1、流式細胞術 Flow cytometry， FCM 1. 流式細胞儀流式細胞儀(Flow Cytometer):是現(xiàn)代物理電是現(xiàn)代物理電 子技術、激光技術、計算機技術于一體的先進子技術、激光技術、計算機技術于一體的先進 科學技術設備。科學技術設備。 2. 流式細胞術流式細胞術(Flow Cytometry):利用流式細胞利用流式細胞 儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生儀對處于快速直線流動狀態(tài)中的單列細胞或生 物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量物顆粒進行逐個、多參數(shù)、快速的定性、定量 分析或分選的技術。分析或分選的技術。 基本概念 第一節(jié) 流式細胞儀基本結構與原理 第二節(jié) 流式細胞術

2、的數(shù)據(jù)分析 第三節(jié) 流式細胞儀分析的技術要求 第四節(jié) 流式細胞術的應用 一、流式細胞儀基本結構與功能 二、流式細胞術的重要術語 三、流式細胞術基本原理 四、流式細胞術的樣本設置 第一節(jié) 流式細胞儀基本結構與原理 四、流式細胞術的樣本設置 1. 常用對照 陰性對照 陽性對照 空白對照 補償對照 2.一套完整的流式細胞術檢測樣本設置 陰性對照 作用是調節(jié)各熒光探測器合適的放大倍數(shù)， 將儀器歸零，即確定待測標本的基礎熒光域值 免疫球蛋白同型對照免疫球蛋白同型對照（同型抗體為沒有特異性、與 熒光抗體蛋白亞型一致的免疫球蛋白。反映待測標本對 抗體非特異性結合的 水平） 陰性細胞對照陰性細胞對照（用已知不

3、表達某種抗原的細胞進行平 行實驗，通常用于確定抗體的特異性） 陽性對照 即用已知表達某種抗原的細胞（陽性細胞）細胞進行平行實驗，通常用 于檢測抗體是否有問題或確定實驗方法的穩(wěn)定性、準確性。 空白對照 即不進行標記的細胞。有些細胞內物質會同樣被激發(fā)而產生自發(fā)熒光。空白對照的主要作用用于確定待 測標本的基礎熒光域值或檢測染色方法是否成功。 補償對照 由于光譜的重疊，對于多色分析樣本必須設置補償對照。補 償對照主要用于多色分析時熒光光譜重疊的補償調節(jié)。 補償對照是將用于多色標記的各種熒光抗體分別與樣本反應， 一一進行單色標記，以測定熒光信號的重疊并作適當調節(jié)。 2.一套完整的流式細胞術檢測樣本設置

4、流式細胞術的基本原理是利用流式細胞術的基本原理是利用細胞標記前后的熒光細胞標記前后的熒光 強度改變強度改變來確定細胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用來確定細胞性狀，故一套完整流式樣本即要有用 于確定其基礎熒光域值的對照（如空白對照或陰性對照），于確定其基礎熒光域值的對照（如空白對照或陰性對照）， 又要有已標記的待測樣本。一套完整的流式樣本設置可根又要有已標記的待測樣本。一套完整的流式樣本設置可根 據(jù)其不同的標記方法進行如下設置。據(jù)其不同的標記方法進行如下設置。 直接標記樣本直接標記樣本 對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（同型抗對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（同型抗 體對照）和待測樣本

5、。對于直接標記多色樣本，在單色基體對照）和待測樣本。對于直接標記多色樣本，在單色基 礎上另加補償對照。礎上另加補償對照。 間接標記樣本間接標記樣本 對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（一抗同對于單色樣本應設置空白對照、陰性對照（一抗同 型抗體對照）和待測樣本。型抗體對照）和待測樣本。 對于多色樣本，在單色基礎上另加補償對照，一般對于多色樣本，在單色基礎上另加補償對照，一般 不建議使用。不建議使用。 三、流式細胞術基本原理 1.1.流式細胞術分析的基本原理流式細胞術分析的基本原理 2.2.流式細胞術分選的基本原理流式細胞術分選的基本原理 3.3.流式細胞儀熒光補償設置流式細胞儀熒光補償設置 1

