1、第十二章 天然藥物活性成分研究,一、從天然藥物中開發新藥的方法,1. 經過文獻資料或民間用藥的調研或通過現代藥理學的篩選研究，發現某種動物、植物、礦物或微生物具有藥用價值，然后將其開發成新藥。,2. 已知某種成分或某類成分具有藥用價值或已成為新藥，根據動植物的親緣關系，尋找含有這種或這類成分的動植物，進而將其開發成新藥。,第一節 天然藥物活性成分的研究途徑和方法,3. 將臨床療效明確的經典方、經驗方或經藥效學研究具有開發價值的復方中藥開發成新藥，或將現有的藥物改變劑型，如由口服液改為片劑、注射劑等。 采用這種形式開發的新藥：有效成分不明確，藥品的質量控制難度較大。但具有生產工藝不太復雜、成本較

2、低、比較符合我國國情等特點。,4. 搞清有效成分和有效部位的基礎上，將有效部位開發成新藥。因有效成分已明確或基本明確，故采用這種方法開發的新藥具有藥品的均一性、較易控制、臨床療效穩定、質量易于得到保證等特點。,5. 通過有效成分或生物活性成分的研究，從中發 現有藥用價值的活性單體或潛在藥用價值的活性單體 先導化合物。通過先導化合物構效關系的研究，發 現有藥用價值的化合物。 先導化合物 有一定的生物活性，但因其活性 不夠顯著或毒副作用較大，無法將其開發成新藥的具 有潛在藥用價值的化合物。,研究天然藥物新藥的一般過程：,二、天然活性成分的篩選： 以活性為指標進行追蹤 從天然藥物或中藥中分離活性化合

3、物時，多在確認供試樣品的活性之后。 1.先選擇簡單易行、靈敏度高、可靠的活性測試方法作指導。 2.在分離的每一階段對分離得到的各個部分進行活性定量評估，并追蹤其中活性最強部分。 3.因為物質分離與活性分離同步進行，一般在最終階段總能得到某種活性成分，發現新化合物的可能性也很大。,活性測試方法選擇是活性追蹤分離的關鍵 理想的體外活性測試方法應具有的特點： 簡易、快速、不需特殊設備、方便、抗干擾性強、假 陽性和假陰性均較低、臨床相關性強等優點。但在實際工作中理想的活性測試方法往往很難找到，只有綜合分析考慮，根據實際情況、條件以及研究開發的課題選擇較理想的活性測試方法。同時也要根據實踐經驗積累和科學

4、技術的發展，改進現有的一些活性測試方法和建立一些新的活性測試方法。,確保供試材料具有活性 在活性追蹤分離之前: 要采用體內體外多種方法，多個指標對實驗材料進行活性測試，其目的是再次確證實驗材料的活性，確定有無進一步研究的價值； 為選擇活性追蹤分離所用的活性測試方法提供依據。 以下的流程是美國癌癥研究中心（NCI）用于篩選確 認植物或動物粗提取物抗腫瘤活性的改進方案。,從天然藥物中篩選追蹤得到活性化合物只是一類創新藥物研究的前期階段。而且不少的天然活性化合物還存在一定的毒副作用或因含量太低，難以從天然原料中取材；或因結構過于復雜，合成也十分困難，故本身并無直接開發利用前途。此時只能以它們為先導化

5、合物，經過一系列的化學修飾或結構改造后，才能發現比較理想的活性化合物，并開發成為新藥上市。,天然化合物的化學修飾或結構改造：,喜樹堿,：抗癌活性，毒性大,喜樹堿,10羥基喜樹堿,秋水仙堿：具有抑制腫瘤作用，但毒性較大。經結構改造后仍保持較高的抗癌作用，毒性也較低，用于治療乳腺癌。,三、天然藥物化學成分的預試驗,（一）預試驗的目的和分類 系統預試驗 單項預試驗 （二）單項預試驗 1、單項預試驗溶液的制備 （1）水提取液 （2）中性醇提取液 （3）酸性醇提取物 （4）石油醚提取液,1.系統提取分離方法:是研究天然藥物成分的初步提取分離方法。用極性從低到高的溶劑依次提取。 石油醚油脂、蠟、葉綠素、揮

