1、第八章第八章 微生物遺傳微生物遺傳 教學內容 1.掌握遺傳變異的物質基礎 2.掌握基因突變和誘變育種 3.了解原核生物和真菌的基因重組 4.了解基因工程原理 5.了解菌種的保藏與復壯 遺傳（Heredity or Inheritance）與變 異（Variation）是生物界最本質的屬性 之一。 遺傳是指親代生物將自身的一整套 遺傳因子（基因，Gene）傳遞給子代的 行為或功能，它具有極其穩定的特性。 變異是指生物體在外因或內因的作 用下，由于遺傳物質結構或數量的改變 （即基因型的改變），而引起某些相應 的表型性狀發生變化。變異所形成的新 性狀是穩定的、可遺傳的。 （1 1）基因型（）基因型（

2、Genotype）或遺傳型：或遺傳型： 是指生物體所含有的全部基因的總 合。 基因型只是一種內在的可能性或潛 力，只有在適當的環境條件下，通過自 身的代謝和發育，才能使其具體化，轉 變為表型。 （2）表型（ Phenotype）： 是指生物體所具有的一切外表特征 和內在特性的總和，是基因型在適當環 境條件下的具體體現。 表型與遺傳型不同，是一種現實性 。 修飾是非遺傳的。如粘質沙雷氏菌: 25培養,產深紅色的靈桿菌素，菌落染 成鮮血狀（宗教神顯靈）； 37培養，此菌群體中的一切個體都不 產色素； 重新降溫到25，所有個體恢復產色素 能力。 由于微生物所具有的獨特的生物學 特性，使之成為了現代遺

3、傳學和其他許 多生物學基本理論研究的最理想材料， 不僅促進了現代分子生物學和生物工程 學的發展，而且也為育種工作提供了豐 富理論基礎。 （3）修飾（ Modification）或飾變： 指不涉及遺傳物質結構的改變，而 只發生在轉錄、轉譯水平上的表型變化 。 第一節第一節 遺傳變異的物質基礎遺傳變異的物質基礎 一.證明遺傳物質基礎的三個經典實驗 二.遺傳物質在胞內的存在部位及方式 一一.證明證明核酸是遺傳物質基礎的三個經典實驗核酸是遺傳物質基礎的三個經典實驗 1.細菌的轉化（Transformation）實驗 1928年，F.Griffith首先發現細菌 的轉化現象。肺炎鏈球菌是一種成雙或 成鏈

4、排列的球菌，可使人患肺炎，也可 使小鼠患敗血癥而死亡。肺炎鏈球菌有 兩種菌株，1種稱為S型(Smooth)，菌落 光滑、可形成莢膜、具有致病性；另1種 R型(Rough)，菌落粗糙、不形成莢膜、 無致病性。Griffith做了幾組實驗： （1）動物試驗 （2）細菌培養試驗 （3）S型菌的無細胞提取液試驗 （1）動物試驗）動物試驗 小鼠(活) 加活S菌 加活R菌或死S菌 加活R菌和熱死S菌 小鼠(活) 小鼠(死) 小鼠(死) 活的S菌 抽心血 分離 （2）細菌培養試驗）細菌培養試驗 熱死S菌 培養皿培養 不生長 活R菌 培養皿培養 長出R菌 熱死S菌+活R菌 培養皿培養 長出大量R菌和10-6S

5、菌 （3）S S型菌的無細胞提取液試驗型菌的無細胞提取液試驗 活R菌S菌無細胞抽提液+ 培養皿培養 長出大量R菌和少量S菌 實驗說明：加熱殺死的S型細菌，在 其細胞內可能存在一種轉化物質，它能 通過某種方式進入R型細胞，并使R形細 胞獲得表達S型莢膜性狀的遺傳特性。 O.T.Avery 1944年，O.T.Avery等利用單細胞成分進一步證明了轉化因子是DNA。 活R菌 加S菌的DNA 加S菌的DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA及DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白質 加S菌的莢膜多糖 活S菌 活R菌 由這些結果可知，只有S型細菌DNA才能將肺炎鏈球菌由R型轉化成S型；并 且DNA的純

6、度越高，轉化效率也越高，當所用的DNA量低于610-8g時，仍具有 感染力，這說明，由S型菌株轉移給R型的只有DNA。 2.噬菌體感染試驗噬菌體感染試驗 1952年，Hershey和Chase利用同位素標記試驗證明DNA是噬菌體的遺傳物質 基礎，在其DNA中，含有包括合成蛋白質外殼在內的整套遺傳信息。 3.植物病毒的重建實驗植物病毒的重建實驗 1956年，Fraenkel-Conrat利用煙草花 葉病毒（TMV）和霍氏車前花葉病毒（ HRV）進行了植物病毒的重建實驗。 TMV與HRV親緣關系相近。 結果證實 ：RNA病毒中，遺傳的物質基礎是RNA。 二二.遺傳物質在胞內的存在部位及方式遺傳物質