6、.流式細胞術分析的基本原理 前向散射與側向散射是前向散射與側向散射是 細胞的固有屬性，暫稱細胞的固有屬性，暫稱 為物理屬性。為物理屬性。 熒光信號是人們通過不熒光信號是人們通過不 同手段將熒光物質結合同手段將熒光物質結合 在細胞上，是人為屬性，在細胞上，是人為屬性， 暫稱為化學屬性。暫稱為化學屬性。 R1：淋巴細胞 R2：單核細胞 R3：粒細胞 R4：紅細胞裂解碎片和少量血小 板 將目的細胞群圈定（即設門），然后將門內細胞以FSC或SSC為橫坐 標，熒光信號為縱坐標的散點分布圖表示出來，此圖中細胞會出現(xiàn)在與其 FSC或SSC相應的位置，并只可能表現(xiàn)兩種情況：熒光信號弱或無、熒光 信號強或有。

7、調節(jié)電壓可改變目的細胞的熒光信號強弱，那么如何判斷 特異性熒光信號的有無？ 需要設置陰性對照以確定細胞自身基礎熒光域值，并通過 它來判斷待測樣本中是否有特異性熒光信號。 首先通過調節(jié)電壓將陰 性對照細胞的基礎熒光域值 調至陰性致信區(qū)內，然后對 陰性置信區(qū)進行界定，大于 陰性置信區(qū)的熒光信號為特 異性熒光信號。 對于流式樣本來說，設 置陰性對照是必須的，且陰 性置信區(qū)一旦設定，將作為 后續(xù)樣本的陰、陽性判斷的 基礎，不能隨意變動。 2.流式細胞術分選的基本原理 1. 分選速度：幾千個細胞/秒 2. 分選純度: 99.5%左右 分離后的樣品中該亞群細胞所占的百分比。 3. 分選收獲率: 90-95

8、% 分離后所得的細胞亞群數(shù)占原細胞樣品中該亞群 細胞數(shù)的百分比。 3.3.流式細胞儀熒光補償設置流式細胞儀熒光補償設置 以以FITC、PE雙色分析為例：雙色分析為例： （1）先調節(jié)陰性對照管（即同型對照）先調節(jié)陰性對照管（即同型對照IgGFITC、 IgGPE）：先將原補償清零，通過調節(jié)電壓，使陰性群）：先將原補償清零，通過調節(jié)電壓，使陰性群 落在落在FITC和和PE雙陰性區(qū)。陰性對照的作用是，調節(jié)各雙陰性區(qū)。陰性對照的作用是，調節(jié)各 熒光探測器合適的放大倍數(shù)，即歸零。熒光探測器合適的放大倍數(shù)，即歸零。 （2）FITC標記抗體標記抗體/IgGPE：(IgGPE為同型對照為同型對照) 此時此時

9、電壓已通過陰性對照設定，絕不能變動。當電壓已通過陰性對照設定，絕不能變動。當PE探測器探測器 檢測到的檢測到的FITC信號恰好完全消除時，補償便是正確的，信號恰好完全消除時，補償便是正確的， 即即FITC單陽性細胞的單陽性細胞的PE信號與陰性對照的信號與陰性對照的PE信號一信號一 致。致。 注：首先要知道雙陰性細胞的情況，其次是在檢測管中，注：首先要知道雙陰性細胞的情況，其次是在檢測管中， 必須要有必須要有FITC單陽性細胞和雙陰性細胞。單陽性細胞和雙陰性細胞。 （3）IgGFITC/PE標記抗體：同理，將進入FITC探測器 的PE信號降至本底一致，前提是必須有PE單陽性細胞 和雙陰性細胞。

