1、免疫比濁分析技術原理與進展,桂林英美特生物技術研究所,一、免疫學基本原理 二、免疫沉淀 三、免疫比濁技術原理,免疫比濁檢驗技術原理與進展,一、免疫學基本原理,1、抗原與抗體 2、抗原抗體的結合免疫學反應 3、免疫學反應的檢測技術,1、抗原與抗體,抗原（Antigen, Ag）是刺激機體產生免疫應答的物質。 “應” 是指抗原刺激機體產生免疫應答產物-抗體或免疫效應細胞 “答” 是指相應抗原與免疫應答產物結合并將其排除體外） 抗原的免疫原性和免疫反應性 完全抗原與半抗原 抗原表位與抗原結合價位,1、抗原與抗體,1、抗原與抗體,免疫原性 免疫原性（immunogenecity）是指抗原分子能夠刺激機

2、體產生免疫應答（產生特異性抗體及免疫效應細胞）的性質。,Ag,抗體,免疫原性示意圖,1、抗原與抗體,免疫反應性：是指抗原分子與免疫應答產物（抗體或免疫效應細胞）發生特異性結合的性質。,抗原性（免疫反應性）示意圖,抗體,1、抗原與抗體,完全抗原（complete antigen) 具有免疫原性和抗原性的物質。 半抗原（hapten，又稱不完全抗原 incomplete antigen ）無免疫原性，只有抗原性的物質。 載體（carrier）賦予半抗原以免疫原性的蛋白質。 半抗原 + 蛋白質（載體） 完全抗原。,半抗原,+,載體,抗體,完全抗原,半抗原載體效應示意圖 半抗原 + 蛋白質（載體） 完

3、全抗原,1、抗原與抗體,抗原決定簇：抗原分子存在的能TCR/BCR或抗體Fab片段特異性結合的特殊化學基團，是免疫應答特異性的物質基礎。 構象決定簇 ：構象決定簇（conformational determinant）由空間構象形成的決定簇，序列上不連續。 順序決定簇：順序決定簇（sequence determinant），又稱線性決定簇（linear determinant），序列相連續的氨基酸肽片段構成的決定簇。 抗原結合價：抗原結合價（antigenic valence）是指能夠與抗體分子結合的決定簇數目。,1、抗原與抗體,1、抗原與抗體,抗原表位的性質、數目、位置、空間排列和立體構象決

4、定著抗原-抗體反應的高度特異性。,1、抗原與抗體,共同表位（common epitope）指不同抗原之間含有的相同或相似的抗原表位。 交叉反應（cross-reaction）指抗體或致敏淋巴細胞對具有相同或相似表位的不同抗原均具有的反應（交叉結合）。,1、抗原與抗體,抗體（antibody, Ab）功能性概念 是由抗原刺激而產生并能與刺激其產生的抗原發生特異性結合的、具有免疫功能的球蛋白?？贵w主要存在血清中，也存在于如呼吸道粘膜液、小腸粘膜液、唾液以及乳汁等其它體液中。 免疫球蛋白（immunoglobulin, Ig）結構性概念 具有抗體活性或化學結構與抗體分子相似的球蛋白。 抗體一定是球蛋

5、白，球蛋白未必是抗體,1、抗原與抗體,抗體的分子結構,1、抗原與抗體,“Y”型，四肽鏈 重鏈 （5種: 、 、） 輕鏈 （2種: 、） 可變區 （V區） 超變區（ 又稱CDR 互補決定區） 骨架區: FR 恒定區 （C區） 鉸鏈區,1、抗原與抗體,根據重鏈抗原性的不同，免疫球蛋白可以分為5類： IgG (gamma) IgA (alpha) IgM (mu) IgD (delta) IgE (epsilon),1、抗原與抗體,根據輕鏈C區抗原性不同，免疫球蛋白可分為2型) (kappa)型 (lambda)型 輕鏈存在于各類免疫球蛋白中 同一個免疫球蛋白分子中的輕鏈同型,1、抗原與抗體,抗體的

6、生物學功能特異性結合抗原 超變區表位 靜電力、氫鍵、范德華力 可逆 影響因素：PH、溫度、電解質,結合基礎,2、抗原抗體的結合免疫學反應,抗原抗體反應的原理 抗原與抗體能夠特異性結合是基于兩種分子間的結構互補性與親和性，這兩種特性是由抗原與抗體分子的一級結構決定的。 抗原抗體反應可分為兩個階段。第一為抗原與抗體發生特異性結合的階段，此階段反應快，僅需幾秒至幾分鐘，但不出現可見反應。第二為可見反應階段，抗原抗體復合物在環境因素（如電解質、pH、溫度、補體）的影響下，進一步交聯和聚集，表現為凝集、沉淀、溶解、補體結合介導的生物現象等肉眼可見的反應。 抗原抗體的結合使電荷減少或消失，蛋白質由親水膠體

