課題1菊花的組織培養(yǎng),組織培養(yǎng)是指在人工培養(yǎng)基上，離體培養(yǎng)植物的器官、組織、細胞和原生質(zhì)體，并使其生長、增殖、分化以及再生植株的技術(shù)。,一、基礎(chǔ)知識,1、植物的組織培養(yǎng),（1）細胞的分化,概念：,在個體發(fā)育中，相同細胞的后代在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理功能上發(fā)生穩(wěn)定性差異的過程.,過程：,如：受精卵增殖、生長、分化形成組織、器官、系統(tǒng).,特點：,B.穩(wěn)定性：,C.全能性：,A.持久性：,是一種持久性的變化，它發(fā)生在生物體的整個生命過程中,在胚胎期達到最大限度.,細胞分化是穩(wěn)定的，一般是不可逆轉(zhuǎn)的.,已分化的細胞，仍具有發(fā)育的潛能.,原因：,基因在特定的時間和空間條件下的選擇性表達的結(jié)果.,結(jié)果：,形成不同的細胞和組織,（2）細胞的全能性,定義：,生物體的細胞具有使后代細胞形成完整個體的潛能的特性.,原理：,生物體的每一個細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)，都有發(fā)育成為完整個體所必需的全部基因.,高度特化的動物細胞，從整個細胞來說，全能性受到限制。但它的細胞核仍然保持著全能性，這是因為細胞核內(nèi)含有該物種遺傳性所需要的遺傳物質(zhì).,已分化的植物細胞，仍具有全能性.,實例,受精卵生殖細胞體細胞,全能性的比較:,（3）植物組織培養(yǎng),細胞離體,必要條件：,一定的營養(yǎng)物質(zhì)、激素和其他外界條件,原理:,細胞的全能性,A.外植體：從活植物體上切下進行培養(yǎng)的那部分細胞、組織或器官.,相關(guān)概念:,B.脫分化：由高度分化的植物器官、組織或細胞產(chǎn)生愈傷組織的過程，又稱去分化。,C.再分化：脫分化產(chǎn)生的愈傷組織在培養(yǎng)過程中重新分化根或芽等器官的過程,D.愈傷組織:細胞排列疏松而無規(guī)則,是高度液泡化的、成無定形狀態(tài)的薄壁細胞.,人參的愈傷組織,菠蘿的愈傷組織,2、影響植物組織培養(yǎng)的因素,（1）植物材料的選擇,煙草和胡蘿卜的組織培養(yǎng)較為容易,枸杞愈傷組織的芽誘導比較難,同一植物材料的年齡、保存時間的長短會影響實驗結(jié)果,菊花的組織培養(yǎng)一般選擇未開花植株的莖上部新萌生的側(cè)枝,（2）離體的植物組織和細胞對營養(yǎng)、環(huán)境等條件的要求相對特殊，需配置不同的培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基主要成分包括：,A、大量元素:N、P、S、K、Ca、Mg等,B、微量元素:B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co等,C、有機物、植物激素,MS固體培養(yǎng)基成分及比例,討論：你能說出各種營養(yǎng)物質(zhì)的作用嗎？同專題2中微生物培養(yǎng)基的配方相比，MS培養(yǎng)基的配方有哪些明顯的不同？,答：微量元素和大量元素提供植物細胞生活所必需的無機鹽；蔗糖提供碳源，同時能夠維持培養(yǎng)基的滲透壓；甘氨酸、維生素等物質(zhì)主要是為了滿足離體植物細胞在正常代謝途徑受到一定影響后所產(chǎn)生的特殊營養(yǎng)需求。微生物培養(yǎng)基以有機營養(yǎng)為主。與微生物的培養(yǎng)不同，MS培養(yǎng)基則需提供大量無機營養(yǎng)，無機鹽混合物包括植物生長必須的大量元素和微量元素兩大類。,常用的植物激素：生長素、細胞分裂素和赤霉素,生長素類：,2，4二氯苯氧乙酸（2，4D）、吲哚乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）,細胞分裂素類：,激動素（KT）、6芐基嘌呤（6BA）、玉米素（ZT）,赤霉素類：,赤霉酸（GA3）,（3）植物激素的影響,生長素和細胞分裂素作用,植物中生長素和細胞分裂素是啟動細胞分裂、脫分化和再分化的關(guān)鍵性激素。在生長素存在的情況下，細胞分裂素的作用呈現(xiàn)加強的趨勢,有利于根的分化,有利于芽的分化，抑制根的分化,促進愈傷組織生長,生長素和細胞分裂素同時使用，用量的比例對植物細胞發(fā)育方向的影響,（4）pH、溫度、光照,pH控制在5.8左右，溫度控制在1822。