10、（4）當設置好以上補償條件后，即補償調節(jié)完畢。 （5）進行多色分析時，必須做各熒光間的補償。方法同 上，先準備各種標記的熒光陰性對照，確定合適的電壓， 并逐一調節(jié)各熒光標記抗體，與其他熒光對照，然后調 節(jié)特異性熒光對每個熒光的補償。 二、流式細胞術的重要術語 1.1.前向散射與側向散射前向散射與側向散射 2. 2. CoulterCoulter效應與電子體積效應與電子體積 3.3.熒光信號及其面積與寬度熒光信號及其面積與寬度 4.4.光譜重疊與熒光補償光譜重疊與熒光補償 5.5.細胞基礎熒光域值與陰性對照置信區(qū)間細胞基礎熒光域值與陰性對照置信區(qū)間 1.前向散射與側向散射 前向散射光 (forw

11、ard scatter)： FSC信號的強弱與細胞的大小相關 側向散射光（side scatter)： SSC信號的強弱與細胞內的顆粒多少相關 利用前向角和 測向角散射光可 以把外周血白細 胞分成三群，淋 巴細胞、單核 細胞和粒細胞。 散射光的測定 2.Coulter效應與電子體積 Coulter Coulter效應原理：效應原理： 微小粒子并不導電，但通微小粒子并不導電，但通 過充滿電解液的小孔時可過充滿電解液的小孔時可 產生電阻變化，細胞體積產生電阻變化，細胞體積 越大，電阻的改變越大。越大，電阻的改變越大。 可將電阻變化記錄為電位可將電阻變化記錄為電位 變化，用于微小粒子體積變化，用于微

12、小粒子體積 測量和計數(shù)上。采用這種測量和計數(shù)上。采用這種 方法計算該顆粒的體積就方法計算該顆粒的體積就 是電子體積。是電子體積。 3.熒光信號及其面積與寬度 熒光信號被光電倍增管收集，形成信號脈沖，每個信號脈沖都有其熒光信號被光電倍增管收集，形成信號脈沖，每個信號脈沖都有其 高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個特定的檢測器，每高度、面積與寬度。每種顏色的熒光占用一個特定的檢測器，每 種顏色的檢測器稱為一個熒光通道。種顏色的檢測器稱為一個熒光通道。 脈沖高度表示熒光信號的強度，表示為脈沖高度表示熒光信號的強度，表示為FLn-Height，n為儀器的熒為儀器的熒 光收集器序數(shù)。光收集器序數(shù)。

13、脈沖面積（脈沖面積（FLn-A）是采用積分計算的熒光通量。（熒光脈沖面積）是采用積分計算的熒光通量。（熒光脈沖面積 比高度更能準確反映比高度更能準確反映DNA含量，用于含量，用于DNA倍體分析）倍體分析） 脈沖寬度（脈沖寬度（FLn-W）反映熒光的分布，）反映熒光的分布，常用來區(qū)分雙連體細胞常用來區(qū)分雙連體細胞。 4.光譜重疊與熒光補償 利用電子技術或計算機軟件等方法將串入相鄰熒光通道的 信號加以扣除的技術稱“熒光補償” 5.細胞基礎熒光域值與陰性對照置信區(qū)間 對于流式樣本，由于細胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會與待測標本中對于流式樣本，由于細胞的自發(fā)熒光、熒光抗體會與待測標本中 的細胞發(fā)生少量非特異

14、性結合，在流式細胞儀上可檢出一定的信的細胞發(fā)生少量非特異性結合，在流式細胞儀上可檢出一定的信 號，這部分信號稱為基礎熒光域值。號，這部分信號稱為基礎熒光域值。 在流式標本檢測過程中，通常需要通過調節(jié)電壓將陰性細胞的基在流式標本檢測過程中，通常需要通過調節(jié)電壓將陰性細胞的基 礎熒光域值置于礎熒光域值置于95%或或99%的置信區(qū)間內，作為陰性對照可信的置信區(qū)間內，作為陰性對照可信 區(qū)間設定。區(qū)間設定。 一、流式細胞儀基本結構與功能 1. 流式細胞儀基本結構 2. 流式細胞儀的基本功能與應用 2. 流式細胞儀的基本功能與應用 定性或定量分析功能定性或定量分析功能 細胞膜：細胞膜：細胞表面抗原，表面糖

