1、.微生物肥料生物安全通用技術準則（NY 1109-2006）1范圍本標準規定了微生物肥料使用菌種安全性分級目錄、不同菌種及產品選擇毒理學試驗的原則、程序、試驗方法和結果評價方法。本標準適用于中華人民共和國境內生產、銷售的微生物肥料。2規范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據本標準達成協議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB 15193.3-2003 急性毒性試驗GB/T 4789.28-2003食品衛生微生物學檢驗

2、染色法、培養基和試劑3術語和定義下列術語和定義適用于本標準。3.1半數致死量 median lethal dose,LD50是經口給予受試物后，預期能夠引起動物死亡率為50%的單一受試物劑量，該劑量為經過統計得出的估計值。其單位是每千克體重所攝入受試物質的毫克數、克數或毫升數，即mg/kg體重、g/kg體重或mL/kg體重。4選擇毒理學試驗的原則4.1生產用菌種微生物肥料生產用菌種分為四級管理，其安全分級目錄見附錄A。未列入附錄A中的菌種，除根瘤菌和乳桿菌(Lactobacillus）外，其余均需做毒理學試驗。4.1.1第一級（A.1）為免作毒理學試驗的菌種。4.1.2第二級（A.2）為需做急

3、性毒性試驗的菌種。4.1.3第三級（A.3）為需做致病性試驗的菌種。4.1.4 第四級（A.4）為禁用菌種。4.2產品4.2.1 除有機物料腐熟劑以外的固體微生物接種劑類產品均免做毒理學試驗。4.2.2復合微生物肥料、生物有機肥和液體劑型微生物接種劑等需做急性毒性試驗。5毒理學試驗程序5.1 菌種毒理學試驗程序5.1.1應提供微生物肥料生產用菌種的鑒定資料，包括屬及種的拉丁文學名和中文譯名、形態、生理生化特性及鑒定依據、功能評價等資料。5.1.2根據產品所含菌種的鑒定資料，依據附錄A之規定，確定菌種安全級別、是否做毒理學試驗及毒理學檢測項目。5.1.3對于需要做毒理學試驗的菌種，生產者需提供試

4、驗用純菌種斜面，經復核確認與該菌種鑒定資料相符且無雜菌污染后，進行毒理學試驗。5.2產品毒理學程序需對送檢產品進行菌種和載體物料的真實性確認后，進行毒理學試驗。6試驗方法6.1受試物的準備6.1.1菌種受試物將試驗菌種接種于適宜的培養基中，在適宜的條件下培養一定時間，用生理鹽水調整菌液濃度至2.01082.0109cfu/mL，該溶液為菌種受試物。6.1.2產品受試物固體產品根據試驗要求，配制所需濃度，溶劑首選去離子水，也可選用羧甲基纖維素、明膠、淀粉等。液體產品不可稀釋，直接使用。6.2急性毒性試驗按GB 15193.3-2003執行。6.3致病性試驗致病性試驗包括以下項目。6.3.1急性毒

5、性試驗方法同5.2。6.3.2 一次破損皮膚刺激試驗6.3.2.1目的檢測受試物對實驗動物皮膚的刺激/腐蝕作用和強度。6.3.2.2實驗動物每次實驗至少需要3只皮膚完好的白色健康家兔或豚鼠。6.3.2.3操作程序a)涂受試物前，將家兔或豚鼠背部脊柱兩側的毛去掉，去毛范圍約2.5cm2.5cm，用75%酒精清潔、消毒暴露皮膚，待酒精揮發后，用滅菌刀片或注射針頭分別在兩塊皮區內劃一個“”形的破損傷口。注意皮膚破損僅達表皮，不要傷及真皮。b)將受試物0.5mL直接滴于破損皮膚上，或滴于同樣大小的2層4層紗布上并敷貼于破損皮膚表面，然后用一層無刺激塑料膜或油紙覆蓋，再用無刺激膠布固定。另一側去毛破損皮

