主講老師胡建平 藥理學實驗基本知識 第一章藥理學實驗須知第二章藥理學實驗常用儀器及技術第三章實驗數據的簡單統計學 該次課的內容安排 第一章藥理學實驗須知 一藥理學實驗的重要性藥理學實驗是藥理學教學的一個重要的部分 用來驗證一些藥理學理論部分內容 二藥理學實驗課程的目的選做一些經典 實用的實驗 使得學生熟悉藥理學實驗的基本操作方法和技能 了解新藥評價和開發臨床前的一些藥效學和毒理學的一些基本技能 培養學生獨立思考 操作 分析 解決問題的能力 第一章藥理學實驗須知 三藥理學實驗課前 課中 課后的要求 一 實驗前仔細閱讀實驗指導 了解實驗的目的 要求 步驟和操作程序 結合實驗內容復習有關理論 做到充分理解 預測實驗應得到的結果 寫出預習實驗報告 自己隨意寫 對自己做實驗有用就好 二 實驗時實驗器材安放整齊 清潔有序 按照實驗步驟 以嚴肅認真的態度循序操作 不得進行與實驗無關的活動 注意保護實驗動物 以免影響實驗結果 愛護實驗器材和節約藥品 仔細觀察實驗過程出現的現象 隨時紀錄實驗數據 聯系理論進行思考 發生什么 為何這樣 生理意義 三 實驗后把實驗用具整理就緒 如有損壞短缺 應向教師報告 整理實驗數據 認真書寫實驗報告 按時上交評閱 四實驗報告的書寫 藥理學實驗報告姓名 班級 組別 日期 實驗題目 實驗目的 實驗對象 實驗步驟 實驗結果 分析與討論 結論 實驗結果的描述文字上力求從簡 最好用圖表表示 填寫實驗結果時 要堅持真實性和科學性 在分析討論中 可以結合理論部分進行分析 或對實驗得到的規律性的東西進行分析討論 提出見解 避免抄書 結論部分的東西是本次實驗獲得的最為基本的規律性內容 文字務必簡明扼要 不可憑空想象加入一些本實驗沒有證實的內容 五實驗室規則1遵守學習紀律 準時上下課 實驗期間不得借故外出或早退 特殊情況下 需要請假 2必須認真地進行實驗操作 觀察實驗結果 實驗期間要保持安靜 不得進行任何與實驗無關的活動 3實驗數據及實驗紀錄 必須經過教師審核 否則不能結束實驗 4各組的儀器 用品 由本組使用 不得與別組調換 以免混亂 如遇到儀器損壞或丟失 應報請教師處理 5愛護公共財物 注意節約各種實驗用品 實驗動物按組發給 如需要補充使用 須經教師同意之后才能補領 6保持實驗室清潔整齊 隨時清除污物 實驗完畢后 應將實驗器材 用具收拾妥當 將手術器械擦洗干凈 清點數量 放回原處 經教師檢查之后才能離開實驗室 一分光光度計二離心作用三動物的捉持四動物的給藥方法五動物的取血方法六動物的處死方法 第二章藥理學實驗常用儀器及技術 一分光光度計 儀器介紹分光光度計有幾個部件 其中包括光源 提供選擇波長的的單色器 可變狹縫 樣品架 光探測器和儀表 不同的光譜區要使用不同的光源 在可見區 400nm 700nm 和紫外區 200nm 400nm 分別使用鎢燈和氘燈 在這些區域的光波長是由分光光度計中的單色器選擇的 單色器是由棱鏡或衍射光柵構成的 在可見區和紫外區給出窄帶波長的光 光由可控制光強的可調狹縫進入樣品 然后由光電管探測透過的光 并被電流計所測量 下圖為分光光度計的部件原理圖 紫外和可見光譜的應用紫外和可見光譜最為主要的應用是 測量溶液中物質的濃度 其基本原理是 光吸收值和吸光物質的濃度成正比 二離心作用離心作用是裝有固體顆粒懸浮液的容器迅速旋轉的過程 顯著增加的重力場使顆粒沉降 離心力或引力與角速度的平方 2 乘以距轉動中心的徑向距離r cm 成正比 角速度以每分鐘的轉速 rpm 來表示 離心力由下式給出 F 1 12 10 5 2 r 從上式可以看出 對于徑向距離為7cm的轉子 若角速度為10000rpm 則離心力為8000g 成功的離心作用取決于兩個因素 1 離心時間和 2 發揮的g值 如下表 表1在離心場中沉降生物顆粒所需的重力和時間的比較 所以使用不同的g力 不同的離心t的差速離心法可用來分離細胞組分 三動物的提持 限小鼠和家兔 1小鼠的提持 2種方法 雙手提斥法右手提起鼠尾 放在鼠籠 或其他粗糙面 上 