C,每日用日光燈照射12h.,3、植物組織培養(yǎng)過程:,離體組織或細胞,植物體,細胞分裂素生長素,愈傷組織,芽,根,細胞分裂素生長素,細胞分裂素生長素,植物細胞培養(yǎng),不需要光?,需要光,植物組織培養(yǎng)的過程,離體的植物組織或細胞,愈傷組織,根和芽,完整的植物體,脫分化,再分化,(1)、培育無病毒植株,(2)、培養(yǎng)紫草愈傷組織,提取紫草素（治療燙傷和割傷的藥物以及染料和化妝品的原料）,(4)、基因工程中亦需用到植物組織培養(yǎng)的方法,4、植物組織培養(yǎng)的應用：,(3)、誘導離體的植物組織形成具有生根發(fā)芽能力的胚狀結(jié)構(gòu)，包裹上人造種皮，制成人工種子，可以解決有些作物品種繁殖能力差，結(jié)子困難或發(fā)芽率低等問題.,人工種子,同常規(guī)的無性繁殖方法相比，組織培養(yǎng)快速繁殖法主要具有以下優(yōu)點：（1）快速。采用常規(guī)的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生產(chǎn)幾株或幾十株，但用組織培養(yǎng)的方法則每年可以繁殖出幾萬甚至數(shù)百萬的小植株。（2）周年生產(chǎn)。花卉組織培養(yǎng)快速繁殖是在實驗室中進行，因條件可控，所以不受季節(jié)限制，可以全年進行連續(xù)生產(chǎn)。而常規(guī)的無性繁殖則受季節(jié)限制，只能在花卉生長季節(jié)進行繁殖。（3）經(jīng)濟效益高。花卉組織培養(yǎng)快速繁殖所需要的空間小，在一個200平方米的培養(yǎng)室內(nèi)一年可生產(chǎn)試管苗上百萬株。如按每株1元計算，每年產(chǎn)值上百萬元。（4）以組織培養(yǎng)繁殖的種苗與母株有著相同的遺傳基因。所以使用這項技術(shù)可讓優(yōu)良的品種不斷地延續(xù)。,組織培養(yǎng)與常規(guī)繁殖相比優(yōu)點眾多,二、實驗操作,（一）制備MS固體培養(yǎng)基,MS培養(yǎng)基包括20多種營養(yǎng)成分，實驗室一般使用4。C保存配制好的培養(yǎng)基母液來制備.,1、配置各種母液,無機物中大量元素濃縮10倍，微量元素濃縮100倍，常溫保存.,激素類、維生素類以及用量較小的有機物一般可按1mg/ml的質(zhì)量濃度單獨配制成母液.,用母液配制培養(yǎng)基時，需要根據(jù)各種母液的濃縮倍數(shù)，計算用量.,2、配置培養(yǎng)基,分裝到錐形瓶中，每瓶分裝50ml或100ml.,配制培養(yǎng)液,調(diào)PH,培養(yǎng)基的分裝,由于菊花的莖段的組織培養(yǎng)比較容易，因此不必添加植物激素.,3、滅菌,分裝好的培養(yǎng)基連同其他器械一起進行高壓蒸汽滅菌.,1、選材：菊花莖段，取生長旺盛的嫩枝.,（二）外植體消毒,2、消毒,流水沖洗,菊花莖段用流水沖洗后可少許洗衣粉，用軟刷輕輕刷洗，刷洗后在流水下沖洗20min左右.,酒精處理,用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入體積分數(shù)為70的酒精中搖動23次，持續(xù)67s，立即將外植體取出，在無菌水中清洗.,消毒液處理,取出后用無菌吸水紙吸干外植體表面的水分，放入質(zhì)量分數(shù)為0.1的氯化汞溶液中12min，取出后在無菌水中至少清洗3次，漂凈消毒液.,（三）接種,污染的主要來源是空氣中的細菌和孢子，接種室消毒是至關(guān)重要的。用70的酒精噴霧使空氣消毒，酒精或新潔爾滅搽洗工作臺并用紫外線照射20分鐘,1、接種室消毒,2、無菌操作要求,操作要在酒精燈火焰旁完成，每次使用器械后，都需要用火焰灼燒滅菌，接種后立即蓋好瓶蓋。,3、材料的切取和接種,4、接種注意事項,每接種一塊外植體前，鑷子需放入體積分數(shù)為75的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精燈火焰上燒一遍，冷卻后再接種.,外植體在培養(yǎng)基中要分布均勻，放置外植體數(shù)量根據(jù)錐形瓶的大小確定，一般胡蘿卜34塊，菊的莖或葉68塊，也不要太少，以充分利用培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分和光照條件.,插入時應注意方向，不要倒插。莖段、莖尖基部插入培養(yǎng)基利于吸收水分和養(yǎng)分.,思考：你打算做幾組重復？