課題1菊花的組織培養,組織培養是指在人工培養基上，離體培養植物的器官、組織、細胞和原生質體，并使其生長、增殖、分化以及再生植株的技術。,一、基礎知識,1、植物的組織培養,（1）細胞的分化,概念：,在個體發育中，相同細胞的后代在形態、結構、生理功能上發生穩定性差異的過程.,過程：,如：受精卵增殖、生長、分化形成組織、器官、系統.,特點：,B.穩定性：,C.全能性：,A.持久性：,是一種持久性的變化，它發生在生物體的整個生命過程中,在胚胎期達到最大限度.,細胞分化是穩定的，一般是不可逆轉的.,已分化的細胞，仍具有發育的潛能.,原因：,基因在特定的時間和空間條件下的選擇性表達的結果.,結果：,形成不同的細胞和組織,（2）細胞的全能性,定義：,生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特性.,原理：,生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質，都有發育成為完整個體所必需的全部基因.,高度特化的動物細胞，從整個細胞來說，全能性受到限制。但它的細胞核仍然保持著全能性，這是因為細胞核內含有該物種遺傳性所需要的遺傳物質.,已分化的植物細胞，仍具有全能性.,實例,受精卵生殖細胞體細胞,全能性的比較:,（3）植物組織培養,細胞離體,必要條件：,一定的營養物質、激素和其他外界條件,原理:,細胞的全能性,A.外植體：從活植物體上切下進行培養的那部分細胞、組織或器官.,相關概念:,B.脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產生愈傷組織的過程，又稱去分化。,C.再分化：脫分化產生的愈傷組織在培養過程中重新分化根或芽等器官的過程,D.愈傷組織:細胞排列疏松而無規則,是高度液泡化的、成無定形狀態的薄壁細胞.,人參的愈傷組織,菠蘿的愈傷組織,2、影響植物組織培養的因素,（1）植物材料的選擇,煙草和胡蘿卜的組織培養較為容易,枸杞愈傷組織的芽誘導比較難,同一植物材料的年齡、保存時間的長短會影響實驗結果,菊花的組織培養一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側枝,（2）離體的植物組織和細胞對營養、環境等條件的要求相對特殊，需配置不同的培養基,MS培養基主要成分包括：,A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等,C、有機物、植物激素,MS固體培養基成分及比例,討論：你能說出各種營養物質的作用嗎？同專題2中微生物培養基的配方相比，MS培養基的配方有哪些明顯的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持培養基的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產生的特殊營養需求。微生物培養基以有機營養為主。與微生物的培養不同，MS培養基則需提供大量無機營養，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,常用的植物激素：生長素、細胞分裂素和赤霉素,生長素類：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,細胞分裂素類：,激動素（KT）、6芐基嘌呤（6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素類：,赤霉酸（GA3）,（3）植物激素的影響,生長素和細胞分裂素作用,植物中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現加強的趨勢,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促進愈傷組織生長,生長素和細胞分裂素同時使用，用量的比例對植物細胞發育方向的影響,（4）pH、溫度、光照,pH控制在5.8左右，溫度控制在1822。C,每日用日光燈照射12h.,3、植物組織培養過程:,離體組織或細胞,植物體,細胞分裂素生長素,愈傷組織,芽,根,細胞分裂素生長素,細胞分裂素生長素,植物細胞培養,不需要光?,需要光,植物組織培養的過程,離體的植物組織或細胞,愈傷組織,根和芽,完整的植物體,脫分化,再分化,(1)、培育無病毒植株,(2)、培養紫草愈傷組織,提取紫草素（治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）,(4)、基因工程中亦需用到植物組織培養的方法,4、植物組織培養的應用：,(3)、誘導離體的植物組織形成具有生根發芽能力的胚狀結構，包裹上人造種皮，制成人工種子，可以解決有些作物品種繁殖能力差，結子困難或發芽率低等問題.,人工種子,同常規的無性繁殖方法相比，組織培養快速繁殖法主要具有以下優點：（1）快速。采用常規的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生產幾株或幾十株，但用組織培養的方法則每年可以繁殖出幾萬甚至數百萬的小植株。（2）周年生產。花卉組織培養快速繁殖是在實驗室中進行，因條件可控，所以不受季節限制，可以全年進行連續生產。而常規的無性繁殖則受季節限制，只能在花卉生長季節進行繁殖。（3）經濟效益高。花卉組織培養快速繁殖所需要的空間小，在一個200平方米的培養室內一年可生產試管苗上百萬株。如按每株1元計算，每年產值上百萬元。（4）以組織培養繁殖的種苗與母株有著相同的遺傳基因。所以使用這項技術可讓優良的品種不斷地延續。,組織培養與常規繁殖相比優點眾多,二、實驗操作,（一）制備MS固體培養基,MS培養基包括20多種營養成分，實驗室一般使用4。