7、在胞內的存在部位及方式 1.七個水平 細胞水 平細胞核 水平染色體 水平核酸水 平基因水 平密碼子 水平核苷酸 水平 (1)(1)細胞水平細胞水平 在微生物細胞中，其大部或幾乎全 部的DNA都集中于細胞核。 (2)細胞核水平 真核生物與原核生物的細胞核存在 明顯的差別。 除細胞核外，有的微生物細胞質內 還存在一些能自主復制的核外染色體 質粒(Plasmid)。 不同細胞或同種微生物的不同細胞中， 核的數目不同： 釀酒酵母、黑曲霉、產黃青霉是單 核； 粗糙脈孢菌、米曲霉是多核； 放線菌的菌絲細胞是多核，而孢子 則是單核； 細菌中，桿菌細胞大多存在兩個核 區，而球菌一般僅一個。 (3)(3)染色體

8、水平染色體水平 染色體數：真核生物的染色體數目較多 ，如酵母菌屬為17，脈孢菌屬為7；而原 核生物只有一個裸露的、在光學顯微鏡 下無法看到的環狀染色體。 染色體倍數：即同一細胞中相同染色體 的套數。多數微生物是單倍體，少數真 核微生物（釀酒酵母）的營養細胞及合 子是雙倍體，高等動植物的體細胞是雙 倍體。 核酸種類： 絕大多數生物的遺傳物質是 DNA，只有部分病毒為RNA。 (4)(4)核酸水平核酸水平 核酸結構：絕大多數微生物的DNA是雙 鏈的，少數病毒，如E.coli的X174和fd 噬菌體的核酸為單鏈結構。 DNA長度：即基因組大小。真核生物的 DNA要比原核生物長得多，基因數量也 較多。

9、 如啤酒酵母DNA的長度約6.5mm， 大腸桿菌為1.11.4mm；大腸桿菌含有 7500個基因，T2-噬菌體約有360個基因 ，而最小的RNA噬菌體MS2只有3個。 DNA狀態：在原核生物中DNA都是環狀 ；在病毒粒子中有的呈環狀，有的呈線 狀；細菌質粒的DNA是超螺旋結構的。 (5)(5)基因水平基因水平 在生物體內，一切具有自主復制能 力的遺傳功能單位，都可稱為基因。基 因的物質基礎是一個具有特定核苷酸順 序的核酸片段，由眾多基因構成了染色 體。每個基因大體在1000-1500bp，分子 量約為6.7105Dal。 (6)密碼子水平 遺傳密碼是指DNA鏈上決定各具體 氨基酸的特定核苷酸排

10、列順序。遺傳密 碼的信息單位是密碼子。 每個密碼子（coden）由三個核苷酸 序列即1個三聯體所組成，它是負載遺傳 信息的基本單位。密碼子一般都用 mRNA上3個連續核苷酸序列來表示。因 為4個核苷酸按三聯體的方式排列可有64 種組合，有同一氨基酸由幾個密碼子編 碼的情況。 基因水平是遺傳的功能單位，密碼 子水平是信息單位，而核苷酸水平（即 堿基水平）則可認為是一個最低突變單 位或交換單位。 在絕大多數生物的DNA中，都只含 腺苷酸(AMP)、胸苷酸(TMP)、鳥苷酸 (GMP)和胞苷酸(CMP) 4種脫氧核苷酸， 但也有少數例外，如E.coli的T偶數噬菌 體的DNA上就含有少量的稀有堿基

11、5-羥甲基胞嘧啶。 (7)(7)核苷酸水平核苷酸水平 2.2.原核生物的質粒原核生物的質粒（Plasmid） 一種獨立于微生物染色體外，能進 行自主復制的細胞質遺傳因子，只控制 微生物的次要性狀。 （1）質粒的構型 質粒一般以共價閉合環狀(covalently closed circle，簡稱CCC)的超螺旋雙鏈 DNA分子存在于細胞中。 近年來在疏螺旋體、鏈霉菌和酵母 菌中發現了線型雙鏈DNA質粒和RNA質 粒。 （2）質粒的大小 質粒 DNA 染色體 DNA 質粒分子的大小范圍從1kb左右到 1000kb，細菌質粒多在10kb以內。每個 質粒含有幾個到數百個基因。每一個細 胞可含有1幾百個

12、質粒。 （3）質粒的特性）質粒的特性 a.是細菌非必須的遺傳物質。 b.具有不相容性。 c.具有可轉移性。某些質粒能以較高的頻率（10-6）通過細胞間的接合作 用或其他機制從供體細胞轉移到受體細胞中。 d.可整合性。 e.可重組性。 f.可消除性。在高溫或某些化學藥物（絲裂霉素C、紫外線、利福平、重金 屬離子）的處理下，質粒可以被消除，同時宿主細胞也將失去質粒控制的 表型性狀。 g.耐堿性。與染色體的DNA比較，質粒DNA具有較強的耐堿性。 （4）質粒的類型）質粒的類型 質粒按 功能和 賦予宿 主的表 型效應 接合質粒(Fertility factor，F因子) 抗性質粒(Resistance

