.,第十三章生化藥物和基因工程藥物分析概念,.,第一節概述生物藥物（biopharmaceutics或biopharmaceuticals）是利用生物體、生物組織或器官等成分，綜合運用生物學、生物化學等學科的原理與方法制得的天然生物活性物質以及人工合成或半合成的天然物質類似物。生物藥物主要包括生化藥物（biochemicaldrugs）、生物技術藥物（bio-technologydrugs)和生物制品（biologicalproducts)等。,.,生化藥物是從動物、植物及微生物等生物體分離純化制得的生化基本物質，以及用化學合成、微生物合成或現代生物技術制得的生命基本物質及其衍生物、降解物以及大分子的結構修飾物等，如氨基酸、多膚、蛋白質、酶、多糖、脂質、核昔酸類等。,.,生物技術是利用生物體或其組成部分發展產品的技術體系，用現代生物技術研制的藥物稱為生物技術藥物（或生物工程藥物）。,.,基因工程藥物（Geneticengineeringdrugs）：系指先確定對某種疾病具有預防和治療作用的蛋白質，然后將控制該蛋白合成過程的基因分離、純化或進行人工合成，利用重組DNA技術加以改造，最后將該基因放入可以大量生產的受體細胞中不斷繁殖，并能進行大規模生產具有預防和治療這種疾病的蛋白質，通過這種方法生產的新型藥物稱為基因工程藥物。,.,生物制品是應用普通的或以基因工程、細胞工程、蛋白質工程、發酵工程等生物技術獲得的微生物、細胞及各種動物和人源的組織和體液等生物材料制備，用于人類疾病預防、治療和診斷的藥品。,.,一生化藥物和基因工程藥物的定義1.生化藥物2.基因工程藥物,.,二、生化藥物和基因工程藥物的種類（一）生化藥物的種類1.氨基酸、多肽與蛋白質類藥物：單氨基酸、氨基酸衍生物和復合氨基酸類，消化道多肽、下丘腦多肽、腦多肽、激肽等；動、植物蛋白。2.酶類與輔酶類藥物：蛋白水解酶類、凝血酶及抗栓酶，輔酶Q10等。,.,3.多糖類藥物:肝素、硫酸軟骨素A和C;靈芝多糖、人參多糖、海藻多糖、多糖等類肝素。,.,4.脂質類藥物:多價不飽和脂肪酸（PUFA）、磷脂類、固醇類類等。5.核酸及其降解物和衍生物類藥物:RNA、DNA、多聚胞昔酸、琉基聚胞昔酸、ATP和cAMP等。,.,（二）基因工程藥物的種類基因工程DNA重組藥物主要成分為多膚或蛋白質類，大致可分為以下三大類：1.激素類及神經遞質類藥物：人生長激素釋放抑制因子（humansomatotin)，人胰島素（humaninsulin)，人生長激素（humangrowthhormone）,.,2.細胞因子類藥物：人干擾素（humaninterferons），人白細胞介素（humaninterleukina)，集落刺激因子（colony-stimulatingfactors，CSF)，促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）,.,3.酶類及凝血因子類藥物：單克隆抗體、疫苗、基因治療藥物、白介素、生長因子、內啡肽、反義藥物、人生長激素、促紅細胞生成素、腫瘤壞死因子等。,.,三、生化藥物和基因工程藥物的特點1.基因工程藥物具有細胞和組織特異性，形成受體一配體復合物；多數細胞因子具有多功能性，具有廣泛的藥理活性；細胞因子間存在復雜的相互作用，臨床使用有時需要幾種生長因子配合使用；具有低免疫活性。許多基因工程藥物是參與人體一些生理功能所必需的蛋白質，極微量產生顯著的效應。