.,1,微生物學實驗-2,實驗三培養基的制備實驗四高壓蒸汽滅菌,.,2,實驗三培養基的制備,實驗目的實驗內容實驗器材實驗方法注意事項實驗報告思考題,明確培養基的配置原理。通過對基礎培養基的配制，掌握配制培養基的一般方法和步驟。,實驗目的,實驗內容,1.牛肉膏蛋白胨培養基的制備2.高氏一號培養基的制備3.馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）的制備,1溶液或試劑：牛肉膏，蛋白胨，瓊脂，可溶性淀粉，葡萄糖，NaCl，KNO3，K2HPO43H2O，MgSO47H2O，FeSO47H2O，lmol/LNaOHlmol/LHCl。2儀器或其他用具：試管，三角瓶，燒杯，量筒，玻棒，培養基分裝器，天平，牛角匙，電爐，高壓蒸汽滅菌鍋，pH試紙（pH5.59.0），棉花，牛皮紙，記號筆，麻繩，紗布等。,實驗器材,牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g瓊脂15.020.0g水1000mlpH7.47.6,牛肉膏蛋白胨培養基配方,可溶性淀粉20.0gKNO31.0gNaCl0.5gK2HPO43H2O0.5gMgSO47H2O0.5gFeSO47H2O0.01g瓊脂15.020.0g水1000mlpH7.47.6,高氏一號培養基配方,馬鈴薯（去皮）200g葡萄糖20g瓊脂1520g水1000mlpH自然,PDA培養基的配方,制法：先將新鮮無病害的馬鈴薯洗凈，去皮后切成小薄片，稱200克，加水1000毫升，煮沸20分鐘后過濾，其濾汁為馬鈴薯煮汁，然后加瓊脂和葡萄糖煮溶，后補足水分至1000毫升，裝管（瓶）滅菌備用。,Na2HPO412H2O1.3gKH2PO43H2O0.36gNaCl0.5g脫脂牛奶100ml瓊脂15.020.0g水900mlpH7.2,脫脂乳培養基配方,1.稱量在上述燒杯中先加人少于所需要的水量，按培養基配方比例依次準確地稱取放入燒杯中用玻棒攪勻。2.溶化在石棉網上加熱使其溶解，并加水補足體積。3.調pH在未調pH前，先用pH試紙測量培養基的原始pH，如果偏酸，用滴管向培養基中逐滴加入lmolLNaOH，邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其pH，直至pH達7.6。反之，用lmolLHCl進行調節。,實驗方法,4.過濾用濾紙或多層紗布過濾。一般無特殊要求的情況下，這一步可以省去。5.分裝按實驗要求，可將配制的培養基分裝入試管內或三角燒瓶內。分裝試管，其裝量不超過管高的1/5，滅菌后制成斜面。,6.加塞在試管口或三角燒瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物進人培養基內而造成污染，并保證有良好的通氣性能。7.包扎在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕棉塞，其外再用繩子扎好。注明培養基名稱、組別、配制日期。8.滅菌將上述培養基以0.103MPa121，20min高壓蒸汽滅菌。,9.擺斜面將試管口端擱在玻棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜。,1.蛋白胨很易吸濕，在稱取時動作要迅速。另外，稱藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙用于一種藥品，或稱取一種藥品后，洗凈，擦干，再稱取另一藥品。2.在瓊脂溶化過程中，應控制火力，以免培養基因沸騰而溢出容器。配置培養基時，不可用銅或鐵鍋加熱熔化，以免離子進入培養基中，影響細菌生長。3.pH不要調過頭，以避免回調而影響培養基內各離子的濃度。4.分裝過程中，注意不要使培養基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。,注意事項,1培養基配好后，為什么必須立即滅菌？如何檢查滅菌后的培養基是無菌的？2在配制培養基的操作過程中應注意些什么問題？為什么？,思考題,.,16,實驗四高壓蒸汽滅菌,實驗目的實驗原理實驗器材實驗方法注意事項思考題,了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍。學習高壓蒸汽滅菌的操作方法。,實驗目的,高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加熱滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌器內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100的溫度，導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。,實驗原理,滅菌鍋內留有不同分量空氣時，壓力與溫度的關系,牛肉膏蛋白胨培養基高氏一號培養基PDA培養基培養皿、試管、三角瓶、移液管手提式高壓蒸汽滅菌鍋等,實驗器材,1.加水：將內層鍋取出，再向外層鍋內加入適量的水使水面與三角擱架相平為宜。,實驗方法,2.放回內層鍋，并裝入待滅菌物品。,3.加蓋，并將蓋上的排氣軟管插入內層鍋的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓。,4.通電加熱，待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。本實驗用0.1Mpa，121.5，20min滅菌。5.滅菌所需的時間到后，關閉電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表降至“0”時，打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。6.將取出的滅菌培養基放入37溫箱培養24h，經檢查若無雜菌生長，即可待用。,每組準備下列物品（滅菌）,1.培養基2瓶（500ml培養基用250ml三角瓶分裝）2.試管10支（內裝3ml培養基）3.無菌水1瓶（150ml三角瓶，內裝99ml水、玻璃珠）4.試管4支（內裝9ml水）5.培養皿2包（20個）,1切勿忘記加水，同時加水量不可過少，以防滅菌鍋燒干而引起炸裂事故。2壓力一定要降到“0”時，才能打開排氣閥，開蓋取物。否則就會因鍋內壓力突然