密級: 論文編號： 中國農業科學院 學位論文 導入外源 因質粒 對犢牛生長發育的影響 士 研 究 生：張利宇 指 導 教 師：孫寶忠 副研究員 申請學位類別：農學碩士 專 業： 動物遺傳育種與繁殖 研 究 方 向： 畜禽種質與產品質量 培 養 單 位： 中國農業科學院畜牧研究所 提交日期 2006 年 6 月 li 006 獨 創 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經發表或撰寫過的研究成果， 也不包含為獲得中國農業科學院或其它教育機構的學位或證書而使用過的材料。 與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關于論文使用授權的聲明 本人完全了解中國農業科學院有關保留、使用學位論文的規定，即：中國農業科學院有權保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農業科學院可以用不同方式在不同媒體上發表、傳播學位論文的全部或部分內容。 (保密的學位論文在解密后應遵守此協議) 研究生簽名： 時間： 年 月 日 導師簽名： 時間： 年 月 日 縮略語英漢對照表 縮略語 英文 中文 長激素釋放因子 長激素 長抑素 胰島素樣因子合酶鏈式反應 液中尿素氮 油三酯 萄糖 均日增重 F/G 重比 SS 長抑素基因工程活載體苗 d kg 克 分轉數 鐘 g I 摘 要 本論文主要研究了導入外源液生化指標和激素水平的影響，以及導入外源 因質粒對生長抑素基因工程活載體苗（）促進犢牛生長性能和激素水平的影響。 試驗結果表明：導入不同劑量 因質粒，整個飼養試驗期中各處理組的生產性能都好于對照組。3理組的日增重分別比對照組高 （ P導入不同劑量 因質粒，各處理組的尿素氮、甘油三酯與對照組相比有下降的趨勢（,. RF to ，但是在注射后 30 天再進行測定時發現各處理組同對照比相比都不同程度的差異，有些處理組的差異達到了顯著水平。 （1 ）尿素氮的水平各處理組同對照組相比呈下降趨勢，我們從表中 30 天時尿素氮同對照相比可以看到這一點， 6下降最多，同對照組相比達到了顯著水平（，但是從圖 3我們可以看到他有一個下降的趨勢。 60 天的測定結果我們現， 3同對照組相比已沒有差異， 6的水平仍比對照組水平低，但已經沒有顯著差異，此時 9尿素氮水平比 6要低，同對照組相比達到了顯著水平（重比降低 (以上結果表明注射 因質粒可以加快動物生長，提高飼料利用率。大量免疫化學證明，含 細胞位于弓狀核，其纖維延伸到正中隆起，國農業科學院碩士學位論文 第三章 單獨注射 因質粒對犢牛生長發育影響 被分泌到門脈系統，經血液攜帶到腺垂體刺激生長激素分泌細胞釋放 驗還表明 促進成，其機理可能是加強了 因的轉錄和 生成。垂體前葉存在 體， 介導刺激了 放，促使肝臟產生調節生長的物質。而 進動物生長是通過 現的。過與受體結合，誘導肝細胞產生 直接作用于動物體內的各種組織，促進蛋白質的合成，促進細胞增殖，從而促進肌肉、內臟和骨骼的生長。本試驗通過肌肉注射 因，因在體細胞內不斷表達、釋放，增加了血液中 度，刺激了 平的提高。進而引起一系列的生理生化反應，提高了的動物生產性能。 基因治療上的研究表明，物的使用劑量直接影響作用的效果( 1997). 990)第一次將質粒 作肌肉注射時就曾注意到了劑量一效應關系的存在。10 倍量 0 倍的增加，從注射 10到 33g 蟲熒光素酶到注射100到 320g 蟲熒光素酶。這說明注射 因質粒的量越多，其相應在體內表達的量越多。 是不是注射劑量越大犢牛的生產性能就越好呢？我們從本試驗也觀察到，并非注射劑量最高的 9理組取得了最好增重效果，我們從圖 3圖 3可以直觀地看到 6理組取得了全期的最好效果，不同試驗組的效果由好到差的順序為 6青燕(2002)也發現了相似的規律，她使用 注射劑量，試驗豬全期(6斤)的日增重和飼料轉化率還能有明顯的改善，使用 注)的注射劑量后這種改善效果已經不能觀察到了。