.,1,經典載體構建流程,.,2,I載體構建流程,cDNA,提取mRNA,得到目的基因,RT,PCR,PCR產物純化,酶切目的基因和載體,純化酶切產物,連接,轉化,菌落PCR,挑取陽性克隆去測序,測序正確的搖菌提質粒,保菌,導入表達宿主測試表達情況,.,3,.,4,提取mRNA,如果可能，實驗室應辟出專門RNA操作區，離心機、移液槍、試劑等均應專用。RNA操作區應保持清潔，并定期進行消毒。.操作過程中應自始至終佩戴口罩和手套，并經常更換，以避免將手、臂上的細菌和真菌以及人體自身分泌的RNA酶帶入試管或污染用具。操作過程所用器材都要經過特殊處理。一次性槍頭、離心管等塑料制品采用連續滅菌兩次來滅活RNA酶。研缽180，4h。,.,5,RT,由于真核基因是由非編碼的內含子將ORF分隔開來的斷裂基因，若以基因組為模板PCR得到的片段克隆進載體，不能在原核細胞剪接內含子，也不能在非對象真核細胞中正確剪接表達。所以要克隆真核蛋白基因，需以不含內含子的連續編碼的mRNA為模板。PCR耐熱酶不能直接以mRNA為模板擴增，必須通過逆轉錄酶將mRNA逆轉錄為cDNA,再以cDNA為模板擴增目的基因。根據不同的目的，可有三類引物選擇,.,6,.,7,PCR得到目的基因,剛開始摸條件時，都會先做一個梯度PCR，選出最適條件。由于此步為獲取正確的目的基因，所以盡量避免PCR的突變格外重要。其中所采取的措施有：使用高保真酶、循環次數控制在300cycle左右、引物設計合理等。,重復13步2530輪,目的DNA片段擴增100萬倍以上,DNA雙螺旋,DNA單鏈與引物復性,DNA變性形成2條單鏈,子鏈延伸DNA加倍,.,8,.,9,PCR常出現的問題,1.假陽性：出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高2.出現非特異性擴增帶：PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致，或大或小，或者同時出現特異性擴增帶與非特異性擴增帶3.什么條帶都沒有,.,10,解決方法,假陽性的原因及解決方法：可能引物設計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現假陽性。需重新設計引物。還有就是靶序列或擴增產物的交叉污染。非特異性條帶的出現，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環次數過多有關。其次是酶的質和量，往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶則不出現，酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有：必要時重新設計引物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量，適當增加模板量，減少循環次數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93變性，65左右退火與延伸)。什么條帶都沒有，其原因可能是少加東西，酶已經失活了，或退火溫度太高等。解決方法：檢查是否少加東西了，換一下酶，降低退火溫度或做個梯度，摸一下條件。,.,11,PCR產物純化,倘若直接對PCR產物進行酶切，體系的雜蛋白、離子等會造成酶切困難或星活性，殘余的聚合酶也會填平粘性末端，造成克隆失敗。所以此步對整個分子克隆都至關重要，可適當用酚抽提、柱純化，必要的話也可以膠回收。,.,12,酶切目的基因和載體,.,13,酶切注意事項,兩種酶切的條件不同時，分別進行兩次酶切，切完一個純化后再切：溫度要求不同，先酶切低溫要求的，再酶切高溫要求的；若鹽濃度要求不同，先酶切低鹽濃度要求的，再酶切高鹽濃度要求的。只要其中一種酶需要添加BSA，則應在雙酶切反應體系中加入BSA。BSA不會影響任何內切酶的活性。注意將甘油的終濃度控制在10%以下，以避免出現星號活性，可通過增加反應體系的總體積的方法實現這一要求。,.,14,酶切常見問題,.,15,純化酶切產物,通常此步是必要的，可以對比未經純化的酶切產物進行連接后獲得的陽性克隆大大低于膠回收酶切產物連接所得陽性克隆。此步的目的是去除多余的片段，得到單一純化的目的基因與載體骨架，使之連接不受其他序列干擾。另外酶切后純化前，均需熱滅活，以免殘余的限制性內切酶干擾后續連接反應，降低陽性率。,.,16,回收前,回收后,酶切目的條帶,酶切載體帶,.,17,連接,催化DNA中相鄰的5磷酸基和3羥基末端之間形成磷酸二酯鍵，使DNA切口封合或使兩個DNA分子或片段連接。PCR產物最好進行切膠回收純化，以去除PCR產物中的非特異性片段和引物等雜質。切膠回收PCR產物時，避免DNA在紫外線下暴露時間過長從而形成嘧啶二聚體，造成PCR產物不能連接。凝膠電泳檢測純化后的PCR產物的濃度，優化連接反應時插入片段與載體摩爾比例為2:110:1（通常為3:1）。PCR產物及載體應盡量避免反復凍融，否則易造成3末端殘基的丟失。一般連接25度2小時，16或4度過夜。,.,18,.,19,轉化,基本步驟：（1）將100l感受態細胞于冰上解凍。（2）取5l連接產物加入到感受態細胞中，輕輕旋轉幾次以混勻內容物。在冰上放置30分鐘。（3）將管放入預加溫到42的水浴中，熱激90秒。快速將管轉移到冰浴中，使細胞冷卻12分鐘。（4）每管中加700lLB培養基，37振蕩培養1小時，進行復蘇。（5）室溫4,000rpm離心5分鐘，棄去上清后，用剩余100l培養基重懸細胞并涂布到含抗性的LB瓊脂平板表面。注意：細胞用量應根據連接效率和感受態細胞的效率進行調整。（6）將平板置于室溫直至液體被吸收。（7）倒置平皿，于37培養，1216小時后可出現菌落。,.,20,菌落PCR,此步以適應現代分子生物學實驗室批量工作的高效性，通常只需挑半個菌落直接作為模板進行常規PCR就能初步檢測陽性克隆。初步檢菌的陽性克隆接種提質粒，供后續酶切分析以及測序檢測。,.,21,酶切檢測陽性克隆,將菌檢的陽性克隆所得質粒進行酶切分析，獲得預期條帶的即為陽性克隆。要進一步確認是否有因PCR所帶來的點突變，插入，缺失等改變目的基因的序列，還需要對陽性克隆進行測序。選用的酶通常為設計引物的兩個酶，因為它能完整切下ORF和載體骨架，可以通過條帶大小以判斷陽性克隆。,.,22,挑取陽性克隆去測序,測序是構建載體的最