向后輕拉其尾 小鼠即固定于鼠籠上 迅速用左手拇指和食指捏住小鼠頭頸部皮膚 并以左手小指 無名指壓其尾部于手掌尺側 單手提持法只用左手 先用食指和拇指抓住小鼠尾巴后用手掌尺側和小指夾住尾根部 然后用左手拇指和食指捏住頭頸部皮膚2家兔的提持一只手抓住兔頸背部皮膚 將兔輕輕提起 另一只手托住臀部 使兔呈蹲坐姿勢 切不可用手握持雙耳提起兔子 1灌胃方法2皮下注射方法3肌內注射方法4腹腔注射方法5靜脈注射方法 四動物的給藥方法 限小鼠和家兔 動物給藥方式一 灌胃方法 小鼠的灌胃方法左手捉持小鼠 腹部朝向操作者 右手持灌胃管 經口角插入口腔 使灌胃管與食管成一直線 將灌胃管沿上腭壁緩慢插入食管2cm 3cm 灌胃管的前端即達膈肌部位 此時操作者可有抵抗感 如動物安靜 呼吸無異常 即可將藥液注入 操作宜輕柔 防止損傷食管 如遇阻力應抽出灌胃管重新插入 若將藥液誤注氣管 動物立即死亡 家兔的灌胃方法給兔灌胃需兩人合作 一人坐好將兔軀體夾于兩腿之間 左手抓住雙耳 固定其頭部 左手抓住兩前肢 使兔頭稍向后仰 另一人將開口器橫放于兔口中 慢慢旋轉開口器 將兔舌壓住 并固定之 將8號導尿管經開口器中央孔 沿上腭壁慢慢插入食管15cm 18cm 為避免誤入氣管 可將導尿管的外口端放入清水中 無氣泡逸出方可注入藥液 再用少量清水沖洗管內殘存藥液 灌畢 慢慢拔出導尿管 取出開口器 小鼠的皮下注射方法一般需要兩個人合作 一人左手捏小鼠頭部皮膚 右手拉住小鼠尾巴使小鼠固定 另一人左手提起背部皮膚 右手持注射器將針頭刺入皮下 稍稍擺動針頭 若容易擺動則表明針尖確實位于皮下 此時注入藥液 拔針時 右手捏住針刺部位片刻 以防止藥液逸出 也可一人操作 將小鼠放在粗糙的平面上 左手拉小鼠尾巴 趁小鼠向前爬動時 右手持注射器迅速將針頭刺入小鼠背部皮下 推注藥液 家兔的皮下注射方法通常選擇背頸部皮下注射 操作者左手拇指 食指和中指提起背頸部皮膚 使其折成三角體 右手持注射器自皺折下方刺入皮下 松開皮膚注入藥液 動物給藥方式二 皮下注射方法 小鼠的肌內注射方法需兩人合作 一人左手捏小鼠頭部皮膚 右手拉住小鼠尾巴使小鼠固定 另一人左手固定注射側后肢 右手持注射器 將針頭刺入外側股部肌內 小鼠肌肉較少 肌內注射不常用 家兔的肌內注射方法注射部位為臀部和股部肌肉 動物給藥方式三 肌內注射方法 小鼠的腹腔注射方法左手捉持小鼠 將腹部朝上 頭部下傾 右手持注射器在下腹左側或右側 避開膀胱 向頭端穿刺 針頭與皮膚呈30 刺入腹腔 有落空感 注入藥液 注意針頭不要刺入太深 太靠上 以免刺破肝臟 家兔的腹腔注射方法方法幾乎與小鼠相同 動物給藥方式四 腹腔注射方法 小鼠的靜脈注射 多用尾靜脈注射 將小鼠固定在一鐵絲籠或特制筒內 使小鼠尾露在外面 用75 乙醇溶液涂擦尾巴或在45 左右溫水中侵泡30s 使尾靜脈充血 注射時 左手拇指和食指捏持鼠尾 右手持注射器 選擇尾巴兩側靜脈 使針頭與鼠尾成3 5 幾乎平行 進行靜脈穿刺 如推注藥液無阻力 局部皮膚發白則表明針頭未刺入血管 退出針頭重新穿刺 注意靜脈穿刺時應從遠端 近尾尖 開始 不僅容易穿刺 而且還可向近端多次穿刺 注射完畢 用棉球按壓穿刺口止血 家兔的靜脈注射 多用耳緣靜脈 注射部位去毛并用酒精棉球涂擦 用左手拇指和中指捏住兔耳尖部 以食指墊于耳下 右手持注射器 從靜脈遠端將針頭刺入血管 將藥液推入 如推注時有阻力 局部出現腫脹 表明針頭不在血管內 應立即拔針重新穿刺 注畢要用棉球壓迫針眼幾分鐘止血 動物給藥方式五 靜脈注射方法 小鼠剪尾采血將小鼠固定在鐵絲籠或特別筒內 使鼠尾露在外面 剪掉鼠尾1mm 2mm 用拇指和食指由尾根向尾尖按捏 血液即從尾尖流出 小鼠每次可采血0 1ml 注意 只剪去尾尖 如剪去過多組織 反而流血少 下次采血時 只需將尾尖血痂jia剪掉就可以了 家兔心臟采血將家兔被部固定 剪去左側胸部相當于心臟部位的被毛 用碘酒和酒精消毒皮膚 選擇心臟跳動最明顯處穿刺 一般由胸骨左緣外3mm處刺入兔的第三肋間隙 穿刺時 