同樣王立志也觀察到注射高注射劑量 6 9因質粒的處理組沒有比 3注射劑量的效果好，甚至比對照組的效果還要差。張勇(2001) ，辜玉紅(2001)也有相同的結果。但從表 3可以看出，不同階段其效果也是不同的，尤其是 6理組和 9理組的比較可以看到，第一個月 6表現效果最好，9在第二個月表現效果最好。產生這種效果的原因與身體內各激素的變化有關系。我們知道動物的生長受內源激素的作用和調控，各種激素間通過促進、協同、抑制等作用相互聯系，交織成網，以維持動物生長的相對穩定。 為效應因子，直接發揮著促進生長的作用，而 為高位調節因子，是通過調控 而達到促生長的作用。肌肉注射高劑量的 因質粒，一方面使外源 肌肉組織中獲得大量表達，促進內源 合成，另一方面，肌肉組織中的外源 放進入血液可以使血液 濃度升高，通過負反饋作用對內源 合成和分泌產生抑制，同時可引起下丘腦 泌的增加，對動物體內 合成與分泌以及動物的消化系統產生廣泛的抑制作用。當外源生長激素釋放因子表達量引起生長激素的增加的濃度在機體生理允許范圍內時，此時 因質粒的注射劑量表現的為正效應即日增重增加，飼料轉化率提高。但是當外源生長激素釋放因子的表達量繼續增加時，就會引起生長激素的量繼續增加，當生長激素增加到的濃度已經超過了機體的允許范圍時，就會引發生長抑素的大量分泌，從而抑制內源性生長激素釋放因子的釋放和生長激素對生長激素釋放因子的敏感性，從而降低生長激素的分泌量，此時過量的 因質粒的表現就是負相應，即日增重和飼料轉化率降低，甚至低于對照組的水平。但是隨著 因質粒的消耗，機體血容量的增加，可能會解除生長抑素對生長激素釋放因子和生長激素的抑制，使得 因質粒又發揮其促生長的作用。本試驗發現 6在 2 個月的飼養期中的表現效果最好，但是如果隨著飼養時間的增加，9就會表現出后效應。具體效果還需要進一步的試驗驗證。 30 中國農業科學院碩士學位論文 第三章 單獨注射 因質粒對犢牛生長發育影響 有研究表明，給豬直接注射 使豬肝臟（，1985；，1972） 、腎臟和心臟（，1985；，1993） 、肺（，1990）的重量增加，但是，我們在試驗中沒有發現類似的現象，在 2 個月的飼養其中，注射 因質粒沒有對犢牛的體尺和器官占體重的比例造成顯著性的影響，這可能由于生長激素和生長激素釋放因子的半衰期非常短只有 10接注射 導致體內生長激素的濃度瞬間升高，從而造成內臟器官的變化。而 因質粒進入到體內后是一個緩慢釋放的過程，是漸進式表達。在注射劑量不是太過量的情況下，對內臟器官就不會有顯著的影響。 入 因質粒時間與效應關系 質粒 過肌肉注射入動物體內以后，目的基因需要經過一段時間才可能進行表達生成白，而達到最大表達效率的時間則會更長。這種時間跨度可因目的基因的種類、質粒載體、注射方式的不同而不同。(1990) 將含熒光素酶基因的 粒注射入老鼠的骨骼肌，2天后能在骨骼肌中檢測到熒光素酶的活性， 15 天后酶的活性達到最高。朱小君等(1994) 采用縫線法將 因質粒轉入大鼠的股四頭肌，2 天后 因開始有明顯的表達，7 天時達到最高峰。鄭潤等(1998) 將含人生長激素的重組真核表達質粒直接注射入小鼠的后肢肌肉， 20 天后表達水平達到最高。 本試驗發現生長激素水平在 15 天左右時，各處理組都產生了一個高峰說明 15 天附近時質粒的表達量，達到了最大值，隨著時間的推移 3在 45 天左右時生長激素的量與對照組已沒有差異，說明此時 3的質粒已經耗盡或量已經非常少。在試驗結束時， 6的質粒還有促進生長激素分泌增加的作用但是作用已經非常微弱。而 9在試驗結束前還有很強的促生長激素分泌的作用，由于試驗時間的限制還有待進一步考察。 因質粒對激素水平變化的影響 注射生長激素釋放因子基因質粒可以使其在動物體內表達 白，這與（，1999；張永亮等， 2000；張勇 2001；王立志 2002）研究一致，研究認為：注射 因質粒后血液中 白的提高是由于其進入體內后進行表達的結果。