15、類，表面受體，膜電位，細胞表面抗原，表面糖類，表面受體，膜電位， 膜結合鈣離子，細胞表面電荷等，這對確定細胞的性質膜結合鈣離子，細胞表面電荷等，這對確定細胞的性質 及其功能重要。及其功能重要。 細胞質：細胞質：各種細胞成分，包括蛋白質、各種細胞成分，包括蛋白質、RNARNA、各種細胞、各種細胞 器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細胞因子器中的特殊成分、各種抗原、基因編碼蛋白、細胞因子 等。等。 細胞核：細胞核：DNADNA、RNARNA、蛋白質等、蛋白質等 分選功能分選功能 可將具有特定性狀或功能的細胞從混合細胞群中分可將具有特定性狀或功能的細胞從混合細胞群中分 離出來，再進行分析或培養(yǎng)

16、。優(yōu)點：分選純度高離出來，再進行分析或培養(yǎng)。優(yōu)點：分選純度高 （可達（可達99%99%），分選回收率高，可分選活細胞。），分選回收率高，可分選活細胞。 1. 流式細胞儀基本結構 流動室與液流系統(tǒng)流動室與液流系統(tǒng) 光源與光學系統(tǒng)光源與光學系統(tǒng) 激發(fā)光源激發(fā)光源 光學系統(tǒng)光學系統(tǒng) 信號收集與光電轉信號收集與光電轉 換系統(tǒng)換系統(tǒng) 計算機與分析系統(tǒng)計算機與分析系統(tǒng) 流動室與液流系統(tǒng) PMT PMT PMT PMT 二分鏡 帶通濾光片 激光 1 2 3 4 Flow cell 由若干組透鏡、濾光片和分光鏡等光學元件 組成，它們分別將不同波長的光信號送入到 不同的探測器。濾光片主要分為四類： 長通濾光片（

17、LP）、短通濾光片（SP）、 帶通濾光片（BP）和二分鏡 光學系統(tǒng) 激發(fā)光源 激光(Laser)是一種相干光源，它能提供單一波長、單 一方向、同步的穩(wěn)定光照 激光波長: 臺式機為固定波長488nm, 633nm ，大型 機波長譜線寬包括325，457.9，488, 514.5，520.8， 530.9，568.3， 633，647 nm 信號收集與光電轉換系統(tǒng) 主要由光電轉換器件、放大器和信號處理電路主要由光電轉換器件、放大器和信號處理電路 組成組成 光電轉換器件主要功能是將光信號轉換成電流信光電轉換器件主要功能是將光信號轉換成電流信 號。由光電二極管和光電倍增管（號。由光電二極管和光電倍增管

18、（PMTPMT）來執(zhí)行。）來執(zhí)行。 放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。放大器分兩類：線性放大和對數(shù)放大。 信號處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號轉變成脈沖信號處理系統(tǒng)的主要功能是將電信號轉變成脈沖 信號、數(shù)字信號最終傳送給計算機系統(tǒng)進行處理。信號、數(shù)字信號最終傳送給計算機系統(tǒng)進行處理。 計算機與分析系統(tǒng) 計算機系統(tǒng)用于控制整個儀器的運行，數(shù)據(jù)采集和數(shù)據(jù)分析。 各公司所產的流式細胞儀都有自己特有的分析系統(tǒng)。 第二節(jié) 流式細胞術的數(shù)據(jù)分析 一、參數(shù) 前向散射光FSC: 反映顆粒的大小 側向散射光SSC: 細胞內部結構復雜程度 熒光FL: 細胞被染上熒光部分數(shù)量的多少 二、數(shù)據(jù)的顯示與分析 三、設門 二、

