n分光光度技術的定性和定量方法分光光度技術的定性和定量方法 利用各種化學物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特利用各種化學物質(zhì)都具有發(fā)射、吸收或散射光譜譜系的特 征，以此來確

3、定物質(zhì)性質(zhì)、結構或含量。征，以此來確定物質(zhì)性質(zhì)、結構或含量。 1 1、 光譜分析技術分類：光譜分析技術分類： 發(fā)射光譜分析技術：發(fā)射光譜分析技術：火焰光度法、原子發(fā)射光譜火焰光度法、原子發(fā)射光譜 法和熒光光譜法法和熒光光譜法 吸收光譜分析技術：吸收光譜分析技術：紫外、可見光分光光度法，紫外、可見光分光光度法， 原子吸收分光光度法和紅外光譜法原子吸收分光光度法和紅外光譜法 散射光譜分析技術：散射光譜分析技術：比濁法比濁法 微粒性微粒性(E=h(E=hv v) ) 波粒二象性波粒二象性 波動性波動性( ( =c/=c/v v) ) E=hE=hv v =hc/ =hc/ -光的能量與光的波長成反比

4、，與光的能量與光的波長成反比，與 光的頻率成正比光的頻率成正比 2 2、光的基本性質(zhì)、光的基本性質(zhì)-高速傳播的電磁波 能量釋放 E1 E0 吸收光譜 發(fā)射光譜 激發(fā)態(tài) 基態(tài) E1 E0 4. 4. 分類分類 1 1、定義：、定義： 根據(jù)被測物質(zhì)對各種不同波長光的根據(jù)被測物質(zhì)對各種不同波長光的 吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的吸收能力，繪制吸收曲線，并根據(jù)曲線的 特性鑒定物質(zhì)的方法。特性鑒定物質(zhì)的方法。 屬光譜分析法。屬光譜分析法。 （1 1）定性分析）定性分析 定性鑒定定性鑒定 純度鑒定純度鑒定 結構分析結構分析 （2 2）定量分析）定量分析 L1L2 入射光透過光入射光透過光 L2 L1

5、 ， ，I1 I2 I0I1I0I2 摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)：當溶液層厚度單位為：當溶液層厚度單位為cm，濃度單位為，濃度單位為 mol/L時，時，K即成為摩爾吸光系數(shù)即成為摩爾吸光系數(shù) 光源 單色器樣品室檢測器顯示 在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具在整個紫外光區(qū)或可見光譜區(qū)可以發(fā)射連續(xù)光譜，具 有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。有足夠的輻射強度、較好的穩(wěn)定性、較長的使用壽命。 可見光區(qū)：鎢燈作可見光區(qū)：鎢燈作 為光源，其輻射波長范為光源，其輻射波長范 圍在圍在3203202500 nm2500 nm。 紫外區(qū)：氫、氘燈。紫外區(qū)：氫、氘燈。 發(fā)射發(fā)射1851854

6、00 nm400 nm的連的連 續(xù)光譜。續(xù)光譜。 將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任將光源發(fā)射的復合光分解成單色光并可從中選出一任 波長單色光的光學系統(tǒng)。波長單色光的光學系統(tǒng)。 入射狹縫：光源的光由此進入單色器；入射狹縫：光源的光由此進入單色器； 準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束；準光裝置：透鏡或返射鏡使入射光成為平行光束； 色散元件：將復合光分解成單色光；色散元件：將復合光分解成單色光；棱鏡或光柵棱鏡或光柵； 聚焦裝置：透鏡或聚焦裝置：透鏡或 凹面反射鏡，將分光凹面反射鏡，將分光 后所得單色光聚焦至后所得單色光聚焦至 出射狹縫；出射狹縫； 出射狹縫。出射狹縫。 樣品室放

7、置各種類型的吸收池樣品室放置各種類型的吸收池 （比色皿）和相應的池架附件。吸（比色皿）和相應的池架附件。吸 收池主要有石英池和玻璃池兩種。收池主要有石英池和玻璃池兩種。 在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一在紫外區(qū)須采用石英池，可見區(qū)一 般用玻璃池。般用玻璃池。 利用光電效應將透過吸收池的利用光電效應將透過吸收池的 光信號變成可測的電信號，常用的光信號變成可測的電信號，常用的 有光電池、光電管或光電倍增管。有光電池、光電管或光電倍增管。 檢流計、數(shù)字顯示、微機進行檢流計、數(shù)字顯示、微機進行 儀器自動控制和結果處理儀器自動控制和結果處理 簡單，價廉，適于在給定波長處測量吸光度或透光度，簡單，價廉，適于