你打算設置對照實驗嗎？,答：每種材料或配方至少要做一組以上的重復。設置對照實驗可以取用一個經(jīng)過滅菌的裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，與接種操作后的錐形瓶一同培養(yǎng)，用以說明培養(yǎng)基制作合格，沒有被雜菌污染。,（四）培養(yǎng),1、愈傷組織的培養(yǎng),從接種外植體到出現(xiàn)愈傷組織需經(jīng)過2周時間。2周之內(nèi)可以看到外植體上逐漸長出乳白色或黃白色的瘤狀愈傷組織。首次培養(yǎng)愈傷組織時，恒溫箱的門應該關(guān)閉不必見光，因為在無光條件下愈傷組織長的更快。2周后，培養(yǎng)基成分接近耗盡，必須更換培養(yǎng)基，進行繼代培養(yǎng).,繼代培養(yǎng)所用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)愈傷組織的相同，在嚴格的無菌條件下，將愈傷組織連同原來的外植體一起移到新培養(yǎng)基上。愈傷組織的繼代培養(yǎng)一代為20d。如果延長時間，培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)減少，外植體會分泌有毒物質(zhì)，造成自身中毒。如果愈傷組織長到直徑為11.5cm時，就可以進行試管苗培養(yǎng)，否則還需進行第二代繼代培養(yǎng).,2、愈傷組織的繼代培養(yǎng),在愈傷組織繼代培養(yǎng)期間，將恒溫箱的門打開，讓愈傷組織見光，愈傷組織見光后顏色可以轉(zhuǎn)為綠色.,3、試管苗的培養(yǎng),當愈傷組織長到一定大小后，可以更換培養(yǎng)基，進行試管苗的見光培養(yǎng).,（五）移栽,移栽生根的菊花試管苗之前，應先打開培養(yǎng)瓶的封口膜，讓試管苗在培養(yǎng)間生長幾日.,1、打開封口膜,2、清洗轉(zhuǎn)移,用流水清洗根部的培養(yǎng)基，將幼苗移植到消過毒的蛭石或珍珠巖等環(huán)境下生活一段時間.,（六）栽培,3、移栽,珍珠巖：固體基質(zhì)型，含水量高、蓄水性強、透性好，適合栽培.,幼苗長壯后，移栽到土壤中.,幼苗移栽后，每天觀察并記錄幼苗的生長情況，適時澆水、施肥，直至開花.,三、課題延伸,1、一般來說，容易進行無性繁殖的植物，也容易進行組織培養(yǎng).,2、實例：蘆薈、豆瓣綠、秋海棠、月季.,本課題內(nèi)容小結(jié),菊花組織培養(yǎng),基礎(chǔ)知識,實驗操作,植物體的組織培養(yǎng),影響組織培養(yǎng)的因素,細胞分化細胞全能性組織培養(yǎng)過程,營養(yǎng)激素環(huán)境條件,MS固體培養(yǎng)基制備外植體消毒接種培養(yǎng)移栽栽培,作業(yè)：P361、在植物組織培養(yǎng)過程中，為什么要進行一系列的消毒、滅菌，并且要求無菌操作。2、在選取菊花莖段是，為什么要選取生長旺盛的嫩枝？,外植體的生理狀態(tài)是成功進行組織培養(yǎng)的重要條件之一。生長旺盛的嫩枝生理狀況好，容易誘導脫分化和再分化。,植物組織培養(yǎng)所利用的植物材料體積小、抗性差，對培養(yǎng)條件的要求較高。用于植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基同樣適合于某些微生物的生長，如一些細菌、真菌等的生長。而培養(yǎng)物一旦受到微生物的污染，就會導致實驗前功盡棄，因此要進行嚴格的無菌操作。,21.下圖是植物組織培養(yǎng)的簡略表示。據(jù)此回答：,練習1、下圖是植物組織培養(yǎng)的簡略表示。據(jù)此回答：（1）表示_，它能被培養(yǎng)成為的根本原因是_。（2）表示_，它與相比分化程度_，全能性_.（3）若想制成人工種子，應選用_。（4）若是花藥，則是_，繼續(xù)對其使用_處理可獲得_正常植株，該過程稱為_。（5）若是胡蘿卜根尖細胞，則培養(yǎng)成的葉片的顏色為_，這說明_。（6）若利用此項技術(shù)制造治療燙傷、割傷的藥物紫草素，培養(yǎng)將進行到_。,答案：（1）離體的植物組織或器官植物細胞具有全能性（2）愈傷組織低高（3）（4）單倍體植株秋水仙素純合體單倍體育種（5）綠色含有表達葉綠體的基因（6）,練習2、基因型為AaBb的水稻（含24條染色體）的花藥通過無菌操作接入試管后，在一定條件下形成試管苗，問：（1）愈傷組織是花粉細胞不斷分裂后形成的不規(guī)則的細胞團