7、轉化為疏水膠體。 四種分子間引力（電荷引力、范登華引力 、氫鍵結合力 和疏水作用 ）參與并促進抗原抗體間的特異性結合。,2、抗原抗體的結合免疫學反應,典型的抗原抗體結合反應,特異性識別,形成抗原抗體復合物,2、抗原抗體的結合免疫學反應,抗原抗體反應的特點,特異性 按比例 可逆性,2、抗原抗體的結合免疫學反應,2、抗原抗體的結合免疫學反應,影響抗原抗體反應的因素 電解質（離子強度）：抗原與抗體發生特異性結合后，雖由親水膠體變為疏水膠體，若溶液中無電解質參加，仍不出現可見反應。為了促使沉淀物或凝集物的形成，常用0.85氯化鈉或各種緩沖液作為抗原及抗體的稀釋液。由于氯化鈉在水溶液中解離成Na+和C1

8、，可分別中和膠體粒子上的電荷，使膠體粒子的電勢下降。當電勢降至臨界電勢（1215mV）以下時，則能促使抗原抗體復合物從溶液中析出，形成可見的沉淀物或凝集物。 酸堿度（pH）：抗原抗體反應必須在合適的pH環境中進行。蛋白質具有兩性電離性質，因此每種蛋白質都有固定的等電點。抗原抗體反應一般在pH為68進行。PH過高或過低都將影響抗原與抗體的理化性質，例如pH達到或接近抗原的等電點時，即使無相應抗體存在，也會引起顆粒性抗原非特異性的凝集，造成假陽性反應。 溫度：在一定范圍內，溫度升高可加速分子運動，抗原與抗體碰撞機會增多，使反應加速。但若溫度高于56時，可導致已結合的抗原抗體再解離，甚至變性或破壞；

9、在40時，結合速度慢，但結合牢固，更易于觀察。常用的抗原抗體反應溫度為37。每種試驗都有其獨特的最適反應溫度，例如冷凝集素在4左右與紅細胞結合最好，20以上反而解離。 其它：適當振蕩也可促進抗原抗體分子的接觸，加速反應。,3、免疫學檢測技術,凝集與沉淀 比濁 電位、微天平,放射性核素標記 酶標記、熒光標記和膠體金標記 化學發光物標記或偶聯化學發光反應,非標記免疫檢測技術,標記免疫檢測技術,二、免疫沉淀,凝集：細菌、螺旋體和紅細胞等顆?？乖谶m當電解質參與下可直接與相應抗體結合出現凝集，稱為凝集反應（agglutination）是最經典的免疫學檢測技術。,二、免疫沉淀,免疫沉淀反應:(prec

10、ipitation) 可溶性抗原與相應抗體，在適宜條件下發生結合，出現的沉淀現象。,免疫沉淀,液體內沉淀反應,凝膠內沉淀反應,免疫電泳技術,免疫濁度技術,絮狀沉淀試驗,環狀沉淀試驗,單向擴散試驗,雙向擴散試驗,試管法 平板法,免疫電泳 對流免疫電泳 火箭免疫電泳 免疫固定電泳,透射免疫比濁turbidimetermeasure 散射免疫比濁nephelomitermeasure,1:2,1:4,1:8,1:16,1:32,1:64,1:128,各管抗原倍比稀釋,加入抗血清,各管抗體量不變,振搖 混勻、37孵育,沉淀量不同,試管內絮狀沉淀試驗,輕搖,絮,狀,沉,示,意,圖,淀,Ag,Ab Ag,

11、Ab,Ag,凝膠內沉淀試管法,單向瓊脂擴散試驗,凝膠內沉淀試驗平板法,標準品抗原濃度測定,不同病人抗原濃度測定,原理,將一定量的抗體混入瓊脂凝膠中，使待測抗原在凝膠中自由擴散，與相應抗體結合形成沉淀環，沉淀環大小與抗原濃度呈正相關。,凝膠內沉淀雙向瓊脂擴散原理示意圖,Ab,Ag,模擬圖,染色瓊脂圖,1.抗原抗體雙向自由擴散 2.24小時出結果 3.呈現沉淀線或弧,三、免疫比濁技術原理,當可溶性抗原與相應抗體特異結合，二者比例合適時，在特殊的緩沖液中它們快速形成一定大小的抗原抗體復合物，使反應液體出現濁度。利用現代光學測量儀器對濁度進行測定從而檢測抗原含量。,檢測器,光源 透鏡 濾光片,平光線,

12、散,射,透射光,光波,比濁測定法原理示意圖,d,當復合物大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射， 在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光 的量代表復合物的量,當復合物小于入射波長時呈全透射， 透射與散射相當,三、免疫比濁技術原理,免疫比濁技術分類：,按光路,透射免疫比濁 散射免疫比濁,按測定時間,終點比濁 速率比濁,按增敏劑,無增敏 PEG增敏 膠乳增敏,透射比濁法和散射比濁法光路,檢測器A,檢測器B,IC,I0,I,I,透射比濁法,散射比濁法,透射免疫比濁法是在180角， 即在直射角度上測定光透射強度。,散射比濁法在光路的596角的方向上測量散射光強度。,單色器,透 射 比