6、膚作為空白對照（或溶劑對照），敷貼時間為4h。試驗結束后，用溫水或無刺激性溶劑除去殘留受試物。c)分別于去除受試物后1h、24h和48h觀察皮膚局部反應，并按表1進行刺激反應評分。注意鑒別感染和原發性刺激反應的區別，若有感染可疑，應進行重復測試。6.3.2.4評價規定在各個觀察時間點，按照表1對動物的皮膚紅斑與水腫形成情況進行評分，并按時間點將3只動物的評分相加，除以動物數，獲得不同時間點的皮膚刺激反應積分均值（刺激指數）。取其中最高皮膚刺激指數，按表2評定該受試物對動物皮膚刺激強度的級別。表1皮膚刺激反應的評分標準皮膚刺激反應皮膚刺激反應評分紅斑形成：無0勉強可見1明顯紅斑2中等嚴重紅斑3紫

7、紅色紅斑并有焦痂形成4水腫形成：無0勉強可見1皮膚隆起，輪廓清楚2水腫隆起約1mm3水腫隆起超過1mm4表2皮膚刺激強度分級皮膚刺激指數刺激強度級別00.5無刺激性0.52.0輕刺激性2.06.0中等刺激性6.08.0強刺激性6.3.3溶血試驗6.3.3.1目的檢測受試物是否具有溶血特性。6.3.3.2操作程序用無菌棉拭子蘸取菌種受試物,以蛇形線接種于血瓊脂平板(按GB/T4789.28-2003中4.6規定),置361培養箱中培養, 24h后觀察有無溶血環產生。同時用已知陽性菌株金黃色葡萄球菌等作為對照。6.3.3.3試驗結果菌落周圍有溶血環的，則溶血試驗陽性；否則為陰性。6.3.4抗菌藥物

8、敏感試驗質控菌株可選用大腸桿菌ATCC25922等標準菌株。6.3.4.1目的檢測受試物對抗生素的敏感性強度。6.3.4.2試驗用抗生素可選用頭孢哌酮（CFP）、四環素（TE）、頭孢唑啉（CZ）、鏈霉素（S）、俐特靈（FR）、環丙沙星（CIP）、復方新諾明（SXT）、氯霉素（C）、氨芐青霉素（AM）、慶大霉素（GM）、強力霉素（DO）、丁胺卡那霉素（AN）、甲氟哌酸（PEF）、氟啶酸（ENO）、多西環素(DO)、依諾沙星(ENO)、阿米卡星(AN)等中的幾種。6.3.4.3操作程序a)用無菌棉拭子將受試物均勻涂抹于營養瓊脂平板表面，共涂抹3次。每涂抹1次，平板應轉動60，最后將棉拭子繞平板邊緣

9、涂抹一周。蓋好平皿,置室溫干燥5min。b）用無菌棉拭子蘸取濃度為2.01082.0109cfu/mL質控菌株菌懸液，均勻涂抹于營養瓊脂平板表面，具體方法同上，作為對照試驗。c)以無菌操作取出抗生素紙片分別貼在涂有受試物和質控菌株菌懸液的平板培養基表面，每個平板放4個紙片。然后將平板置于361恒溫培養箱中培養18h后觀察抗生素紙片周圍有無抑菌環，量取并記錄其直徑（包括紙片直徑）大小，單位mm。試驗應做3個平行，取其均值。d)質控菌抑菌環應均在質控范圍內，說明試驗方法準確可靠，否則試驗無效。6.3.5急性腹腔注射致病性試驗6.3.5.1目的檢測受試物的急性致病性。6.3.5.2試驗動物清潔級健康