張永亮等（2000）給大鼠肌肉注射 因質粒 30 天后用 測到質粒及其表達得到的陽性結果，同時對注射處肌肉進行免疫組化分析可檢測到 白，說明質粒在大鼠肌肉內存在和表達。 由于試驗的限制，本試驗并沒有測定與此密切相關的所有激素，而是選取了生長激素和生長抑素兩種激素來檢測表達的情況，我們知道，生長激素釋放因子和生長抑素在高位控制低位的生長激素和 分泌。生長激素釋放因子分泌量的增加會引起生長激素和 增加，但是同時也會引發生長抑素分泌的增加來平衡生長激素的濃度，所以可以通過生長激素和生長抑素的濃度變化來觀察其他幾個重要激素的變化。 通過本試驗可以觀察到，隨著注射量的增加，生長激素的分泌量在 6劑量處有一個高峰，也就是說在 6下的注射劑量生長激素的分泌量在增加，當注射劑量超過 6，生長激素的分泌量開始有所下降。伴隨著生長抑素的變化我們發現， 6注射劑量已輕微引發生長抑素分泌的增加，隨著量的繼續加大 9理組生長抑素的量已經顯著增加（+6組, 而第二個月情況有所變化各處理組的效果為 +6+3。第二個月時 +6的效果要好于 +3。 因質粒與 共同使用對犢牛血液激素水平的影響 表 4牛激素水平變化 射后時間 SS g +62 H +3長抑素 (ng/60d pg/60d 圖 4以看出：不同的處理組生長激素在注射后 15 天左右都有由升高的趨勢圖 4因質粒與 共同作用對生長激素的影響 of of RF S H d）GH（ng/因質粒與 共同作用對生長抑素的影響 of of RF S S 0607080901001100 15304560注射后天數（d）SS（pg/國農業科學院碩士學位論文 第四章 因質粒對 促進犢牛生長效果的影響 其中，圖 4出：注射后 30 的時間內 +3 論 分泌是脈沖式的，主要受 生長激素抑制素（也稱生長抑素 兩種+3升高的幅度最大同單獨注射 組相比提高了 達到了極顯著水平（P+6生長激素增加幅度沒有 +3大, 但同 ，到 30 天時可以看到 組生長激素水平在增加，+3在緩慢下降，而 下降幅度較大生長激素水平同 組的水平相當。 45 天時 組的激素水平還在緩慢上升，此時 +3的水平與 組相當，而 +6此時生長激素水平又達到了一個小高峰，到 60 天時三個處理組的激素水平相當，但同注射前的激素水平相比較，各處理組的水平仍然高于試驗前水平 生長抑素的變化可以從由表 4素的水平一直在緩慢下降，過了 30階段，生長抑素的水平穩定在 62pg/右。而對于 +6，生長抑素在注射后 15 天內有緩慢上升趨勢， 30 天時有一個高峰，此后生長抑素開始下降，最終下降到同另外兩個處理組相近。 激素的共同調節。 泌合成的促進作用是與 抑制 泌的作用并存的，共同維持著 周期性脈沖分泌（，1984） 。此外，離體試驗結果表明，抑制 自發分泌，對 激垂體 泌有明顯拮抗作用。體內試驗結果也證明：下丘腦提取的 合成的 可抑制體內 自發分泌。 主動和被動免疫均可使 平明顯提高（， 1979）。 血清可使 基礎值明顯上升，而脈沖式分泌未受影響，并增加 值時的反應（C,1985 ）。 下丘腦強直分泌到垂體門脈血液中，這兩種激素的周期為 3 4h，相差約 180，也就是說，兩者交替節律式分泌，調節著 脈沖式分泌。本試驗中的 因質粒能夠增加犢牛 濃度，而 可以起到中和體內部分生長抑素的作用。通過二者的共同使用我們發現，在生長抑素注射量一定的時候，注射不同劑量的 因質粒在一定范圍內可以進一步改善犢牛的生長性能。在本試驗中 +3同單獨注射 相比取得了較好的增重效果。+6效果相對較差，這與上一個試驗相反。說明 與 3因質粒共同使用促進了動物生長性能的改善，具有協同作用，從生長激素和生長抑素的變化量我們以可以看出， +3從生長激素的基礎水平和峰值分泌量的增加提高了生長激素在體內的整體水平，而此時的水平正好在機體的生理允許范圍之內。而 與 6因質粒共同使用沒有超過 +3的效果，反而還有所下降，主要由于兩者共同作用所產生的生長激素的量已經超過了機體的允許范圍，引起了機體的負反饋，雖然 可以中和部分生長抑素，但其中和的能力不是無限的，這樣就會變現出生長抑素的濃度大量增加，此時二者的作用就不是協同作用，而是變成了拮抗作用，即兩者都不發揮作用了，或者說作用相抵消了，外部的表現生長變慢，生長性能下降。