13、 factor，R因子) 細菌素質粒(Bacteriocin plasmid) 毒性質粒(Virulence plasmid) 代謝質粒(Metabolic plasmid) 典型質粒 ： F質粒：F因子、致育因子或性因子，是 大腸桿菌等細菌決定性別并有轉移能力 的質粒。 R質粒：R因子。1957年，日本出現經抗 生素治愈的痢疾病人中，可分離到同時 對許多抗生素或化學治療劑如鏈霉素、 氯霉素、四環素或磺胺等呈抗藥性的痢 疾志賀氏菌。且這種抗藥基因可傳遞。 Col質粒：大腸桿菌素質粒或產大腸桿 菌素因子。 細菌素：許多細菌都能產生抑制或殺死 其它近緣細菌或同種不同菌株的代謝產 物，因為它是由質粒

14、編碼的蛋白質，且 不像抗生素具有很廣的殺菌譜，所以稱 細菌素。 大腸桿菌素是一類由大腸桿菌某些菌株 所產生的細菌素，具有專一地殺死其它 種腸道菌或同種其它菌株的能力。大腸 桿菌素由Col質粒編碼。 Ti質粒：即誘癌質粒或冠癭質粒。 降解性質粒：只在假單胞菌中發現。可 為降解一系列復雜有機物的酶編碼，用 于污水處理、環境保護等方面。并可通 過遺傳工程手段構建具有數種降解質粒 的菌株稱“超級菌”。 根癌土壤桿菌或根癌農桿菌從一些 雙子葉植物的受傷根部侵入根部細胞后 ，在其中溶解并釋放出Ti質粒，其上的 TDNA片段會與植物細胞的核基因組 整合，合成正常植株所沒有的冠癭堿類 ，破壞控制細胞分裂的激素

15、調節系統， 從而使它轉為癌細胞。 因TDNA片段可攜帶任何外源基 因整合到植物基因組中，所以是當前植 物基因工程中使用最廣、效果最佳的克 隆載體。 第二節第二節 基因突變和誘變育種基因突變和誘變育種 一.基因突變 二.突變與育種 一一.基因突變基因突變 基因突變(Gene mutation) 是指生物 體內遺傳物質的分子結構突然發生可遺 傳的變化。 根據突變的原因又可將其分為自發 突變(Spontaneous mutation)和誘發突變 (Induced mutation)兩種類型。 1.突變的類型突變的類型 突變株 的表型 選擇性 突變株 非選擇性 突變株 營養缺陷 型抗性突變 型條件致死

16、 突變型 形態突變 型抗原突變 型產量突變 型 按突變后突變株能否在選擇性培養 基上被迅速篩選出劃分為選擇性突變株 （Selective mutant）和非選擇性突變株 （Non-selective mutant）。 (1)(1)營養缺陷型營養缺陷型( (Auxotroph)Auxotroph) 是指某一野生型菌株因發生基因突 變而喪失合成一種或幾種生長因子的能 力，因而無法在基本培養基上正常生長 繁殖的變異類型。 (2)抗性突變型(Resisant mutant) 是指野生型菌株因發生基因突變， 而產生的對某種化學藥物或致死物理因 子的抗性變異類型。 可在加有相應藥物或用相應物理因 子處理的

17、培養基平板上選出，如抗藥性 菌株等。 可在加有相應營養物質的基本培養 基平板上選出。 (3)(3)條件致死突變型條件致死突變型( (Conditional lethal mutant) Conditional lethal mutant) 是指菌株或病毒經基因突變后，在 某種條件下可正常生長繁殖并呈現其固 有的表型，而在另一條件下卻無法生長 繁殖的突變類型。 Ts突變株即溫度敏感突變株，如大 腸桿菌的某些菌株在37可正常生長， 不能在42下生長。原因是突變使某些 重要蛋白質的結構功能改變，以致出現 37可生長而42下不能生長的特點。 (4)形態突變型(Morphological mutant)

18、 是指由于基因突變而使個體或菌落 形態發生的變異類型。 如細菌莢膜鞭毛的有無、霉菌或放 線菌孢子著色的變化，菌落表面的粗糙 或光滑等。 (6)產量突變型 是指由于基因突變而引起細胞抗原 結構發生變異的類型。 是指通過基因突變而產生的在代謝 產物產量上明顯有別于原始菌株的突變 類型。若產量高于原始菌株者稱正變株 ，反之為負變株。 如細胞壁缺陷變異（L型細菌等）， 莢膜或鞭毛成分的變異等。 (5)(5)抗原突變型抗原突變型( (Antigenic mutant) Antigenic mutant) 在生產實踐上篩選高產正變株十分 重要。 2.2.突變率突變率( (Mutation rate) Mu

19、tation rate) 每一個細胞在每一世代中發生某一 性狀突變的幾率，稱為突變率。 一般突變是獨立發生的，某一基因 的突變不會影響其他基因的突變率。同 一細胞中同時發生兩個基因突變的幾率 是極低的。 3.基因突變的特點 由于遺傳的物質基礎相同，微生物 在遺傳變異的特點上與其他生物一樣遵 循同樣的規律。比如細菌的耐藥性可借 三種方式產生：即基因突變、質粒轉移 和生理適應。 如每次分裂中，青霉素抗性的突變率為 10-8，鏈霉素抗性的突變率為10-6，則在 同一細胞中兩種突變同時發生的幾率為 10-14。臨床上據此可聯合用藥提高療效 。 （1）不對應性：突變性狀與引起突變的 原因間無直接的對應關