10、成年小鼠，體重1820g。6.3.5.3操作程序a）選健康成年小鼠40只,體重1820g，雌、雄各半，劑量為500mg/kgBW，按0.1mL/10gBW經腹腔注射受試物。b）于腹腔注射后第3d、7d分別取存活的實驗動物雌、雄各5只解剖，并做大體病理學觀察。c)腹腔注射后第14d將剩余實驗動物處死、解剖并做大體病理學觀察。6.3.5.4結果觀察、評價根據試驗周期內動物有無死亡及出現的中毒體癥、大體病理學觀察及病理組織學檢查發現病變的程度進行分級判定（見表3）。表3急性致病性判定標準級別判定依據強致病性動物出現死亡，死亡動物及24h以上存活動物在第3d、7d經解剖肉眼檢查或病理組織學檢查即可發現

11、臟器的明顯病變。弱致病性動物有中毒體癥無死亡，動物第14d經解剖肉眼檢查或病理組織學檢查可發現臟器的明顯病變。無致病性動物無中毒體癥無死亡，動物第14d解剖肉眼檢查或病理組織學檢查均未發現臟器的明顯病變。6.3.6 急性眼刺激試驗6.3.6.1目的檢測受試物對實驗動物眼睛的急性刺激和腐蝕作用。6.3.6.2實驗動物3只家兔，試驗前檢查家兔雙眼，有異常者不能用于試驗。6.3.6.3操作程序a）吸取受試物0.1mL,滴入家兔一側眼結膜囊內，另一側眼以生理鹽水作為正常對照。b）滴受試物后，將眼被動閉合4s,30s后用生理鹽水沖洗。于滴眼后1h、24h、48h、72h、7d、14d和21d，肉眼觀察家

12、兔眼結膜、虹膜和角膜的損傷與恢復情況。如果72h內未出現刺激反應，或第7d或第14d，眼睛刺激反應完全恢復，即可提前終止試驗。必要時，用2%熒光素鈉溶液或裂隙燈、放大鏡檢查角膜及虹膜變化。6.3.6.4評價規定按表4對家兔眼角膜、虹膜和結膜的急性刺激反應進行評分，并分別計算每只動物在三個不同觀察時間（24h、48h和72h）角膜損害、虹膜損害、結膜充血和結膜水腫四方面的“平均評分”（即每只動物的24h、48h和72h評分之和除以觀察數3）。分別以動物眼角膜、虹膜和結膜充血、水腫的平均評分和恢復時間進行評分，按表5或表6眼刺激反應分級標準判定受試物對眼睛的刺激強度。表4急性眼刺激反應的評分標準眼

13、損害表現評分角膜損害：無潰瘍形成或混濁散在或彌漫性混濁，虹膜清晰可見半透明區易分辨，虹膜模糊不清出現灰白色半透明區，虹膜細節不清，瞳孔大小勉強可見角膜不透明，混濁，虹膜無法辨認01234虹膜損害：正常皺褶明顯加深，充血，腫脹，角膜周圍有中度充血，瞳孔對光仍有反應出血、肉眼可見破壞，或瞳孔對光無反應012結膜（瞼結膜、球結膜）充血：血管正常血管充血呈鮮紅色血管充血呈深紅色，血管不易分辨彌漫性充血呈紫紅色0123結膜（瞼結膜、球結膜）水腫：無水腫輕微水腫（包括瞬膜）明顯水腫，伴有部分眼瞼外翻水腫至眼瞼近半閉合水腫至眼瞼大半閉合01234表5眼刺激反應分級標準級別判定依據可逆性損傷無刺激性3只動物的

14、平均評分：角膜損害1、虹膜損害1、結膜充血2和結膜水腫2；或3只動物中至少有2只動物的平均評分符合上述標準，另外1只動物的刺激反應在21d內完全恢復。輕刺激性3只動物中有2只動物的平均評分：角膜損害1；虹膜損害1；結膜充血2；結膜水腫2，且7d內全部動物的刺激反應完全恢復。刺激性a3只動物中有2只動物的平均評分：角膜損害1；虹膜損害1；結膜充血2；結膜水腫2，且21d內全部動物的刺激反應完全恢復。不可逆性損傷腐蝕性b至少有1只動物的角膜、虹膜或結膜的刺激反應在21d的觀察期內未完全恢復或/和在3只動物中有2只動物的平均評分：角膜損害3；虹膜損害1.5。注：完全恢復是指動物的眼刺激反應評分：角膜