13、 濁 計,散射 比濁計,散射比濁和透射比濁的區別示意圖,透射光 散射光,散射光,透射免疫比濁法（transmission turbidimetry,原理,抗原與抗體在一定緩沖液中形成IC，當光線透過反應溶液時，由于溶液內IC粒子對光線的反射和吸收，引起透射光減少，IC越多透射光越少，可用吸光度表示。,透射免疫比濁法,溶液中形成的復合物分子應足夠大(35-100nm) 溶液中形成的復合物分子要足夠多 控制抗原抗體反應的溫度和時間 加增敏劑，提高復合物形成速度，縮短檢測時間 應選擇親和力好、效價高的抗體，保證抗體過量 將標準品稀釋至少5個濃度測定，以吸光度值(A)為縱坐標，濃度為橫坐標，在半對數紙

14、上繪出標準曲線,反應要求,透射免疫比濁法,靈敏度較低。要求抗原抗體復合物分子應足夠大、足夠多，分子太小則入射光直接通過。加增敏劑。 直線光路，靈敏度有先天缺陷。設計散射比濁。 透射比濁是依據透射光減弱的原理來定量的，因此只能測定抗原抗體反應的第二階段，檢測仍需抗原抗體溫育反應時間，檢測時間較長。,缺陷,散射免疫比濁法,抗原抗體復合物對一定波長的光產生折射、偏轉，偏轉角度及散射光強度與復合物粒子的大小和量有關,原理,單色器,散射 比濁計,散射光,散射免疫比濁法,定時散射比濁分析,基本原理： 免疫沉淀反應和散射比濁分析結合之技術，反應分兩個階段，預反應階段和反應階段,保證抗原不過量的方法： 確保反

15、應體系抗體過量 對抗原過量進行閾值限定,時間 檢測分兩個,在預反應時段， 加小量樣本與 抗原/抗體反應， 測定第一次散 射光信號值,加全量樣本，約反應 2分鐘后，第二次測定散射光信號,信號峰值 計算機處理 轉換為樣 品濃度,預反應階段 5ul樣本,抗原過剩區,閾值,信號,反 應 階 段 45ul樣本,7.5秒,2分鐘,定時散射比濁反應曲線圖,抗原不過量 抗原過量,散射免疫比濁法,速率散射比濁分析,基本原理： 抗原抗體結合反應的一種動態測定法，適時檢測抗原抗體復合物形成的散射光信號。是測定抗原抗體結合反應的動態過程。 所謂速率，是在單位時間內抗原抗體結合形成復合物的速度。將各單位時間內形成復合物

16、的速率及測定的散射信號連接在一起，即是動態的速率比濁分析。 當儀器測定到某一時間內形成速率下降時，即出現速率峰，該峰值的高低，即代表所測抗原的量。 速率峰值一般在25秒時出現。 在反應介質中加入一定量的促凝劑，可加速抗原抗體復合物的形成，以減少反應時間。 速率法的優點：是快速、不需要減去樣本和試劑本底讀數，校正結果也較穩定。,抗原濃度遞增,散射光峰值,峰值信號與抗原抗體反應之間的關系圖,A,B,C,D,F,G,H,I,反應時間（秒）,0,60,85,散射率,抗體過量,抗原過量,第二峰值信號,粒子增強免疫比濁分析技術,基本原理 選擇一種大小適中，均勻一致的膠乳顆粒吸附或交聯抗體后，當遇到相應抗原

17、時，則發生聚集，單個膠乳顆粒在入射光波長之內，光線可透過。當兩個膠乳顆粒凝聚時，則使透射光減少，這種減少的程度與膠乳凝集成正比，當然也與抗原量成正比。,特點：變非均相反應為均相反應，靈敏度提高（ 0.1ng/mL ）； 聚乙烯、聚苯乙烯等高分子膠乳顆粒，直徑100200nM; 以物理吸附（多抗）或化學交聯（單抗）方式與抗體連接； 基于單抗膠乳免疫散射速率比濁技術的定量分析是發展方向。,光波,d,d 2d,當粒子直徑小于入射波長時呈全透射， 透射與散射相當,當粒子直徑大于入射光波的1/20時，形成不對稱前向散射， 在90o以前的角度測量散射光皆取得最佳效果，散射光的量 代表復合物的量,特定蛋白分

18、析儀簡介,以免疫比濁法原理設計的特定蛋白分析儀有1970年 Immuno Preciptin）、1977年BEHRING公司開發的BL（(Behring Laser Nephelometer)）、而后該公司又先后于1985年研制出BN（Behring Nephelometer Analysers）、1987年研制出TTS（Turbi Time System）和1988年開發出BN-100 （Behring Nephelometer 100），美國BECKMAN 公司也在80年代推出ARRAY360和ARRAY360E兩種型號的特定蛋白分析儀，德國寶靈曼公司也同時推出 KeySys 特定蛋白分析儀，最近20