,.,2.分子量大大部分為蛋白質、多膚、多糖、核酸類等大分子的化合物，有的化學結構不確定，分析時需進行純度檢查和分子量的測定。對大分子的藥物而言，即使組分相同，由于分子量不同而產生不同的生理活性。3.結構確證難4.全過程的質量控制原材料、生產過程和產品的質量控制。,.,5.生物活性檢查生物檢定法6.安全性檢查例如熱原檢查、過敏試驗、異常毒性試驗、致突變試驗和生殖毒性試驗等。7.效價（含量）測定通過理化分析進行含量測定，但酶類需進行效價測定或酶活力測定，以表明其有效成分的生物活性。,.,8.生化藥物和基因工程藥物生物活性質量控制特點。生化藥物和甚因工程藥物生物活性質量控制對比,.,第二節質量檢驗的基本程序與方法一、鑒別試驗（一）理化鑒別法1.化學鑒別法利用藥物與某些試劑在一定條件下的呈色反應、沉淀反應等，生成具有顏色的產物或沉淀進行鑒別。,.,2.紫外分光光度法利用藥物中的共扼系統在紫外區有特征吸收用于鑒別。蛋白或多肽分子的最大吸收波長是固定的。,.,3.高效液相色譜法利用對照品溶液和供試品溶液色譜圖的保留時間和肽圖譜的一致性進行鑒別。凡有紫外吸收的物質均能在圖譜上顯示出來，一般要求純度要達95%以上。肽圖分析、氨基酸成分和序列分析合并研究，可作為蛋白質等天然產品精密比較的手段。,.,（二）生化鑒別法酶法、電泳法、樣品脫鹽后用等電點聚焦法測定（三）生物鑒別法利用生物體進行試驗來鑒別藥物，家兔驚厥試驗,.,二、雜質檢查（一）一般雜質檢查（二）特殊雜質檢查1.原料藥的純度分析多糖類，酶類藥物純度分析2.生產過程中雜質的檢查基因工程藥物的生產過程更為復雜，質量須全面控制。,.,三、安全性檢查（一）熱原檢查法和細菌內毒素檢查法（二）異常毒性試驗異常毒性試驗是用一定劑量的藥物按指定的操作方法和給藥途徑給予規定體重的某種試驗動物，觀察其急性毒性反應。反應的判斷以試驗動物死亡與否為終點。是限度試驗,.,（三）過敏試驗過敏試驗是檢查異性蛋白的試驗。（四）降壓物質試驗降壓物質試驗是指某些藥物中含有的能導致血壓降低的雜質，包括組胺、類組胺或其它導致血壓降低的物質。中國藥典采用貓（或狗）血壓法檢查藥物中所含有的降壓物質。,.,（五）無菌試驗無菌試驗是檢查藥品及敷料是否染有活菌的一種方法。,.,（六）基因工程藥物中可能雜質與污染物檢查基因工程藥物中可能的雜質有殘留DNA、宿主細胞蛋白質、內毒素、蛋白質突變體和蛋白質裂解物等。主要污染物有微生物、熱原和病毒等。主要檢查項目有外源性DNA、宿主細胞蛋白質、其它有關雜質和細菌內毒素檢查。（七）致突變試驗（八）生殖毒性試驗,.,四、含量（效價）測定生化藥物和基因工程藥物的含量表示方法通常有兩種，一種用百分含量表示，適用于結構明確的小分子藥物或經水解后變成小分子的藥物。另一種用生物效價或酶活力單位表示，適用于酶類和蛋白質類等藥物的測定。（一）含量測定：HPLC法、十二烷基硫酸鈉一聚丙烯酞胺凝膠電泳法（SDS-PAGE法）,.,（二）效價測定效價測定均采用國際或國家參考品，或經過國家檢定機構認可的參考品，以體內或體外法（細胞法）測定其生物學活性，并標明其活性單位。一般用免疫學方法測定的效價不能代替生物學效價，只能作為中間品的質量控制。在測定效價的同時，應測定蛋白質含量，計算出特異比活性，活性以單位數毫克蛋白（IU/mg）表示。,.,第三節常用定量分析方法及其應用一、理化分析法包括化學分析法（重量法、滴定分析法）、電化學分析法、光譜分析法（比色法、紫外分光光度法、熒光分光光度法）和色譜法（高效液相色譜法、灌注色譜法和高效毛細管電泳法）等。