15、損害=0，虹膜損害=0，結膜充血=0或1，結膜水腫=0或1。a接觸受試物后所產生的可逆性炎性反應。b接觸受試物后所產生的不可逆性組織損傷。表6眼刺激性反應分級標準平均評分動物數（只）恢復時間（d）a損傷類型角膜損害1和虹膜損害1和結膜充血2和結膜水腫21a為動物刺激反應評分恢復至角膜損害=0，虹膜損害=0，結膜充血=0或1，結膜水腫=0或1的時間。b至少有1只動物于21d尚存在角膜粘連或血管翳，也可判為腐蝕性。7結果評價凡毒理學試驗結果評價為有毒的產品，不得生產和銷售；有毒或致病性試驗結果不符合的菌種,均不得作為微生物肥料生產用菌種。7.1急性毒性試驗根據半數致死量（LD50）數值,判定受試物

16、的毒性分級,半數致死量(LD50)劑量分級按GB 15193.3-2003附錄D執行，凡LD505000mg/kgBW的，可通過，即該菌種可作為生產用菌種或該產品可進行生產、銷售。7.2致病性試驗7.2.1急性毒性試驗結果判定同6.1。7.2.2一次破損皮膚刺激試驗如結果為無刺激或僅具輕度刺激作用，可通過；否則，應放棄使用。7.2.3溶血試驗溶血試驗結果為陰性的，可通過；否則，應放棄使用。7.2.4抗菌藥物敏感試驗受試菌株必須對兩種以上的抗生素敏感；否則，應放棄使用。7.2.5急性腹腔注射致病性試驗結果為無急性致病性可通過；否則，應放棄使用。7.2.6急性眼刺激試驗結果對眼無刺激性或具有輕刺激

17、性的，可通過；否則，應放棄使用。附錄A（規范性附錄）菌種安全分級目錄A.1 第一級：免作毒理學試驗的菌種A.1.1根瘤菌類Azorhizobiumcaulinodans莖瘤固氮根瘤菌（田菁（莖瘤）根瘤菌）Bradyrhizobiumelkanii埃氏慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）Bradyrhizobiumjaponicum日本慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）Bradyrhizobiumliaoningense遼寧慢生根瘤菌（慢生大豆根瘤菌）Mesorhizobium huakuii華癸中生根瘤菌（紫云英）Mesorhizobium loti百脈根中生根瘤菌Rhizobium etli埃特里根瘤菌（

18、菜豆）Rhizobium leguminosarumbiovarphaseoli豌豆根瘤菌（菜豆生物型）Rhizobium leguminosarumbiovartrifolii豌豆根瘤菌（三葉草生物型）Rhizobium leguminosarumbiovarviceae豌豆根瘤菌（蠶豆生物型）Sinorhizobiumfredii費氏中華根瘤菌（快生大豆根瘤菌）Sinorhizobiummeliloti苜蓿中華根瘤菌還包括尚未確定種名的，從一些豆科植物根瘤內分離、純化、鑒定、回接、篩選后在原宿主植物結瘤、固氮良好的根瘤菌，如花生、綠豆、沙打旺根瘤菌等。A.1.2自生及聯合固氮微生物類Azo

19、spirillum lipoferum生脂固氮螺菌Azospirillum brasilense巴西固氮螺菌Azotobacter beijgerinckii拜氏固氮菌Azotobacter chroococcum褐球（圓褐）固氮菌Azotobacter vinelandii棕色固氮菌Azotobacter paspali雀稗固氮菌Beijerinckia indica印度貝氏固氮菌A.1.3光合細菌類Rhodobacter capsulatus莢膜紅細菌Rhodobacter sphaeroides類球紅細菌(球形紅桿菌)Rhodopseudomonas acidophila嗜酸紅假單胞菌R