20、系。（2）自發性：各種性狀的突變，可在沒 有人為的誘變因素處理下自發地產生。 （3）稀有性：自發突變的頻率極低，一 般10-610-9。（4）獨立性：在某一群體中，突變是隨 機的，獨立發生的，任何性狀都可發生 基因突變，并且該基因的突變不會影響 其他基因的突變率。 （5）可誘變性：利用誘變劑處理，可以 提高突變率10105倍。（6）穩定性：由于突變造成遺傳物質在 結構上發生穩定的變化，所產生的新的 變異性狀也是穩定的、可遺傳的。 （7）可逆性：任何性狀既可發生正向突 變，也可發生回復突變。 4.基因突變的自發性和不對應性的實驗證據基因突變的自發性和不對應性的實驗證據 又稱波動試驗或彷徨試驗，是

21、1943 年Luria和Delbruck根據統計學原理設計 的實驗(獲1969年諾貝爾生理學獎): (1)變量實驗（Fluctuation test ） Salvador Luria Max Delbruck 結果說明：E.coli抗噬菌體性狀的 突變，不是由噬菌體誘導出來的，而是 在它接觸噬菌體前，在細胞分裂過程中 隨機地自發產生的。而且自發突變發生 得越早，抗性菌落數就越多，反之則越 少。噬菌體在這里僅起著淘汰原始的未 突變的敏感菌和甄別抗噬菌體突變型的 作用。利用這一方法還可計算出突變率 。 (2)(2)涂布試驗（涂布試驗（Newcombe experimentNewcombe expe

22、riment） 1949年，Newcombe設計了一種與變 量試驗相似，但方法更為簡便的涂布試 驗。采用固體平板培養法。 結果：在涂布過的一組中，共長出抗性 菌落353個，比未經涂布過的（僅28個菌 落）高得多。證實抗性突變發生在未接 觸噬菌體之前。 (3)(3)平板影印培養試驗（平板影印培養試驗（Replica platingReplica plating） 1952年，J. Lederberg夫婦設計了一 種平板影印培養法，可更好地證明微生 物的抗藥性是在未接觸藥物前自發產生 的，這一突變與相應的藥物環境毫不相 干。平板影印培養法實質上是一種通過 蓋印章的方式，達到在一系列平板的相 同位置

23、上重現相同遺傳型菌落的接種培 養法。 Joshua Lederberg 結果證實：原始的鏈霉素敏感菌株在 根本未接觸鏈霉素的情況下，也可產生 大量抗鏈霉素的突變株。 5.基因突變的機制基因突變的機制 基因突變的原因多種多樣，包括自 發突變和誘發突變，誘變又可分為點突 變和畸變。突變的類型概括如下： （1）誘變的機制）誘變的機制 凡能提高突變率的任何理化因子， 都稱為誘變劑。誘變的類型多樣，常見 ： 堿基置 換 移碼突變 染色體畸變 堿基置換（堿基置換（Substituttion） 堿基置換是指一對堿基被另一對堿 基所取代。 置換又可分為兩類： a.轉換（transition）：AG，TC b.

24、顛換（transversion）： AT，AC； GC，GT 亞硝基胍、硫酸二乙酯等可與堿基 發生化學反應而直接引起轉換（少數是 顛換）。5BU（5-溴尿嘧啶）等是一些堿 基的類似物，可通過活細胞的代謝活動 摻入到DNA分子中而間接引起置換。 移碼突變（移碼突變（frame-shift or Phase-shift mutation） 是指誘變劑使DNA分子增添或缺失一 個或少數幾個核苷酸，從而使該部位后 面的全部遺傳密碼發生轉錄和轉譯錯誤 的一類突變。 包括缺失（ABCABABC）和添加（ ABCABCABC）。 由移碼突變所產生的突變株，稱為 移碼突變株（frame shift mutan

25、t）。 移碼突變與堿基置換都屬點突變。 吖啶類染料，包括原黃素、吖啶黃、吖 啶橙和-氨基吖啶等都是移碼突變的有 效誘變劑。 染色體畸變（染色體畸變（chromosomal aberration） 某些強烈理化因子如X射線、烷化劑 、亞硝酸等除能引起點突變外，還能引 起DNA大損傷染色體畸變。 染色體 畸變 缺失（deletion）:abc ghijkl 重復（duplication） :abcabc def 插 入 （ i n s e r t i o n ） :abcpqr def 易位（轉座， translocation）:abcpqr ghi 倒位（inversion） :abcfed g

26、hi （2）自發突變機制自發突變機制 自發突變是指在沒有人工參與下， 生物體自然發生的突變。 自發突變是由于一些原因不詳的低 劑量誘變因素的長期作用而造成的綜合 誘變效應。其可能機制如下： 自 發 突 變機制 背景輻射和環境因素 的誘變 微生物自身有害代謝 產物的誘變效應 互變異構效應 環出效應 背景輻射和環境因素的誘變背景輻射和環境因素的誘變 宇宙空間的各種短波輻射或高溫， 以及自然界普遍存在的一些低濃度誘變 物質（在微環境中有時也可能是高濃度 ），可引起自發突變。 微生物自身有害代謝產物的誘變效應 過氧化氫是許多微生物的代謝產物 ，這種物質具有強氧化性，對脈胞菌（ Neurospora）等