19、數(shù)據(jù)的顯示與分析 1.單參數(shù)直方圖 2.二維散點圖 3.二維等高線圖 4.假三維圖 5.三維圖 以分布直方圖( distribution histogram )來顯示，橫軸 為該參數(shù)測量強度相對值，單位是道數(shù)。強度分布可以是線性 的，也可以是對數(shù)的。縱軸一般是細胞數(shù)或細胞出現(xiàn)的頻數(shù)。 1.單參數(shù)直方圖 看圖技巧： 1.先看橫、縱坐標，了解檢測目的； 2.看圖形分布，直方圖峰形越往右移，代表其熒光強度越強； 3.M1的確定是根據(jù)陰性對照細胞的基礎熒光域值設定的，峰形右移，熒光信 號大于基礎熒光域值（M1），表示陽性（M2）； 4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計時，檢測目的物一般用各Marker區(qū)內的細胞所占百分比或用

20、平均 熒光強度表示； 5.幾個直方圖的比較，關鍵看Marker（M1、M2）的位置以及細胞數(shù)。 能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關系，橫、縱 坐標分別代表兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示具有相應坐 標值的細胞。 2.二維散點圖 看圖技巧：1.先 看x，y軸，了解代 表參數(shù)的意義；2. 再看其四個象限， 并了解各象限意義； 3.比較幾個散點圖 時，關鍵看四象限 劃分區(qū)間的位置以 及各象限散點的密 度；4.數(shù)據(jù)統(tǒng)計時， 檢測目的物一般用 各象限區(qū)內的細胞 數(shù)占門內細胞百分 比或用平均熒光強 度表示。 用等高線來表示細胞數(shù)，在一條等高線上細胞數(shù)相 同，不同的等高線上細胞數(shù)不同。 3.二維等高線

21、圖 縱軸與橫軸分別代表被測細胞的兩個測量參 數(shù),Z軸為細胞數(shù)。 4 .假三維圖 5.三維圖 任意選三個參數(shù)為x，y，z軸，構成一個三維圖，每 一群細胞根據(jù)各自參數(shù)處于一個相對獨立的空間，三維圖 對比較復雜的亞群的顯示更為直觀明了。 三、設門 流式細胞術數(shù)據(jù)分析的目的是通過與適當?shù)年幮詫φ樟魇郊毎g數(shù)據(jù)分析的目的是通過與適當?shù)年幮詫φ?進行比較，來確定所分析樣本中表達標記物的細胞百分進行比較，來確定所分析樣本中表達標記物的細胞百分 率。完成這一過程的第一步就是需要確定我們所要研究率。完成這一過程的第一步就是需要確定我們所要研究 的目的細胞群，其術語為設門（的目的細胞群，其術語為設門（gating

22、gating）。）。 設門是指在細胞分布圖中指定某一個范圍或某一細胞設門是指在細胞分布圖中指定某一個范圍或某一細胞 性狀的細胞群，并對其進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。性狀的細胞群，并對其進行單參數(shù)或多參數(shù)分析。 根據(jù)散射光設門根據(jù)散射光設門 根據(jù)某一細胞性狀設門根據(jù)某一細胞性狀設門 組合設門組合設門 一、樣品制備：單細胞懸液 二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色 三、質量控制 第三節(jié) 流式細胞儀免疫分析的技術要求 一、樣品制備 流式細胞儀的樣品要求： 單細胞懸液，避免任何細胞沉積 被檢細胞或顆粒大小0.240um 樣品中至少20000個細胞，濃度105-106個/毫升 （一）外周血淋巴細胞樣品的制

23、備 利用紅細胞裂解液去除紅細胞后，得到外周血中所有 白細胞的流式細胞分析的二維散點圖 單層培養(yǎng)細胞加蛋白酶消化后吸管吹打的方法 使細胞從培養(yǎng)皿上消化下來，然后離心漂洗。 懸浮培養(yǎng)細胞，可不用酶消化，直接吹打制備 成單細胞懸液。 （二) 培養(yǎng)細胞的樣品制備 機械法：剪碎法、網搓法、研磨法。 酶處理法：胃蛋白酶、胰蛋白酶、膠原酶等。 化學試劑處理法：EDTA、EGTA等。 表面活性劑處理法： Triton-100、皂素等。 (三)新鮮實體組織單細胞懸液的制備 機械法往往常成嚴重的細胞損傷，而結果卻是 較低的細胞產量。 如用低速離心去碎片，用尼龍網過濾團塊等， 也可利用電子學技術處理的方法排除團塊和