C保存配制好的培養基母液來制備.,1、配置各種母液,無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存.,激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可按1mg/ml的質量濃度單獨配制成母液.,用母液配制培養基時，需要根據各種母液的濃縮倍數，計算用量.,2、配置培養基,分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml.,配制培養液,調PH,培養基的分裝,由于菊花的莖段的組織培養比較容易，因此不必添加植物激素.,3、滅菌,分裝好的培養基連同其他器械一起進行高壓蒸汽滅菌.,1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝.,（二）外植體消毒,2、消毒,流水沖洗,菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右.,酒精處理,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數為70的酒精中搖動23次，持續67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗.,消毒液處理,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質量分數為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液.,（三）接種,污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，接種室消毒是至關重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘,1、接種室消毒,2、無菌操作要求,操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。,3、材料的切取和接種,4、接種注意事項,每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分數為75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種.,外植體在培養基中要分布均勻，放置外植體數量根據錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜34塊，菊的莖或葉68塊，也不要太少，以充分利用培養基中的營養成分和光照條件.,插入時應注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養基利于吸收水分和養分.,思考：你打算做幾組重復？你打算設置對照實驗嗎？,答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復。設置對照實驗可以取用一個經過滅菌的裝有培養基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養，用以說明培養基制作合格，沒有被雜菌污染。,（四）培養,1、愈傷組織的培養,從接種外植體到出現愈傷組織需經過2周時間。2周之內可以看到外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養愈傷組織時，恒溫箱的門應該關閉不必見光，因為在無光條件下愈傷組織長的更快。2周后，培養基成分接近耗盡，必須更換培養基，進行繼代培養.,繼代培養所用的培養基與培養愈傷組織的相同，在嚴格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養基上。愈傷組織的繼代培養一代為20d。如果延長時間，培養基中營養物質減少，外植體會分泌有毒物質，造成自身中毒。如果愈傷組織長到直徑為11.5cm時，就可以進行試管苗培養，否則還需進行第二代繼代培養.,2、愈傷組織的繼代培養,在愈傷組織繼代培養期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉為綠色.,3、試管苗的培養,當愈傷組織長到一定大小后，可以更換培養基，進行試管苗的見光培養.,（五）移栽,移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養瓶的封口膜，讓試管苗在培養間生長幾日.,1、打開封口膜,2、清洗轉移,用流水清洗根部的培養基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環境下生活一段時間.,（六）栽培,3、移栽,珍珠巖：固體基質型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培.,幼苗長壯后，移栽到土壤中.,幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花.,三、課題延伸,1、一般來說，容易進行無性繁殖的植物，也容易進行組織培養.,2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季.,本課題內容小結,菊花組織培養,基礎知識,實驗操作,植物體的組織培養,影響組織培養的因素,細胞分化細胞全能性組織培養過程,營養激素環境條件,MS固體培養基制備外植體消毒接種培養移栽栽培,作業：P361、在植物組織培養過程中，為什么要進行一系列的消毒、滅菌，并且要求無菌操作。2、在選取菊花莖段是，為什么要選取生長旺盛的嫩枝？,外植體的生理狀態是成功進行組織培養的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導脫分化和再分化。,植物組織培養所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養條件的要求較高。用于植物組織培養的培養基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。而培養物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。,21.下圖是植物組織培養的簡略表示。據此回答：,練習1、下圖是植物組織培養的簡略表示。據此回答：（1）表示_，它能被培養成為的根本原因是_。（2）表示_，它與相比分化程度_，全能性_.（3）若想制成人工種子，應選用_。（4）若是花藥，則是_，繼續對其使用_處理可獲得_正常植株，該過程稱為_。（5）若是胡蘿卜根尖細胞，則培養成的葉片的顏色為_，這說明_。（6）若利用此項技術制造治療燙傷、割傷的藥物紫草素，培養將進行到_。,答案：（1）離體的植物組織或器官植物細胞具有全能性（2）愈傷組織低高（3）（4）單倍體植株秋水仙素純合體單倍體育種（5）綠色含有表達葉綠體的基因（6）,練習2、基因型為AaBb的水稻（含24條染色體）的花藥通過無菌操作接入試管后，在一定條件下形成試管苗，問：（1）愈傷組織是花粉細胞不斷分裂后形成的不規則的細胞團