27、微生物有誘變作用，這 種作用可因同時加入過氧化氫酶而降低 ；但如果加入酶的同時又加入酶抑制劑 KCN，則又可提高突變率。這說明過 氧化氫可能是“自發突變”中的一種內 源性誘變劑。 互變異構效應 有的誘變劑（如5-BU等）可引起堿 基分子發生酮式至烯醇式的互變異構， 由于識別錯誤，可導致突變。 在DNA的復制過程中，如果其中一條 單鏈偶然形成一個小環，環上的基因就 可能越過復制而發生遺傳缺失，從而造 成自發突變。下圖即為環出效應的設想 機制。 環出效應環出效應 在上鏈中 ， 因 標記B處發生“ 環出”， 故 只 有A及C能進行 復制，從 而 發 生自發突 變 。 而在下鏈 中 ， 復制仍正 常

28、進 行。 6.紫外線對紫外線對DNADNA的損傷及其修復的損傷及其修復 紫外線作用于微生物核酸后，嘧啶 對UV的敏感性比嘌呤強，形成嘧啶二聚 體及其水合物，造成局部DNA分子無法配 對，從而引起微生物死亡或突變。 但微生物可以多種方式修復損傷的 DNA，現主要介紹以下兩種。 光復活作用 暗修復作用 （1）光復活作用光復活作用 經紫外線照射后的微生物立即暴露 于可見光下時，可明顯降低死亡率，這 種現象稱為光復活作用。 1949年，A.Kelner在灰色鏈霉菌中 首先發現發現了這一現象，以后，在 E.coli等許多微生物中都被證實。 對照 ： 試驗 ： 8106個ml E.coli 8106個ml

29、 E.coli 100個ml E.coli 2106個ml E.coli UV UV 360490nm 可見光，30分 形成胸腺嘧啶二聚體的DNA分子，在 黑暗下會被光激活酶結合，這種復合物 暴露在可見光（300500nm）下時，此酶 因獲得光能而發生解離，并使二聚體重 新分解成單體。 鑒于在微生物中普遍存在光復活作 用，因此，在進行紫外線誘變育種時， 只能在紅光下進行照射和處理照射后的 菌液，且在黑暗條件下培養。 (2)暗修復作用：切除修復 與光復活作用不同，這種修復作用 與光無關。 是一種不依賴可見光，只通過酶切 作用去除嘧啶二聚體，隨后重新合成一 段正常DNA鏈的核酸修復方式。 二二.突

30、變與育種突變與育種 1.自發突變與育種 在日常生產中，微生物會以一定頻 率（10-6）發生自發突變。利用自發突 變可以選育優良的生產菌種。 (1)從生產中選育 (2)定向培育優良品種 定向培育是指用某一特定因素長期 處理某一微生物的群體，同時不斷地移 種傳代，以達到累積并選擇相應的自發 突變株的目的。 它是一種古老的育種方法。如卡介 苗是法國A.Calmette和C.Guerin把牛結 核分枝桿菌接種在含牛膽汁和甘油的馬 鈴薯培養基上，連續移種230多代（13年 ），直至1923年才獲成功。 2.誘變育種誘變育種 誘變育種是指利用物理或化學誘變 劑處理均勻而分散的微生物細胞群，促 使其突變率顯

31、著提高，然后采用簡便、 快速和高效的篩選方法，從中挑選少數 符合育種目的的突變株，以供科學實驗 或生產實踐使用。 誘變育種具有極其重要的實踐意義 ，是目前廣泛使用的一種育種手段。當 前發酵工業和其他微生物生產部門所使 用的高產菌株，幾乎都是通過誘變育種 來提高生產性能的。 優點：可提高代謝產物產量，還可改進 產品質量、擴大品種和簡化生產工藝。 方法簡便易行、工作進度快和收效顯著 。 最突出的例子是青霉素生產菌株的選育 成功： 1943年，NRRL1951菌株發酵量為 100U/mL。 目前，NRRL-Q1765進一步變異株發酵量 為50000-100000U/mL。 (1)(1)誘變育種的基本

32、環節誘變育種的基本環節 出發 菌株 多數個體死亡 少數存活 誘變 多數未變 少數突變 多數負變 少數正變 多數 幅度小 少數 幅度大 多數不 宜投產 少數適 宜投產 存活率突變率正變率高產率投產率計算 ： (2)(2)誘變育種的幾個原則誘變育種的幾個原則 選擇簡便有效的誘變劑 挑選優良的出發菌株 處理單孢子(或單細胞)懸 液 選用適宜的誘變劑量 充分利用復合處理的協同 效應 利用和創造形態、生理與 產量間的相關指標 設計或采用高效篩選方案 或方法 3.3.營養缺陷型突變株的篩選營養缺陷型突變株的篩選 （1）篩選營養缺陷型突變株常用的三種培養基 基本培養基（MM，minimal medium ）