6、發油、游離甾體及三萜類 氯仿或醋酸乙酯游離生物堿、有機酸及黃酮、香豆素的苷元 丙酮或乙醇、甲醇苷類、生物堿鹽、鞣質等 水氨基酸、糖類、無機鹽等 2.單體分離,四、天然藥物化學成分的提取分離,天然藥物中生物活性成分的研究方法,第二節 結構研究法,結構研究是天然藥物化學的一項重要的研究內容。 合成西藥：原料已知，反應條件一定時，事先可以預測得到產物的結構。 中藥化學成分：未知因素很多，對于微量物質難以采用化學方法確定結構，主要靠波譜分析的方法解決。,一、化合物的純度檢查,檢查純度的方法： 外觀、顏色、形態是否均一. 測定各種物理常數，如熔點、沸點、比旋光度、折光率等. 如果可能是已知物，用已知結構

7、的對照品進行對 照測定或測定它們的共熔點等. 薄層色譜、紙色譜（三種展開系統均呈單一斑點） 氣相色譜、高效液相色譜.,二、結構研究的主要程序,對未知天然化合物的結構研究程序,三、結構研究中采用的主要方法,（一）確定分子式，計算不飽和度,1. 元素定量分析配合分子量測定 有機化合物的元素大多由C、H、O、N等組成，對組成元素的種類和比例的分析，可以通過元素分析的方法確定。分子量的測定方法目前最常用的是質譜法。 2. 同位素豐度比法 有機化合物的主要元素均由相對豐度比一定的同位素組成，且質量相差12。 3. 高分辨質譜法（HR-MS） 可將物質的質量精確測定到小數點后3位，通過比較精確質量可區分分

8、子量相同的不同化合物。,不飽和度的計算 u=/2/21 ：一價原子數 如H、X ：三價原子數，如N、P ：四價原子數，如C,作用： 用于確定分子量；求算分子式。 提供結構信息，推測未知物結構。 特點： 應用范圍廣，進行同位素及化合物分析。 分析速度快，可與色譜聯用。 靈敏度高，樣品用量少（只需5-10 g）,（二）質譜,（二）質譜,常用質譜技術及特點 電子轟擊質譜（EI-MS，electron impact ionization） 場解析質譜（FD-MS，field desorption ionization） 快速原子轟擊質譜（FAB-MS，fast atom bombardment） 電噴

9、霧質譜（ESI-MS，electrospray ionization）,電子轟擊質譜（EI-MS）：樣品氣化后，氣態分子受一定能量的電子沖擊，使分子電離或裂解產生各種陽離子。 場解析質譜（FD-MS）：試樣稀液涂于鎢絲上作陽極，對面加陰極，通高壓，使電離。,樣品需加熱氣化，離子化，得到M+ 難氣化、易熱解的成份測不到M+ 如糖、苷、氨基酸、肽、蛋白、核酸、抗生素,難氣化、易熱解的成份，可得到 分子離子相關峰：MH+、MNa+、MK+ 逐個脫去糖基的碎片峰：MH-162+、MH-162-146+ 苷元的碎片離子相對少,快速原子轟擊質譜（FAB-MS）：離子槍發射高能離子與另一中性粒子碰撞，交換電

10、荷，形成高速中性粒子，與樣品碰撞，使其電離。,難氣化、易熱解的成分，可得到 分子離子相關峰：MH+、MNa+、MK+ 可得到苷元的碎片,電噴霧質譜（ESI-MS）：強靜電場使試樣電離,難氣化、易熱解、大分子、小分子，均可得到 分子離子相關峰：MH+、MNa+、MK+,（三）紅外光譜（IR）,原理： 分子吸收紅外線后引起化學鍵的振動或轉動能級躍遷而形成的吸收譜圖（4000625cm-1） 作用： 特征頻率區（functional group region） 40001500 cm-1確定官能團類型 指紋區（fingerprint region） 1500600 cm-1構象、構型、取代模式等,特