8、在給定波長處測量吸光度或透光度， 一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高一般不能作全波段光譜掃描，要求光源和檢測器具有很高 的穩(wěn)定性。的穩(wěn)定性。 自動記錄，快速全波自動記錄，快速全波 段掃描。可消除光源不穩(wěn)段掃描?？上庠床环€(wěn) 定、檢測器靈敏度變化等定、檢測器靈敏度變化等 因素的影響，特別適合于因素的影響，特別適合于 結構分析。儀器復雜，價結構分析。儀器復雜，價 格較高。格較高。 將不同波長的兩束單色光將不同波長的兩束單色光( (1 1、2 2) ) 快束交替通過同快束交替通過同 一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。一吸收池而后到達檢測器。產(chǎn)生交流信號。無需參比池。

9、 = =1 12nm2nm。兩波長同時掃描即可獲得導數(shù)光譜。兩波長同時掃描即可獲得導數(shù)光譜。 可見分光光度計 紫外紫外-可見分光光度計可見分光光度計 Beckman 紫外紫外-可見可見 分光光度計分光光度計 eppendorf 紫外紫外-可見可見 分光光度計分光光度計 以以721-A721-A型分光光度計為例，其基本的操作步驟為：型分光光度計為例，其基本的操作步驟為： 1.1.開開721-A721-A分光光度計的開關，將比色池的蓋子打開，通電分光光度計的開關，將比色池的蓋子打開，通電2020分鐘使儀分鐘使儀 器預熱。器預熱。 2.2.將波長旋至測定的波長。將波長旋至測定的波長。 3.3.將空白

10、液、校準液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。將空白液、校準液或待測液放入比色池，將空白液置于光路中。 4.4.將開關置于將開關置于T T位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細調(diào)調(diào)節(jié)位，打開比色池蓋子，用光量粗調(diào)和光量細調(diào)調(diào)節(jié)T T為為 0.0,0.0,關上關上 比色池蓋子，調(diào)節(jié)比色池蓋子，調(diào)節(jié)T T為為100.0100.0。 5.5.將開關置于將開關置于A A，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)，用消光調(diào)零調(diào)節(jié)A A為為0.00.0 6.6.重復步驟重復步驟4 4和和5 5 7.7.將校準液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（將校準液或待測液推入光路，測量溶液的吸光度（A A） 鉻酸鉀的標準液可用于校正分光

11、光度計的吸鉻酸鉀的標準液可用于校正分光光度計的吸 光度。在光度。在25，將，將4mg鉻酸鉀溶于鉻酸鉀溶于100ml的的 0.05mol/L KOH中，放入比色池中，在不同波長中，放入比色池中，在不同波長 下測定吸光度值，與己知的標準吸光度校正表進下測定吸光度值，與己知的標準吸光度校正表進 行比較，可檢測儀器吸光度的準確度行比較，可檢測儀器吸光度的準確度。 1.開啟電源，指示燈亮，儀器預熱10分鐘， 選擇開關置于“T” 。 2.打開試樣室蓋（光門自動關閉），調(diào)節(jié) “0%T”旋鈕，使數(shù)字顯示為“00.0”。 3.將裝有溶液的比色皿放置比色架中。 4.旋動波長手輪，把測試所需的波長調(diào)節(jié) 至刻度線處。

12、 6.將參比溶液比色皿置于光路中，將選擇 開關置于A，旋動吸光度調(diào)零旋鈕，使得數(shù) 字顯示為.000，然后移入被測溶液，顯示 值即為試樣的吸光度A值。 8全部測定結束后，取出比色皿(洗凈)， 關閉開關. 三、分光光度技術的定性和定量方法三、分光光度技術的定性和定量方法 u定性依據(jù)：定性依據(jù)： 最大吸收波長最大吸收波長maxmax和摩爾吸光系數(shù)和摩爾吸光系數(shù) 2.2.摩爾吸光系數(shù)摩爾吸光系數(shù)方法方法 1.1.最大吸收波長最大吸收波長maxmax方法方法 1.標準曲線法 將一系列濃度不同的標準溶液按照一定操作過程將一系列濃度不同的標準溶液按照一定操作過程 顯色后，分別測吸光度顯色后，分別測吸光度(A

13、)(A)，以，以A A為縱坐標，濃度為縱坐標，濃度 為橫坐標制標準曲線為橫坐標制標準曲線( (至少要至少要5 5點點) )。在相同條件。在相同條件 下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標準曲下處理待測物質(zhì)并測定其吸光度，即可從標準曲 線找出相對應的濃度線找出相對應的濃度 u方法：方法： AX CX A（吸光度）（吸光度） C（濃度）（濃度） u制作和應用標準曲線時應注意下面幾點：制作和應用標準曲線時應注意下面幾點： （1 1）測定條件發(fā)生變化時（如更換標準品和試劑等），應）測定條件發(fā)生變化時（如更換標準品和試劑等），應 重新繪制。重新繪制。 （2 2）標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。）

14、標準品應有高的純度，標準液的配制應準確。 （3 3）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再）當待測液吸光度超過線性范圍時，應將標本稀釋后再 測定。測定。 （4 4）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。）標本測定的條件應和標準曲線制作時的條件完全一致。 2比較法 C CX X=(A=(AX XC Cs s)/A)/As s 己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白，己知濃度的標準品和標本作同樣處理，使用相同的空白， 同時測定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準同時測定標準管和標本的吸光度，根據(jù)測定的吸光度及標準 品濃度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為：品濃

15、度，可直接計算出標本的濃度，計算公式為： 其中其中CxCx和和AxAx為標本管濃度和吸光度，為標本管濃度和吸光度，CsCs和和AsAs分別為標準分別為標準 管濃度和吸光度。用標準品法定量時，標準品的濃度應盡量管濃度和吸光度。用標準品法定量時，標準品的濃度應盡量 和標本管濃度相近。和標本管濃度相近。 3其它分析方法 包括差示法、多組份混合物分析和利用包括差示法、多組份混合物分析和利用 摩爾吸光系數(shù)分析等方法。摩爾吸光系數(shù)分析等方法。 四、其它光譜分析技術四、其它光譜分析技術 （一）火焰光度法（一）火焰光度法 （二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 （三）熒光光度分析法（三）熒光光度分析

16、法 1 1基本原理基本原理 2 2組成組成 1 1基本原理基本原理 2 2組成組成 3 3原子吸收分光光度法的特點原子吸收分光光度法的特點 3 3熒光光度定量分析法熒光光度定量分析法 4 4 熒光光度分析技術的應用熒光光度分析技術的應用 1 1基本原理基本原理 2 2影響熒光強度的因素影響熒光強度的因素 火焰光度法火焰光度法等離子體發(fā)射光譜法等離子體發(fā)射光譜法 原子吸收分光光度法原子吸收分光光度法 熒光光度法熒光光度法 NanoDrop ND-3300 Fluorospectrometer n電化學分析方法基本原理電化學分析方法基本原理 n離子選擇電極分類離子選擇電極分類 n離子選擇電極的分析

17、方法離子選擇電極的分析方法 電位分析法：測定原電池電動勢以求物質(zhì)含量的分析方法電位分析法：測定原電池電動勢以求物質(zhì)含量的分析方法 電導法：通過電阻測定以求物質(zhì)含量的分析方法電導法：通過電阻測定以求物質(zhì)含量的分析方法 電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點的指示電容量分析法：借助某些物理量的突變作為分析重點的指示 電池電動勢和電極電勢電池電動勢和電極電勢 電池電動勢：電池電動勢：將電位差計接在電池的兩個電極之間而直將電位差計接在電池的兩個電極之間而直 接測得的電勢值習慣上稱之為電池的電動勢接測得的電勢值習慣上稱之為電池的電動勢 電極電勢：電極電勢：當采用相對電勢法時，系用一定的參比電極當

18、采用相對電勢法時，系用一定的參比電極 與研究電極組成電池，與研究電極組成電池， 這一電池的電動勢稱為相對于給定參比這一電池的電動勢稱為相對于給定參比 電極而確定的研究電極電勢。電極而確定的研究電極電勢。( (金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即金屬和溶液相接觸的內(nèi)電位差即 為金屬電極和溶液間的電極電勢為金屬電極和溶液間的電極電勢) ) The absolute potential difference across a single electrified interface cannot be measured! It is not necessary to know exact value of

19、it but the difference of absolute potential difference is important for electrochemists! 單個界面上的絕對電位單個界面上的絕對電位 是不可測的，對于電化是不可測的，對于電化 學研究重要的是其差值學研究重要的是其差值 參比電極參比電極 顧名思義，參比電極是給出一個固定的值，其它的電顧名思義，參比電極是給出一個固定的值，其它的電 極電勢的測量以此為基礎。一個好的參比電極應該不極電勢的測量以此為基礎。一個好的參比電極應該不 受溫度、時間和通過小電流而變化受溫度、時間和通過小電流而變化, 應遵守應遵守Nernst

20、方方 程。程。 指示電極指示電極 指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指示待測離子指示電極的電位隨離子濃度而變化，能指示待測離子 濃度。濃度。 按國際純粹與應用化學聯(lián)合會（按國際純粹與應用化學聯(lián)合會（IUPACIUPAC）建議分類）建議分類 1 玻璃電極的結構 試試pH F RT303. 2 k,a lg F RT303. 2 k Hm （二）氣敏電極（二）氣敏電極 該類電極其實是一種復該類電極其實是一種復 合電極：將合電極：將 pH pH 玻璃電玻璃電 極和指示電極插入中介極和指示電極插入中介 液中，待測氣體通過氣液中，待測氣體通過氣 體滲透膜與中介液反應，體滲透膜與中介液反應， 并改變其并改變其 pH pH 值，從而值，從而 可測得諸如可測得諸如COCO2 2( (中介液中介液 為為NaHCONaHCO3 3) )或或NHNH