33、：是指只能滿足某微生物野生型菌株 生長需要的最低成分的組合培養基。 不同微生物由于營養要求不同，其 基本培養基不相同的，有的極其復雜， 如乳酸菌、酵母菌或梭菌等的基本培養 基，有的極其簡單，如E.coli的基本培 養基。基本培養基可用“-”來表示。 完全培養基（CM，complete medium ）：指凡可滿足一切營養缺陷型菌株營 養需要的天然或半組合培養基。 完全培養基可用 “+”來表示。 一般可在基本培養基中加入一些富含氨 基酸、維生素和堿基之類的天然物質（ 如蛋白胨或酵母膏等）配制而成。 補充培養基（SM，supplemental medium）：是指只能滿足相應的營養缺 陷型菌株生長

34、需要的組合培養基。 補充培養基是由基本培養基再添加 營養缺陷型菌株所不能合成的代謝物所 構成，可根據加入的營養物是A或B而分 別用A或B來表示。 （2 2）與營養缺陷型突變有關的三類遺傳型個體）與營養缺陷型突變有關的三類遺傳型個體 野生型（Wild type）：是指從自然界 分離到的任何微生物在其發生營養缺陷 突變前的原始菌株。 可在其相應的基本培養基上生長。 如果以A和B兩個基因來表示其對這兩種 營養物的合成能力，則野生型菌株的遺 傳型應是A+B+。 營養缺陷型（auxotroph）：野生型菌 株經誘變處理后，由于發生了喪失合成 某種營養物能力的突變，因而只能在加 有該營養物的培養基中才能生

35、長。 不能在基本培養基上生長，只能在 完全培養基或相應的補充培養基上生長 。A、B營養缺陷型的遺傳型分別用A - B+或A+B-表示。 原養型（Prototroph）：一般指營養 缺陷型突變株經回復突變或重組后產生 的菌株。 其營養要求在表型上與野生型相同 ，原養型的遺傳型為A+B+。 （3 3）營養缺陷型的篩選方法）營養缺陷型的篩選方法 誘變劑 處理 淘汰野 生型 檢出缺 陷型 鑒定缺 陷型 抗生 素法 菌絲過 濾法 青霉 素法 制霉菌 素法 細 菌 真 菌 真 菌 放 線 菌 夾層培養 法 限量補充 培養法 逐個檢出 法 影印平板 法 生長 譜法 第三節第三節 基因重組基因重組 兩個不同性

36、狀個體內的遺傳物質進 行交換，經過基因的重新組合，形成新 遺傳型個體的過程，稱為基因重組（ Gene recombination）或遺傳重組。 重組可使生物體在未發生突變的情 況下，也能產生新遺傳型的個體。 一.原核生物的基因重組 二.真核生物的基因重組 一一.原核生物的基因重組原核生物的基因重組 轉化 轉導 接合 原生質體融合 在原核微生物中，基因重組由以下 幾種方式： 1.1.轉化（轉化（TransformationTransformation） 受體菌（Receptor）吸收來自供體 菌(Donor cell)的DNA片段后，通過交換 將其整合到自身的基因組中，再經復制 就獲得了來自供體

37、的遺傳信息。 受體菌接受供體菌的DNA片段而獲得 部分新的遺傳性狀的現象，稱為轉化或 轉化作用。通過轉化方式形成的雜種后 代稱為轉化子（transformant）。 轉化非常普遍，原核生物如肺炎鏈 球菌、嗜血桿菌屬、芽孢桿菌屬、葡萄 球菌屬、根瘤菌屬、假單胞菌屬、黃單 胞菌屬等。真菌如釀酒酵母、黑曲霉等 。 轉化過程大致 可分為： 感受態階 段DNA的結合 與吸收 轉化DNA的 整合 （1 1）感受態階段感受態階段 感受態（Competence）是指受體細 胞最易接受外源DNA片段，并實現其轉化 的一種生理狀態。 兩個菌株間能否發生轉化，主要與 微生物的親緣關系有關，但是，即使在 轉化率極高的

38、那些種中，不同的菌株間 也不一定都發生轉化。研究發現，能進 行轉化的受體細胞必須處于感受態。 感受態出現除與菌種有關外，還受 環境因子的影響，如cAMP（環腺苷酸） 和Ca2+可提高細胞的感受態水平。 一般原核生物的核基因組是一條環 狀DNA長鏈，在自然或人為條件下均易斷 裂成碎片，故轉化因子通常只是15kb左 右長的片段，其上平均含有15個基因。 最易與細胞表面結合的是dsDNA形式。供 體菌的dsDNA片段與感受態細胞表面的膜 連DNA結合蛋白相結合，其中一條鏈被水 解，另一條進入細胞。 轉化因子的本質是離體的DNA片段。 來自供體菌的ssDNA片段被細胞內 的特異蛋白結合，并使其與感受態

39、細胞 染色體上的同源區段配對重組，形成一 小段雜合DNA區段，隨著染色體復制而 復制，形成轉化子（即含有雜合DNA的 受體菌）。 （2 2）DNADNA的結合與吸收的結合與吸收 （3）轉化DNA的整合 轉染轉染 將噬菌體或其他病毒的DNA(RNA) 抽提出來，使其感染感受態，進而產生 正常的噬菌體或病毒的后代，稱為轉染 (Transfection)。 轉染與轉化不同之處是病毒或噬菌 體并非遺傳基因的供體菌，中間也不發 生任何遺傳因子的交換或整合，最后也 不產生具有雜種性質的轉化子。 2.2.轉導轉導（TransductionTransduction） 以完全缺陷或部分缺陷的噬菌體為 媒介，將供

40、體細胞的DNA小片段攜帶到受 體細胞中，通過交換與整合，從而使后 者獲得前者部分遺傳性狀的現象，稱為 轉導。獲得新遺傳性狀的受體細胞，稱 為轉導子（transductant）。 轉導是由J.Lederberg等(1952)在鼠 傷寒沙門氏菌中發現的。現在，許多原 核生物都發現有轉導現象，如大腸桿菌 、枯草桿菌、假單胞菌屬、志賀氏菌屬 、葡萄球菌屬、弧菌屬和根瘤菌屬等。 轉導現象在自然界中比較普遍，它在低 等生物的進化過程中，很可能是一種產 生新基因組合的重要方式。 目前已知的轉導方式主要有以下幾種 ： 普遍 轉導局限 轉導 溶源 轉變 （1 1）普遍轉導（普遍轉導（Generalized tr

41、ansductionGeneralized transduction） 通過完全缺陷噬菌體對供體菌任何 DNA小片段的“誤包”，而實現其遺傳性 狀傳遞至受體菌的轉導現象，稱為普遍 轉導。 普遍轉導又可分為兩種類型： 完全普 遍轉導 流產普 遍轉導 噬菌體將供體菌的染色體DNA片段誤 包形成缺陷噬菌體，這種噬菌體再將其 中的DNA導入受體菌，經過與受體菌染色 體組上的同源區段配對、雙交換，而將 供體菌DNA整合到受體菌的染色體組上， 從而使后者成為一個遺傳性狀穩定的轉 導子的現象，稱為完全轉導或普遍轉導 。 完全普遍轉導完全普遍轉導 流產普遍轉導流產普遍轉導 經轉導獲得供體菌DNA片段的受體菌

42、，如果外源DNA在其內既不進行交換、整 合和復制，也不迅速消失，而僅進行轉 錄、轉譯和性狀表達，這種現象稱為流 產轉導。 發生流產轉導的細胞在分裂后，只能 將外源DNA分配給一個子細胞，而另一子 細胞可獲得供體基因經轉錄、轉譯形成 的少量產物酶，因此在表型上仍可 出現輕微的供體菌特征，每經過一次分 裂，就受到一次“稀釋”。所以，能在 選擇性培養基平板上形成一個微小菌落 （即其中只有一個細胞是轉導子）就成 了流產轉導子的特點。 （2 2）局限）局限轉導（轉導（Restricted transductionRestricted transduction） 1954年在E.coli K12菌株中發現

43、此 現象。 是指通過部分缺陷的溫和噬菌體把 供體菌的少數特定基因攜帶到受體菌中 ，并獲得表達的轉導現象。 根據轉導子出現頻率的高低可將其 分成兩類：低頻轉導和高頻轉導。 以低頻轉導為例說明： 溫和噬菌體感染供體菌后，可使供 體細胞溶源化，當該供體菌發生誘導裂 解時，由于極少數（10-5）的前噬菌體 發生不正常切離，其結果會將插入位點 兩側之一的少數宿主基因（如E.coli 前噬菌體的兩側分別為gal基因和bio基 因）連接到噬菌體DNA上，通過衣殼的“ 誤包”，就形成了缺陷噬菌體（ Defective phage）。當這種缺陷噬菌體 再次感染宿主細胞時，可整合到宿主的 核基因組上，使宿主細胞成

44、為一個局限 轉導子（即獲得了供體菌的gal或bio基 因），而不是一個溶源菌，因而對噬 菌體不具有免疫性。 （3 3）溶源轉變（溶源轉變（Iysogenic conversionIysogenic conversion） 如白喉棒狀桿菌（Corynebacterium d i p h t h e r i a e） 和 肉 毒 梭 菌 （ Clostridium botulinum） 當溫和噬菌體感染宿主而使其發生 溶源化時，因噬菌體的基因整合到宿主 的核基因組上，而使后者獲得了除免疫 性以外的新性狀的現象，稱為溶源轉變 。 溶源轉變與轉導有著本質的區別： 溫和噬菌體并不攜帶任何來自供體菌 的外