最好用左手觸診心臟 以作配合 當針頭接近心臟時 就會感到心臟的跳動 這是需將針頭再向里穿刺 便可進入心室 由于心臟的搏動 血液會自然進入注射器 如認為針頭已經進入心臟 但抽不出血液 可將針頭稍微退出或進入一點 一般來講 心臟采血經6 7天后 可以重復進行 采血量大約20ml 30ml 五動物的取血方法 限小鼠和家兔 家兔耳緣靜脈采血拔去耳緣被毛 用燈泡照射加熱耳朵或75 酒精涂擦局部 使靜脈擴張 再用石蠟油涂擦耳緣 防止血液凝固 耳受熱之后用小血管夾夾緊耳根部 用粗號針頭逆靜脈回流方向刺破靜脈或用刀片切開靜脈 血液可自動流出 一般可采血2ml 3ml 取血后棉球壓迫止血 家兔耳中央動脈采血將兔子置于兔固定箱內 用酒精棉球擦揉兔耳片刻 使其充血 在兔耳中央有一條縱行 較粗 顏色鮮紅的中央動脈 左手固定兔耳 右手持注射器 一般用6號針筒 不可太細 在中央動脈的末端 沿動脈平行地向心方向刺入動脈 慢慢回抽針筒 動脈血立即進入針筒 一次可取血15ml 因耳中央動脈容易發生痙攣收縮 容易導致采血無法進行 因此必須要先讓兔耳充分充血 并在痙攣前迅速完成抽血 抽血后棉球壓迫止血 五動物的取血方法 限小鼠和家兔 六動物的處死方法 限小鼠和家兔 小鼠的處死 常采用頸椎脫臼法 用左手拇指和食指將其頭部緊緊按在硬的物體上 右手捏住鼠尾 用力向后上方牽拉 使頸椎脫位 小鼠可瞬間死亡 家兔的處死 常采用空氣栓注法 用50ml 100ml的注射器 往家兔的耳緣靜脈內注射20ml 40ml的空氣量 使之發生栓塞而死亡 一均數二標準差 SD 三標準誤和t檢驗 第三章實驗數據的簡單統計學 實驗數據的統計的意義 藥理學實驗所得的數據一般都需要經過統計學處理 以便通過分析樣本 推斷總體 透過偶然 找出規律 統計處理數據資料的系統知識比較豐富 這里僅僅對處理藥理學實驗結果的需要 對實驗結果的均數 標準差 標準誤以及計量資料的顯著性測定做一個簡單的介紹 以供學生對實驗結果作出正確的判斷 一均數 均數也就是算術平均值 統計學上用表示 均數是分析計量數據最基本的指標 它表示一套變量值的集中趨勢 平均水平 不僅可以給人一個簡明概括的印象 并可用來作事物間的比較 均數的計算公式為 其中為總和 x1 x2 xn等為各次的測定值 變量 n為變量的個數 即樣本容量 而為各變量的總和 二標準差 SD 均數只是集中趨勢的指標 不能反映一組數據與均數的離散程度 特別是數據不符常態分布時 更是如此 而標準差是最為常用的 最能完整地反映全套變量值離散程度的統計指標 一般用SD表示 而計算SD的公式為 式子中x為每一個變量值 為均數 n為變量的個數 例1根據某年級12名女學生收縮壓的數據 見下表 求其均數和標準差 表一12名女學生收縮壓數據 表一12名女學生收縮壓數據 表一12名女學生收縮壓數據 解 將有關數據帶入公式 1 求出均數代入公式 2 求出標準差所以可以得到 從上面的例子也可以看出 標準差反映了各變量離開均數的分布情況 在均數與單位相同的情況下 標準差越大 則表示各變量離開均數越遠 諸變量離散程度也越高 反之 標準差越小 則表示離均數越近 離散程度越低 偏差小 精密度高 三標準誤 SE 和t檢驗 標準誤和標準差不同 它表示的是多次測定的均數與總體均數的離散程度 也就是總體中各樣本的均數的標準差 計算公式如下 其中 SE為標準誤 SD為標準差 n為樣本數 值得注意是 SE的目的主要是為了用于兩個均數差別的顯著性檢驗之中 t檢驗的定義 在抽樣研究中 經常遇到兩個樣本均數的有所差別 對于兩個均數的差別不可以僅看表面數值的不同而匆忙推論出其本質的差異 必須考慮到引起這種差別有兩種可能性 1 差別僅僅又抽樣誤差所引起 它們之間沒有本質上的誤差 2 差別已經超出了抽樣誤差所引起的范圍 它們之間有本質差異 除t值之外 在得到組間差異的概率之前還需要知道自由度 上述例子的自由度為 通過t值和自由度f值可以從t 分布表上找到組間差異的概率P 兩者差別不大且接受抽樣誤差的概率 其中t值的判