24、碎片 的干擾。 酶學法、化學法對實體組織的分散效果較理想， 但會造成所測化學成份的不良影響。FCM所測細 胞是單個分散狀態(tài)；對細胞團塊，細胞碎片盡可 能少；細胞的活性不受損害，以保證下一步的熒 光染色處理不受影響。 防止細胞自溶，保持細胞膜原有的特性保存的方法： 1、深低溫保存法：深低溫冰箱，保存一年。 2、乙醇與甲醇保存法：70%冷乙醇、75%的甲醇。 3、甲醛或多聚甲醛固定法：細胞不具有生物活性，但 細胞表面熒光染色分析不受影響。 (四）單細胞懸液的保存 染料的選擇和標記染色保證了熒光信號的產生 （一）免疫熒光標記最常用的熒光染料 熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色 FIT

25、C 488 525 深藍色 PE(RDI) 488 575 橙色 ECD 488 620 橙紅色 PeCy-5 488 670 紅色 PeCy-7 488 755 深紅色 PI 488 620 橙紅色 APC 633 670 紅色 二、免疫分析中常用的熒光染料與標記染色 用化學法將兩種不同激發(fā)波長的染料結合在一起，在 488nm波長激發(fā)光激發(fā)后產生的發(fā)射波長激發(fā)另一熒光 染料產生的熒光信號。 Laser CY5 PE CY5 CY5 488nm 能量傳遞染料： 熒光染料與細胞成分的結合方式： 結構親和方式 嵌入結合方式 共價結合方式 熒光抗體特異性結合方式 1、直接免疫熒光染色 2、間接免疫熒

26、光染色 （二）免疫熒光標記 3、雙或多參數(shù)熒光抗體的組合標記 FITC+PE 488 525 、575 綠色、橙色 FITC+T red 488 525 綠色 568 615 紅色 FITC+PeCy5 488 525、 675 綠色、 紅色 FITC+ ECD 488 525、 625 綠色、橙紅色 F+P +PeCy5 488 525、575、675 綠、橙、紅色 F+ ECD +PeCy5 488 525、575、675 綠、 橙紅色、紅色 F+P+APC 488 525 、 575 綠色、橙色 633 670 紅色 熒光染料 激發(fā)波長（nm) 發(fā)射波長（nm) 顏色 （一）單細胞懸液制

27、備的質量控制 （二）細胞懸液免疫熒光染色的質量控制 1、溫度對熒光染色的影響 2、pH對熒光發(fā)射強度的影響 3、熒光染料濃度的控制 4、固定劑對熒光染色的影響 （三）儀器操作技術的質量控制 三、質量控制 1、同型對照：選用相同源性的未標記單抗作為 同型對照（陰性對照） 2、全程質控：在流式檢測中，樣品標記、溶血、 洗滌、儀器質量控制和上機檢測的過程都會直接影 響檢測結果。采用標準質控樣品來進行全程質控， 使得同類實驗室建立質控比對，數(shù)據(jù)可以互用。 （四）免疫檢測的質量控制 第四節(jié) 流式細胞術的應用 細胞表面分子的檢測與分析細胞表面分子的檢測與分析 細胞內或細胞核內抗原檢測與分析細胞內或細胞核內抗原檢測與分析 細胞凋亡的檢測與分析細胞凋亡的檢測與分析 DNA含量檢測與細胞周期的分析含量檢測與細胞周期的分析 細胞增殖的檢測與分析細胞增殖的檢測與分析 細胞分選細胞分選 細胞毒的檢測與分析細胞毒的檢測與分析 可溶性蛋白質分子的檢測與分析可溶性蛋白質分子的檢測與分析 報告基因的檢測與分析報告基因的檢測與分析 補償對照 由于光譜的重疊，對于多色分析樣本必須設置補償對照。補 償對照主要用于多色分析時熒光光譜重疊的補償調節(jié)。 補償對