,.,（一）化學分析法1.重量法根據樣品中分離出的單質或化合物的重量測定所含成分的含量。根據被測組分分離方法的不同，可分為提取法、揮發法和沉淀法等。2.滴定分析法（二）電化學分析法（三）光譜分析法比色法、紫外分光光度法、熒光分光光度法,.,（四）色譜分析法1.高效液相色譜法（HPLC）具有在分離過程中不破壞樣品的特點，特別適合于對高沸點、大分子、強極性和熱穩定性差的生化藥物的分析。（1）反相高效液相色譜法（RP-HPLC）固定相：C8、C18烷基硅烷鍵合相流動相：甲醇、水或乙腈，紫外、熒光檢測器。,.,(2)高效離子交換色譜法（HPIEC)具有以下特點：1)根據相應的離子化程度對蛋白質、多肽進行分離2)鹽濃度梯度洗脫法3)柱效中等并具有較高質量的活性回收,.,（3）高效凝膠過濾色譜法（HPGFC）HPGFC可用于多肽和蛋白質等生物藥物的分離及其分子量的測定。,.,HPGFC具有如下特點：1)活性蛋白質可以回收2)在固定比例的水溶液中進行的分離3)是根據蛋白質或多肽在溶液中相應的有效粒徑而進行的分離。當蛋白質具有相同形狀（如球狀或纖維狀）時，通常可以根據分子量來預示組分的洗脫順序，故可用來測定蛋白類藥物的分子量。,.,2.灌注色譜法1.基本理論2.灌注色譜法主要用于基因工程藥物和其它大分子藥物的分離純化和分析。3.高效毛細管電泳法（HPCE）毛細管電泳法是根據帶電組分在管中由于其所帶電荷和分子量的大小，即荷質比不同產生不同的遷移速度而進行分離。,.,二、酶法酶法包括兩種類型：“酶活力測定法”；“酶分析法”。二者檢測的對象雖有所不同，但原理和方法都是以酶能專一而高效地催化案些化學反應為基礎，通過對酶反應速度的測定或生成物等濃度的測定而檢測相應物質的含量。,.,（一）酶活力測定法1.基本概念所謂酶活力是指酶催化一定化學反應的能力。酶活力測定實質上是測定一個被酶所催化的化學反應速度。酶反應速度可以用單位時間反應底物的減少或產物的增加來表示，酶反應速度越快所表示的酶活力越高。,.,國際理論化學和應用化學協會（IUPAC）和國際生物化學協會（IBU）推薦的酶單位定義：任何一種酶，系指在25以最適當的底物濃度、最適當的緩沖液離子強度以及最適當的pH等條件下，每分鐘能轉化一微摩爾底物的酶量定為一個活性單位（國際單位，IU）。,.,酶活力測定可采用物理法、化學法或酶分析法等。常用的方法有終點法、動力學法或反應速率法。,.,2.酶促反應的條件及影響因素選擇反應條件的基本要求是所有待測定的酶分子都應該正常地發揮其作用。確定反應條件時應考慮底物濃度、pH、溫度、輔助因子、空白和對照試驗等因素，使其都處于最適于酶發揮催化作用的水平。,.,3.測定方法測定方法有取樣測定和連續測定法。檢測方法：常用的有紫外一可見分光光度法和熒光分光光度法、旋光度法、酶偶聯測定法。,.,（二）酶分析法分析對象是酶的底物、輔酶活化劑、酶的抑制劑。1.動力學分析法2.總變量分析法本法又稱為平衡法或終點法。僅適用于底物的測定。,.,三、電泳法（一）電泳法的基本原理和分類在電解質溶液中，帶電粒子或離子在電場作用下于以不同的速度向其所帶電荷相反方向遷移的現象叫電泳。電泳分離是基于溶質在電場中的遷移速度不同而進行的分析方法幾，根據電泳的分離特點，電泳法可分為三大類：自由界面電泳、區帶電泳、高效毛細管電泳（HPCE)。,.,（二）常用電泳法的類型及其