方法一：1. 首先需要把細胞養在玻璃片上（懸浮細胞需要用多聚賴氨酸包被過的玻璃片）2. 然后在4PFA里面室溫下固定30分鐘，PBS洗兩次，0.1% TX-100室溫下作用12分鐘使細胞膜通透。3. 接下來進行熒光標記，需要在一個大的容器（面積大，扁平狀的，比如大的培養皿）里面，放一張用水打濕的濾紙，以保持濕度。4. 剪一片合適大小的parafilm，在上面滴上稀釋在1BSA/TBS中的一抗（稀釋倍數依具體抗體而定），每個玻璃片30ul足夠，把玻璃片蓋在上面（細胞面朝下），室溫下孵育30分鐘，然后在PBS里洗三次。5. 接下來二抗孵育步驟同上。6. 最后，在載玻片加上mounting medium（大約每個玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（細胞面朝下），37度30分鐘，然后就可以在熒光顯微鏡下觀察了。7. 抗體很重要，不能有非特異性結合。你可以先做WB檢測一下你的抗體，看看有沒有雜帶。8. 雙標的話，可以把兩個一抗一起加或者分別標記兩次（可以都試一下看看那種方法合適）。如果一個抗體需要二抗，一個是直接熒光標記的，可以把熒光標記的那個和另外一個的二抗一起加。方法二：1. 選取一抗時要來源于兩種不同的動物，我用的是來源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號標記 的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。2. 我的做法是兩種一抗同時孵育，然后兩種二抗同時孵育。抗體濃度、孵育時間要仔細摸索，我感覺一抗4度孵育過 夜比較好，背景比較清晰。3. 我的陽性對照用的是陽性組織切片，陰性對照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標記物對照是PBS+熒光標記物。4. 封閉血清與二抗來源動物一致，我用的是10%的正常donkey血清。5. 其余步驟同一般免疫熒光單標操作。方法三：1. 片子的制作：可以做細胞爬片，細胞甩片，還有直接在24well/12well/96well中直接染色2. 細胞爬片的制作：直接購買公司的已經處理過的細胞爬片，要是自己制作的話，就用無菌的蓋玻片用多聚賴氨酸處理后讓細胞自己爬片3. 細胞甩片：需要甩片機將細胞懸液均勻甩到玻片上。4. 其實小的well的話，可以直接拿來染色，沒問題的。5. 固定：用PBS洗去培養液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。）固定細胞。6. 內源性過氧化物酶處理，3%過氧化氫處理細胞（選作，二抗連HRP得必做，其他的如做免疫熒光染色不用做）。7. 通透（胞漿蛋白和細胞核蛋白需要做；細胞膜蛋白不需要做），一般選用Triton-X100來做細胞通透，濃度和時間需要摸索，一般是0.1-5%，處理時間為1-30分鐘，級個別需要到1-2小時。8. 封閉：洗去通透液，用二抗同源的血清約10%的濃度in PBS中封閉半小時，也可以選用5-10%脫脂奶粉。封閉結束后千萬不要洗，直接上一抗。9. 一抗：具體你想做什么樣的蛋白，咨詢抗體公司如santa cruze,Abcam,sigma.。選取具體的抗體，但是一抗的稀釋濃度也是要摸索，抗體稀釋液可以購買抗體公司現成的，對于新手還是挺好的。時間一般是4度過夜或者37度1小時。一抗最好還是選用外國抗體公司的抗體。10. 洗去一抗。11. 上二抗，二抗一般抗體公司會給你推薦的，你在其中選上一個就行了，自己選國產的也行，就是選在哪個動物體內做的一抗，二抗就選抗那個動物的就行了。二抗的濃度也是需要摸索的，抗體稀釋液和一抗相同就行了。二抗的時間一般是37度半小時。12. 底物顯色（選作，二抗連得是酶的必做，按試劑盒的說明書添加就行了，顯色時間可能需要摸索，以免顯色過度引起假陽性；二抗連得是熒光報告的不用做）13. 洗去二抗，染核14. DAPI或者Hoechst染核15. 洗去染核液，加PBS，上鏡觀察。方法四：(1) 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌(1000rpm，5min)2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。(2) 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4保存3個月。PBS洗滌35 min。(3) 通透。使用交聯劑(如多聚甲醛)固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌35 min。(4) 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min。 (5) 一抗結合。室溫孵育1h或者4過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。 (6) 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。 (7) 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。方法五：1 漂洗血清蛋白PH7.2-7.4，37度 PBS 2小時.2 -20度甲醇固定20分鐘后，自然、干燥 10分鐘3 PBS洗凈：3min34 1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5 PBS洗凈：25min6 羊血清封閉：37度，20分鐘7 一抗，4度過夜，一般要大于18小時或者37度1-2小時8 4度 PBS洗凈，min5次9 二抗37度小于一小時10 37度PBS洗凈，33min11 涼干封片（封閉液PH8.5）細胞免疫熒光步驟：1.細胞爬片；首先是玻片的處理，普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊，先用洗衣粉洗干凈，用水沖靜烤干，然后泡酸過夜，撈酸后流水洗凈，烤干，置于器皿中高壓滅菌，然后再烤箱中大約8小時烤干備用。爬片可以在培養皿 六孔板或24孔板中都可，我選擇在培養皿中爬。一為節約經費（培養皿可以重復利用）二來覺得培養皿口大，操作比較方便。培養皿消毒同上，消毒時記得消兩把鑷子具體操作是：用胰酶消化好細胞，充分吹打，使之成單細胞懸液（注意：這一點很重要，關系到將來爬出來片子的質量）取出消毒的培養皿，可以先加少量培養基（以使玻片與培養皿緊密接觸），將玻片小心放入擺放其中，然后將單細胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養皿置于37度5CO2的暖箱中培養，根據細胞生長狀況，24小時或更長時間適時取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然后在4多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時操作過程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹膠徹底干了之后才能做后續實驗，要不然玻片會掉下來的，就又是前功盡棄了 做好的細胞爬片可以放在20保存備用，具體能保存多長時間不太清楚，當然盡量早用。2.4%多聚甲醛固定10min(固定細胞器用預冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封閉30min；7.加入1%BSA稀釋的一抗，于37雜交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀釋的二抗，于37雜交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬滅封片劑封片。抗淬滅封片劑:2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油細胞免疫熒光細胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定細胞器用預冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封閉30min加入1%BSA稀釋的一抗，于37雜交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀釋的二抗，于37雜交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml D