1、熒光化學(xué)傳感器是建立在光譜化學(xué)和化學(xué)波導(dǎo)與量測技術(shù)基礎(chǔ)上的將分析 對象的化學(xué)信息以熒光信號表達(dá)的傳感裝置。其主要組成部件有三個 （ 圖 1. 1）: 1 .識別結(jié)合基團(tuán)（R），能選擇性地與被分析物結(jié)合，并使傳感器所處 的化學(xué)環(huán)境發(fā)生改變。這種結(jié)合可以通過配位鍵，氫鍵等作用實(shí)現(xiàn)。2信號報告基團(tuán)（發(fā)色團(tuán)，F(xiàn)）,把識別基團(tuán)與被分析物結(jié)合引起的化學(xué)環(huán)境變化轉(zhuǎn)變?yōu)?容易觀察到的輸出信號。信號報告基團(tuán)起到了信息傳輸?shù)淖饔茫逊肿铀?上發(fā)生的化學(xué)信息轉(zhuǎn)換成能夠?yàn)槿烁兄?（顏色變化 ）或儀器檢測的信號 （熒光 等）。3.連接基團(tuán)（S），將信號報告基團(tuán)和識別結(jié)合基團(tuán)連接起來，根據(jù)設(shè)計(jì) 的不同連接基團(tuán)可有多種

2、選擇，一般用做連接基團(tuán)的是亞甲基等短鏈烷基。連 接基團(tuán)的合適與否將直接影響是否有輸出信號的產(chǎn)生。信號表達(dá)可以是熒光的 增強(qiáng)或減弱、光譜的移動、熒光壽命的變化等。圖 1.1 熒光探針的結(jié)構(gòu)1.1.1 熒光探針的一般設(shè)計(jì)原理（1）結(jié)合型熒光探針 21圖 1.2 共價連接型熒光探針 結(jié)合型熒光探針是利用化學(xué)共價鍵將識別基團(tuán)和熒光基團(tuán)連接起來的一類 熒光探針，是比較常見的一類熒光探針。該類探針通過對比加入分析物前后熒 光強(qiáng)度的變化、光譜位置的移動或熒光壽命的改變等實(shí)現(xiàn)對分析物的檢測。在 該類熒光化學(xué)傳感器的設(shè)計(jì)中，必須充分考慮下列三個方面的因素。（a） 受體分子的熒光基團(tuán)設(shè)計(jì)、合成:考慮到用于復(fù)雜環(huán)境

3、體系的熒光檢測，要求熒光 基團(tuán)要有強(qiáng)的熒光（高熒光量子產(chǎn)率，有利于提高檢測的靈敏性），Stokes 位移要大（可有效消除常規(guī)熒光化合物如熒光素等具有的自猝滅現(xiàn)象），熒光發(fā) 射最好要在長波長區(qū)（最好位于 500 nm 以上，可避免復(fù)雜體系的常位于短波 長區(qū)的背景熒光的干擾，另外由于長波長區(qū)發(fā)射的熒光能量的降低可減少熒光 漂白現(xiàn)象的發(fā)生而延長傳感器的使用壽命）。 （b） 受體分子的識別基團(tuán)：受體 分子的識別基團(tuán)設(shè)計(jì)以軟硬酸堿理論、配位作用以及超分子作用力（如氫鍵、 范德華力等）作為理論指導(dǎo)，多選擇含氮、硫、磷雜環(huán)化合物作為識別分子。 （c） 熒光超分子受體的組裝：組裝熒光超分子受體就是利用一個連接

4、基將識別 基團(tuán)和熒光基團(tuán)通過共價鍵連接在一起，要充分考慮到識別基團(tuán)和熒光基團(tuán)之 間能通過連接基進(jìn)行信號傳遞，對識別對象的識別信息（如熒光的增強(qiáng)或減 弱、光譜的移動、熒光壽命的變化等）可以及時傳遞出去。圖 1.3 共價連接型鋅離子熒光探針De Silva 在 1997 年報道的化合物 1 22是一個典型的共價連接法設(shè)計(jì)的熒 光探針。它分別以有優(yōu)良光學(xué)性質(zhì)的蒽作為熒光基團(tuán)，以對Zn2+有特異性識別的基團(tuán)雙（2-吡啶甲基）氨（DPA）為識別基團(tuán)，通過亞甲基將識別基團(tuán)和熒光報 告基團(tuán)連接在一起。通過對比加鋅前后熒光強(qiáng)度的不同實(shí)現(xiàn)了對鋅離子的檢 測。（2）置換型熒光探針圖 1.4 置換型熒光探針 利用該

5、方法設(shè)計(jì)的熒光探針是通過識別基團(tuán)分別與熒光指示劑和被分析物 結(jié)合能力的強(qiáng)弱來實(shí)現(xiàn)對被分析物的檢測。該類傳感器對識別基團(tuán)和熒光指示 劑的要求都比較高，既要選擇能和識別基團(tuán)結(jié)合但結(jié)合能力又不是特別強(qiáng)的熒 光指示劑，又要設(shè)計(jì)對被分析物能特異識別的識別基團(tuán)。該類設(shè)計(jì)方法多用于 陰離子傳感器的設(shè)計(jì)。2002 年， Kim 小組 23設(shè)計(jì)了鄰苯二酚紫作為熒光指示劑，雙鋅配合物為HPO42- 識別基團(tuán)，并將二者自組裝成化合物2，用于中性條件下水溶液中HPO42-的檢測。加入識別客體 HPO42-后，由于HPO42-與雙鋅配位能力強(qiáng)于 鄰苯二酚紫，從而把鄰苯二酚紫擠開，使之進(jìn)入溶液，表現(xiàn)為其原來顏色。 在識別

6、過程中，溶液顏色從藍(lán)色變?yōu)辄S色，常見的Ac-、CO32-、NO3-、N3-、CI04-、S2-、F-、Cl-、Br-都不影響HPO42-的檢測，表現(xiàn)出較好的選擇性。圖1.5置換型HPO42-化學(xué)傳感器(3) 化學(xué)計(jì)量型熒光探針( chemodosimeter) 化學(xué)計(jì)量型熒光探針分子是利用探針分子與識別客體之間特異不可逆的化 學(xué)反應(yīng)前后產(chǎn)生熒光信號的不同而對分析對象進(jìn)行檢測的一類探針 24。主要 包括兩種類型：一類是目標(biāo)離子和探針分子發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后仍舊通過共價鍵相 連接:另一類是目標(biāo)離子催化了一個化學(xué)反應(yīng)(圖1.6)。圖1.6 化學(xué)計(jì)量法的兩種類型 一般而言，化學(xué)計(jì)量型熒光探針分子都具有專一性

7、和不可逆性。盡管這類 探針已有不少報道 ,但由于設(shè)計(jì)較為困難和反應(yīng)不夠靈敏等缺陷而進(jìn)展較為緩 慢。圖 1.7 氨基酸熒光分子探針Kim 和 Hong 等25設(shè)計(jì)的識別半胱氨酸及高半胱氨酸的熒光分子探針3，屬于第一種類型。他們利用半胱氨酸及高半胱氨酸與醛生成五元噻唑環(huán)或六元 噻嗪環(huán)的特異反應(yīng)以及反應(yīng)前后化合物 3和 4熒光性質(zhì)的顯著差異實(shí)現(xiàn)了對半 胱氨酸及高半胱氨酸的高選擇性檢測。化合物 526 是較早應(yīng)用化學(xué)反應(yīng)原理實(shí)現(xiàn)檢測客體的熒光探針，屬于第 二種類型。化合物 5 的乙腈溶液中加入汞離子后熒光顯著增強(qiáng) (34 倍)并紅移， 進(jìn)一步用質(zhì)譜檢測發(fā)現(xiàn)生成了脫硫產(chǎn)物 6。圖 1.8 基于汞脫硫原理

8、的汞離子熒光探針1.1.2 熒光分子探針的響應(yīng)機(jī)理目前，熒光分子探針的響應(yīng)機(jī)理主要有以下幾種：光致電子轉(zhuǎn)移( PET, photo-induced electron transfer)、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT, intramolecular charge tra nsfer)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移( FRET, fluoresce nee resonance energy transfe) 等。(1) 光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移原理( PET)光致電子轉(zhuǎn)移是指電子給體或電子受體受光激發(fā)后，激發(fā)態(tài)的電子給體與 電子受體之間發(fā)生電子轉(zhuǎn)移的過程。典型的光致電子轉(zhuǎn)移熒光探針體系是由具 有電子給予能力的識別基團(tuán) R 通

9、過連接基團(tuán) S 和熒光基團(tuán)相連組成的功能分 子。一般情況下，熒光分子探針的識別基團(tuán)是電子給體，熒光基團(tuán)是電子受 體，并且通常情況下多采用含有氨基的基團(tuán)作為識別基團(tuán)。具體 PET 工作過 程如下：在識別基團(tuán)與待測物種結(jié)合之前，當(dāng)熒光基團(tuán)受激發(fā)，具有給電子能 力的識別基團(tuán)能夠使其處于最高占據(jù)軌道的電子轉(zhuǎn)入激發(fā)態(tài)熒光團(tuán)因電子激發(fā) 而空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無法直接躍遷到原基態(tài)軌道發(fā)射熒光， 導(dǎo)致熒光基團(tuán)的熒光猝滅。而識別基團(tuán)與待測物種結(jié)合之后，由于降低了識別 基團(tuán)的給電子能力，光致電子轉(zhuǎn)移過程被減弱或者不再發(fā)生，熒光基團(tuán)的熒光 發(fā)射得到恢復(fù)(如圖 1.9)。圖 1.9 熒光分子光致電子轉(zhuǎn)移的

10、 “開”光“”過程示意圖。由于與待測物種結(jié)合前后的熒光強(qiáng)度差別很大，呈現(xiàn)明顯的“關(guān) ”、 “開”狀態(tài)，因此這類熒光分子探針又被稱為熒光分子開關(guān)。PET熒光分子探針的作用 機(jī)制可由前線軌道理論 2 來進(jìn)一步說明(見圖 1.10)。從圖可以看出，識別基 團(tuán)處于自由態(tài)時，其 HOMO 軌道上的電子可以向熒光基團(tuán)的 HOMO 軌道上轉(zhuǎn) 移，致使熒光基團(tuán)被激發(fā)到 LUMO 上的激發(fā)態(tài)電子不能返回基態(tài)而難以產(chǎn)生 熒光，此過程對應(yīng)于發(fā)生 PET 現(xiàn)象。在識別基團(tuán)與待測物種結(jié)合后，識別基 團(tuán)上的 HOMO 電子已無法轉(zhuǎn)移到熒光基團(tuán)的 HOMO 軌道上，使 PET 過程無法 進(jìn)行，這時熒光基團(tuán)的激發(fā)態(tài)電子可以返

11、回基態(tài)，產(chǎn)生熒光。由此可見，利用 識別基團(tuán)對 PET 過程的控制可以實(shí)現(xiàn)對體系熒光發(fā)射狀態(tài)的調(diào)控。圖 1.10 光致電子轉(zhuǎn)移機(jī)制機(jī)制的前線軌道理論解釋。化合物 1 是一個非常典型的 PET 機(jī)理熒光增強(qiáng)型的例子。鋅離子不存在 時，由于識別基團(tuán)中氮原子上的孤對電子能夠在熒光基團(tuán)受激發(fā)態(tài)時占據(jù)激發(fā) 態(tài)熒光團(tuán)因電子激發(fā)而空出的電子軌道，使被光激發(fā)的電子無法直接躍遷到原 基態(tài)軌道發(fā)射熒光，導(dǎo)致熒光基團(tuán)的熒光猝滅，即發(fā)生了光致電子轉(zhuǎn)移(PET)。當(dāng)ZnZ+存在時，Zn2+離子與兩個吡啶氮及氨基配位，束縛了氮上的 孤對電子，使發(fā)生在氮原子和熒光團(tuán)之間的 PET 過程被禁阻，熒光強(qiáng)度大幅 度增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證

12、實(shí)了此過程。在乙腈溶液中，加入Zn2+ 離子之前，化合物1的熒光量子產(chǎn)率僅為 0.01;加入乙門2+離子之后，它的熒光量子產(chǎn)率為 0.77，熒光增強(qiáng)了 77 倍。(2) 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移 ( ICT ) 機(jī)理 分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移熒光探針分子通常由富電子基團(tuán)(電子給體)和缺電子基 團(tuán)(電子受體)共軛相連，形成推 -拉作用的共軛體系，沒有 PET 探針分子那 樣明顯的連接基。也就是說熒光團(tuán) F和受體R通常融合在一起，識別過程二者 同時參與。當(dāng)受體結(jié)合被分析物后，作為受體的供電子部分或拉電子部分的供 拉電子能力被改變，整個共軛體系的 ?電荷重新分布，熒光團(tuán)的推 -拉作用被抑制或強(qiáng)化，進(jìn)而導(dǎo)致吸收光譜、激發(fā)

13、光譜以致發(fā)射光譜發(fā)生紅移或藍(lán)移（如圖1.11） 27。化合物728兩端分別含有羰基、苯并噻唑兩個強(qiáng)拉電子基和兩個氨基強(qiáng)供 電子基團(tuán)，激態(tài)時熒光團(tuán)能夠有效地實(shí)現(xiàn)了從供體到受體的整個體系？電荷分離，是典型的ICT機(jī)理的熒光分子探針。當(dāng)汞離子存在時，四氨基識別基團(tuán)捕 獲Hg2+離子，6, 7位氮的供電子能力大大減弱，減弱了整個體系？電荷分離程度，引起吸收波譜和熒光光譜分別藍(lán)移了60 nm和92 nm，熒光顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，同時實(shí)現(xiàn)了比色及比率型 Hg2+離子的檢測。圖1.11識別基團(tuán)分別為電子供體和電子受體的ICT過程光譜移動示意圖圖1.12具有D-A結(jié)構(gòu)的ICT汞離子熒光探針 熒光共振能量轉(zhuǎn)移（

14、FRET）機(jī)理熒光共振能量轉(zhuǎn)移是指當(dāng)一對合適的能量給體分子（Donor）和受體分子（Acceptor）相距一定距離（一般為2-5 nm），且給體的發(fā)射光譜與受體的吸收光譜 能有效重疊時，處于激發(fā)態(tài)的給體將把一部分或全部能量轉(zhuǎn)移給受體，使接受 體被激發(fā)的過程。受體可以是熒光物質(zhì)也可以是只有吸收而沒有發(fā)射的熒光猝滅劑。根據(jù)F?rster理論，共振能量轉(zhuǎn)移效率可以用式1.5表示29:(1.5)RR0式中R為兩個熒光基團(tuán)的距離，Ro為F?rster距離（供體-受體之間的臨界轉(zhuǎn)移距 離）。從這個方程可以看出，即使 R的微小變化都會導(dǎo)致能量轉(zhuǎn)移的效率強(qiáng)烈改變24-26。HghtrKlinpni L irH-glMndinrc scquitK圖1.13具有D-A結(jié)構(gòu)的FRET汞離子分子熒光探針利用FRET效率對距離的強(qiáng)的依賴性，F(xiàn)RET廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)和核酸的 結(jié)構(gòu)及動力學(xué)研究、分子結(jié)合的測定等領(lǐng)域 30。同樣，能量共振轉(zhuǎn)移原理也 被用于熒光分子探針