20、hodopseudomonas gelatinosa膠質紅假單胞菌Rhodopseudomonas globiformis球形紅假單胞菌Rhodopseudomonas palustris沼澤紅假單胞菌Rhodopseudomonas rutila血色紅假單胞菌Rhodopseudomonas sulfidophila嗜硫紅假單胞菌Rhodopseudomonas viridis綠色紅假單胞菌Rhodospirillum fulvum黃褐紅螺菌Rhodospirillum rubrum深紅紅螺菌Rhodospirillum salinarium鹽場紅螺菌Rubrivivax gelatinos

21、us膠狀紅環菌（膠狀紅長命菌）A.1.4分解磷鉀化合物細菌類Bacillus amyloliquefaciens液化淀粉芽孢桿菌Bacillus laterosporus側孢芽孢桿菌Bacillus licheniformis地衣芽孢桿菌Bacillus megaterium巨大芽孢桿菌Bacillus mucilaginosus膠胨樣芽孢桿菌Bacillus subtilis枯草芽孢桿菌Bacillus thuringiensis蘇云金芽孢桿菌Thiobacillus thiooxidans氧化硫硫桿菌A.1.5促生細菌類Paenibacillus azotofixans固氮類芽孢桿菌Pae

22、nibacillus polymyxa多粘類芽孢桿菌A.1.6酵母菌類Candida guillermondii季也蒙假絲酵母Candida membranaefaciens膜醭假絲酵母Candida tropicalis熱帶假絲酵母Candida utilis產朊假絲酵母Endomycopsis fibuliger扣囊擬內孢霉Pichia farinosa 粉狀畢赤酵母Pichia membranaefaciens膜醭畢赤酵母Saccharomyces cerevisiae釀酒酵母Rhodotorula rubra深紅酵母A.1.7放線菌類Frankiasp.弗蘭氏克菌（固氮放線菌）Stre

23、ptomyces chingyangensis涇陽鏈霉菌Streptomyces microflavus細黃鏈霉菌A.1.8 AM真菌類Glomus mosseae摩西球囊霉A.1.9其它Lactobacillusparabuchner類布氏乳桿菌Lactobacillus acidophilus嗜酸乳桿菌Lactobacillus bulgaricus保加利亞乳桿菌Lactobacillus casei干酪乳桿菌Lactobacillus delbruecki德氏乳桿菌Lactobacillus lactis乳酸乳桿菌Lactobacillus plantarum植物乳桿菌Pediococc

24、us pentosaceus戊糖片球菌Streptococcus lactis乳酸鏈球菌Streptococcus thermophilus嗜熱鏈球菌A.2 第二級：需做急性毒性（LD50）試驗的菌種Arthrobacter aurescens金黃節桿菌Aspergillus candidusLink亮白曲霉Aspergillus niger黑曲霉Aspergillus oryzae米曲霉Aspergillus penicillioidesSpeg帚狀曲霉Aspergillus wentiiWehmer溫特曲霉Eurotium chevalieriMangin謝瓦散囊菌Bacillus bre

25、vis(Brevibacillus brevis)短芽孢桿菌Bacillus circulans環狀芽孢桿菌Bacillus coagulans凝結芽孢桿菌Bacillus pumilu短小芽孢桿菌Bacillus sphaericus球形芽孢桿菌Brevibacteriumsp.短桿菌Burkholderia fungorum真菌伯克霍爾德氏菌Chaetomium cochliodes 螺卷毛殼Chaetomium trilaterale 三側毛殼Clostridium pasteurianum巴斯德梭菌Geobacillusstearothermophilus嗜熱脂肪地芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)Geotrichum candidum白地霉Nocardiasp.諾卡氏菌Nocardiopsissp.擬諾卡氏菌Paenibacillus macerans浸麻類芽孢桿菌Penicillium citreonigrum黃暗青霉Penicillium citrinum桔青霉Penicillium frenguentans常現青霉Pen