45、源基因，使宿主帶來新性狀的正是 噬菌體本身的基因； 溫和噬菌體是完整的，而不是缺陷的 ；獲得新性狀的是溶源化的宿主細胞， 而不是轉導子；獲得的性狀可隨噬菌體的消失而同時 消失。 在細菌和放線菌中普遍存在接合現 象，尤以生活于動物腸道內的一些G細 菌最為常見。在放線菌中，研究得最多 的是鏈霉菌屬（Streptomyces）和諾卡氏 菌屬（Nocardia）。此外，接合還可發 生在不同屬的一些種間，如E.coli和鼠傷 寒沙門氏菌間或鼠傷寒沙門氏菌與痢疾 志賀氏菌（Shigella dysenteriae）間。 3.3.接合接合（ConjugationConjugation） 供體菌通過其性菌毛與

46、受體菌相接 觸，把F質粒或其攜帶的不同長度的核基 因組片段傳遞給后者，使后者獲得供體 菌的遺傳性狀的現象，稱為接合。通過 接合而獲得新性狀的受體細胞，稱為接 合子（conjugant）。 在細菌中，接合現象研究得最清楚 的是E.coli。對接合行為的研究表明： E.coli是有性別分化的。決定其性別的 是F質粒，凡有F因子的細胞，在其表面 就有相應的性菌毛存在。 根據細胞中是否存在F因子及其存在 方式的不同，可把E.coli分成四種相互 聯系的接合型菌株： F+(雄性) 菌株 F - ( “ 雌 性 ” ) 菌 株 Hfr菌株 F菌株 （1 1）F F+ +（雄性）菌株雄性）菌株 細胞中存在游

47、離的F因子，細胞表面 還有與F因子數目相當的性菌毛。當F+菌 株與F菌株接觸時，前者可通過性菌毛 將F因子轉移到后者的細胞內，使F 菌 株也轉變成F+菌株。 （2）F-（“雌性”）菌 株 在F-菌株中不含F因子，細胞表面也 沒有性菌毛。據統計，從自然界分離到 的2000個E.coli菌株中，約有30的菌 株是F-。 但它可通過與F+菌株或F菌株的接 合而接受供體菌的F因子或F因子，從 而使自己轉變成“雄性”菌株。 （3 3）HfrHfr菌株菌株（高頻重組菌株，高頻重組菌株，high frequency recombinationhigh frequency recombination） 因Hf

48、r菌株與F-菌株接合后發生重組 的頻率要比F+與F-接合后的重組頻率高 出數百倍故名。 在Hfr細胞中，其F因子已從游離狀 態轉變成在核染色體組特定位點上的整 合狀態(頻率約10-5)。 在實際轉移過程中，由于線狀單鏈 DNA太長常會發生斷裂。所以，越是處于 Hfr染色體前端的基因，進入F-的幾率就 越高。由于F因子位于線狀DNA末端，進 入F-細胞的機會最少，故引起F-變成F+( 性別轉變)的可能性也最小。因此，Hfr 與F-接合的結果其重組頻率雖最高，但 仍然為F-。 當Hfr與F-菌株發生接合時，Hfr的 染色體雙鏈中的一條單鏈在F因子處發生 斷裂，由環狀變為線狀，F因子則位于線 狀單鏈

49、DNA的末端。 （4 4）FF菌株菌株 當Hfr菌株內的F因子因不正常切離 而脫離核染色體組時，可重新形成游離 的但攜帶一小段染色體基因的特殊F因子 ，稱為F因子或F 質粒。 4.4.原生質體融合（原生質體融合（Protoplast fusionProtoplast fusion） 通過人為方法，使遺傳性狀不同的 兩個細胞的原生質體發生融合，并進而 發生遺傳重組,以產生同時帶有雙親性狀 的、遺傳性穩定的融合子（Fusant）的 過程，稱為原生質體融合。 能進行原生質體融合的細胞是極其 廣泛的，不僅包括原核生物中的細菌和 放線菌，而且還包括各種真核生物的細 胞。原核生物的原生質體融合研究是在 7

50、0年代后期才發展起來的一種育種新技 術，這是繼轉化、轉導和接合之后一種 更有效的轉移遺傳物質的手段。 原生質體融合的主要步驟：原生質體融合的主要步驟： 選擇親本：先選擇兩個有特殊價值的 并帶有選擇性遺傳標記的細胞作為親本 ； 脫壁：在高滲溶液中，用適當的脫壁 酶（細菌或放線菌可用溶菌酶或青霉素 處理，真菌可用蝸牛酶或其他相應的脫 壁酶等）去除細胞壁； 融合：將形成的原生質體進行離心聚 集，加入促融合劑PEG(Polyethylene glycol,聚乙二醇)或通過電脈沖等促進 融合; 細胞壁再生：在高滲溶液中稀釋，再 涂在能使其再生細胞壁和進行分裂的培 養基上。 鑒定：當形成菌落后，通過影印接種 法，將其接種到各種選擇性培養基上， 鑒定它們是否為融合子，最后再測定其 他生物學性狀或生產性能。 第四節第四節 菌種的衰退、復壯和保藏菌種的衰退、復壯和保藏 一.菌種的衰退與復壯 二.菌種的保藏 一一.菌種的衰退與復壯菌種的衰退與復壯 在生物進化過程中，變異是絕對的 ，穩定性是相對的；退化性變異是大量 的，而進化性變異卻是個別的。 具體表現為： 原有形態性狀變得不典型：蘇云金