而這種拮抗也并總是存在，我們在圖 4以看到在 45 天左右時 +6的生長激素的分泌量有一個高峰，出現這種現象的原因有可能是，此時隨著 因質粒的消耗其表達生成的 隨之降低，解除了負反饋。同時由于 的作用使得生長抑素的量明顯降低，這一點由圖 4可以看出。所以生長激素的量有一定的上升。隨著質粒的消耗生長激素升高主要是由 的作用帶37 中國農業科學院碩士學位論文 第四章 因質粒對 促進犢牛生長效果的影響 來的。 論 （1 ） 因質粒同 共同作用可以起到進一步提高犢牛生長性能的作用，其中 +3（蝕斑單位為 5107g）不變時，注射 3單獨使用 的日增重增加 料重比降低 （2 ）在 注射劑量不變的情況下， 粒注射量達到 6上劑量時，兩者使用效果降低。 （3 ）在 射 6牛生長激素水平已經開始下降；生長抑素的水平隨著因質粒注射量的增加而升高。38 中國農業科學院碩士學位論文 第五章 總結論 第五章 總結論 1. 在兩個月的飼養期中，單獨注射 3量的因質粒都能提高犢牛的日增重和降低料重比，其中注射劑量 6于或低于 6與斑單位為 5107g）共同使用時， 3因質粒的注射劑量由于與發生拮抗而導致犢牛生產性能下降；本試驗中兩種劑量的因質粒與2. 因質粒注射到犢牛半肌腱部位，15 天左右 因質粒表達達到高峰。 3. 單獨注射 因質粒以及 因質粒與 共同注射都可以提高犢牛生長激素的水平，其中單獨注射 6因質粒提高幅度最大是對照組的 （P，因質粒與 共同使用， 3S 苗組提高幅度最大，是單獨注射 的 。 4. 生長抑素的分泌量隨著 因注射劑量的增加而升高。 5. 注射 因質粒可以降低血液中尿素氮和甘油三酯的水平，提高血中葡萄糖的濃度，最終體現為蛋白質合成作用的加強，脂肪分解加快，犢牛的瘦肉率提高。 6. 注射 6因質粒時，犢牛體斜長、胸圍和鬐甲高增加的幅度最大。 7. 注射 因質粒對犢牛的器官的比例沒有顯著影響。 39 中國農業科學院碩士學位論文 參考文獻 參考文獻 1. 白忠斌，張永亮，田寶磊等. 原生質體介導的外源性 因對小鼠增重的研究. 動物醫學進展，2003 ，24（ 5）： 76. 陳主初. 一種有效的基因轉移技術J. 湖南醫科大學學報，1990 ，（ 2）： 189. 鄧柏林，張永亮，籍玉川，張維. 生長激素釋放因子在動物骨骼及的表達 003 ， 23（1 ）78. 范志勇，王康寧. 豬生長激素釋放因子基因對早期斷奶仔豬生產性能免疫功能及消化道發育的影響. 中國畜牧雜志,2003 ，39 （3 ） 16. 馮立文，張永亮，基因改造，J 中國獸醫學報，1998， 18（6 ）：520. 因質粒對豬生產性能，胴體品質及血液生化指標影響的研究. 四川農業大學碩士學位論文. 7. 韓正康，等. 生長抑素抑制劑畜牧獸醫學報，1992， 23(4):314 8. 冀一倫主編，實用養牛科學 國農業出版社，2001 9. 姜禮勝，陳杰，陳偉華. 半胱胺對生長豬生長激素脈沖釋放及有關代謝激素的影響. 中國獸醫學報，2002 ，22: 2620. 蔣洪茂. 優質牛肉生產技術. 北京 : 中國農業出版社 ,1995,471. 梁建清. 生長激素的作用與應用. 四川生理科學雜志 ，2002 ， 24:3912. 歐宇，歐洲小牛肉生產現狀. 22（ 6）： 44 13. 任曉慧，張永亮，劉松財等. 微球包裹 小鼠肌肉組織的表達及對生長的影響. 生物工程學報，2004 ，20 （4 ）：6154. 沈同，王鏡巖. 生物化學第二版下冊. 北京：高等教育出版社，1981， 1275. 施婭雪，何天源. 兔骨骼肌直接注射質粒 生物效應. 外科理論與實踐，1998， 228. 16. 孫遜，朱尚權. 生長激素的結構與功能. 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