11、征基團區,指紋區,（四）紫外-可見吸收光譜,電子由基態躍遷至激發態（、n）在紫外可見光區引起的吸收譜圖 測定范圍：200700nm 之間 作用：對含有共軛雙鍵、,-不飽和羰基、芳香化合物的結構鑒定有重要價值 特定的吸收譜特征骨架類型的判斷 如：黃酮、香豆素、蒽醌 加診斷試劑前后譜圖的規律性變化取代情況的推斷 如：黃酮、香豆素,生色團：產生紫外吸收的不飽和基團，如C=C, C=O, O=N=O等； 助色團：其本身是飽和基團（常含有雜原子），它連到生色團上時，能使后者吸收波長變長或吸收強度增加，如-OH, -NH2, -Cl等； 紅移（red shift） ：由于基團取代或溶劑效應，最大吸收波長變

12、長。 藍移（blue shift）：由于基團取代或溶劑效應，最大吸收波長變短。,（四）紫外-可見吸收光譜,（五）核磁共振譜,1HNMR測定中通過化學位移（）、譜線的積分面積以及裂分情況（重峰數及偶合常數）可以提供分子中的1H的類型、數目及相鄰原子或原子團的信息。 （1）化學位移（chemical shift ）：1H核因周圍化學環境不同，其外圍電子密度以及繞核旋轉時產生的磁屏蔽效應也不同。不同類型的1H核磁共振信號將出現在不同的區域，據此可以進行識別。化學位移范圍：在010 ppm。,1. 氫核磁共振(1H-NMR),具有磁距的原子核在高強度磁場作用下，可吸收適宜頻率的電磁輻射，而不同分子中原

13、子核的化學環境不同， 將會有不同的共振頻率，產生不同的共振譜。,特征質子的化學位移值,1,0,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,C3CH C2CH2 C-CH3 環烷烴,0.21.5,CH2Ar CH2NR2 CH2S CCH CH2C=O CH2=CH-CH3,1.73,CH2F CH2Cl CH2Br CH2I CH2O CH2NO2,24.7,0.5(1)5.5,68.5,10.512,CHCl3 (7.27),4.65.9,910,OH NH2 NH,CR2=CH-R,RCOOH,RCHO,常用溶劑的質子的化學位移值,D,（2）峰面積：因為1HNMR譜上積分面積與

14、分子中的總質子數相當，當分子式已知時，就可以算出每個信號所相當的1H數，積分值與氫的數目成正比。如乙醇的氫譜中CH3與CH2的譜峰積分值基本等與3:2。 （3）信號的裂分及偶合常數：已知磁不等同的兩個或兩組1H核在一定距離內會因相互自旋偶合干擾而使信號發生分裂，表現不同裂分，如：s,d,t,q,m等。裂分間的距離為偶合常數（J，Hz）用以表示相互干擾的強度，其大小取決于間隔鍵的距離。,（五）核磁共振譜,1. 氫核磁共振(1H-NMR),（五）核磁共振譜,與氫譜一樣，核磁共振碳譜也是采用相對值來表示化學位移，通常使用四甲基硅烷（TMS）作為13C化學位移的零點。有機化合物的13C共振化學位移范圍

15、是0200ppm，碳譜的化學位移范圍較氫譜廣得多，能夠提供更多的信息。,2. 核磁共振碳譜,（五）核磁共振譜,13C信號的化學位移：,脂肪碳：小于50 連雜原子碳（C-O，C-N，C-S）：50100 甲氧基碳（-OCH3）：55左右 糖端基碳：95105 芳香碳、烯碳：98160 連氧芳碳：140165 羰基碳：168220，具體：醛：190205；酮：195220；羧酸：170185；酯及內酯：165180；酰胺及內酰胺：165180,常見13CNMR譜有下面幾種： 噪音去偶譜：采用寬頻電磁輻射照射1H，使其對13C偶合全部消除，13C信號以單峰形式出現 選擇氫核去偶譜:對某個氫核進行選擇性照射，以消除其偶合影響，與之相關聯的13C信號發生改變，根據峰的裂分變化情況，結合化學位移，可以推斷分子中存在的片段結構。 DEPT法:通過改變照射1H核的脈沖寬度（）或設定不同的弛豫時間，使不同類型的13C在圖譜上呈現單峰并分別呈現正向峰或倒置峰。,（五）