全內反射熒光成像基本原理TotalInternalReflectionFluorescence TIRF 全內反射熒光顯微鏡 TIRFM 目前用于單分子研究的檢測技術主要有兩大類 掃描探針顯微技術 SPM 和光學技術 其中 SPM 原子力顯微技術 AFM 掃描離子電導顯微技術 SICM 掃描隧道顯微技術 STM 上世紀80年代 Axelrod等生物物理學家對TIRFM技術及基本原理進行描述 并探索了其在生物方面的應用 發(fā)展歷程 Axelrod Julius 阿克塞爾羅德 Axelrod Julius 美國生物化學家及藥理學家 1970年他與卡茨馮奧伊勒共享了諾貝爾生理學和醫(yī)學獎 于美國衛(wèi)生研究院度過其大部職業(yè)生涯 他研究藥物及激素的作用 神經沖動傳播的化學方面 并特別研究松果體的功能 光反射和折射示意圖 全內反射示意圖 光的反射和折射 Snell定律 當入射角不斷增大 透射角為增大90 時 入射角達到臨界角 c 依據Snell定律得出 當入射角繼續(xù)增大時 光不再透射進水溶液 即發(fā)生了全內反射 實際上 由于光的波動效應 有一部分光的能量會透過臨界面滲透到水溶液中 平行于界面向水溶液中傳播 這一部分透過的能量場則稱之為 隱失波 或 隱失場 隱失波 隱失波 隱失波的頻率與入射光線的頻率相同 其強度隨臨界面的垂直距離呈指數衰減 其中 Z是離開分界面的距離 I z 表示距離界面Z處的強度 I 0 表示臨界面處的強度 由于隱失波僅在界面上極薄的一層范圍內傳播 所以利用隱失波照明樣品 可以僅激發(fā)厚度大約100nm內的熒光團 而更深層溶液中的熒光基團不會被激發(fā) 因此極大地提高了顯微成像的對比度和信噪比 d12是滲透深度 它等于從分界面處到光強衰減l e處的距離 隱失波的滲透深度d12是入射角及相對折射率的函數 d12是滲透深度 它等于從分界面處到光強衰減到分界面處數值l e的處的距離 對于可見光波長而言 浸透深度約為100nm 隱失波強度成指數衰減曲線 隱失波存在的實驗證明 兩塊光密媒質做的棱鏡中間夾一薄層空氣層 光疏媒質 如果不斷減少空氣層的厚度 由于空氣層中有透射波 這透射波進人第二塊棱鏡 光學隧道效應 光強度并不發(fā)生全反射 而是有隱失波存于介質2中 當光疏介質薄膜的厚度小于隱失波的滲透深度時 這個波不僅穿過了光疏介質 而且會促進鄰近高折射率介質3中的電子作受迫振動 由此產生了新的次波 隱失波的形態(tài)發(fā)生了顯著改變 全反射被破壞 能量發(fā)生了流動 導致了光學隧道效應的產生 全內反射熒光顯微技術 是利用光發(fā)生全內反射時產生的隱失波照明樣本 僅激發(fā)樣本表面薄層范圍內的熒光基團 與傳統(tǒng)的熒光顯微鏡相比 使顯微成像在Z軸上的空間分辨率得到了顯著改善 大大提高了圖像的信噪比和對比度 全內反射熒光顯微成像系統(tǒng) 分子熒光的產生 當一束特定波長的光照射到物質時 物質分子與光量子發(fā)生 碰撞 如果這次碰撞時有效的 激發(fā)態(tài)停留時間短 返回速度快的途徑發(fā)生的幾率大 熒光 10 7 10 9s磷光 10 4 100s 分子熒光的產生 電子躍遷的單重態(tài) 單線態(tài) 與三重態(tài) 三線態(tài) 在光致激發(fā)和去激發(fā)光的過程中 分子中的價電子 n 處于不同的自旋狀態(tài) 通常用多重態(tài)M來描述 M 2S 1 1電子自旋的大小用自旋量子數S表示 S可為 1 2或 1 2 這里的正負號取決于自旋的方向 基態(tài)中每個能級通常被兩個自旋相反的即自旋配對的電子占據 M 1 成為單重態(tài) 當成對電子中的一個被激發(fā)到S1 S2等電子能級激發(fā)態(tài)時 其自旋不變 即仍和處于基態(tài)的另一電子成對 這些能態(tài)都被稱為單線態(tài)或單重態(tài) singletstate 但如果處于第一電子激發(fā)態(tài)最低振動能級的電子通過無輻射躍遷 系間跨越 intersystemcrossing 改變自旋方向 則因消耗部分能量而降至另一種激發(fā)態(tài) S 1 2 1 2 1 多重度M 2S 1 2 1 1 3 這種電子激發(fā)態(tài)稱為三重態(tài) tripletstate 分子熒光的產生 雅布隆斯基分子能級圖 熒光發(fā)射 電子由第一激單重態(tài)的最低振動能級到基態(tài) 多為S1 S0 由于基態(tài)中也有振動弛豫躍遷 這使得發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量要小 所以 熒光的特征波長比入射波長要長 熒光是相同多重態(tài)間的允許躍遷 產生速度快 10 9 10 7s 又叫快速熒光或瞬時熒光 外部光源停止照射 熒光馬上會消失 磷光發(fā)射 第一激發(fā)三重最低振動能級到基態(tài) 10 4 10s 外部光源停止照射后 可以持續(xù)一段時間 分子熒光的產生 目前 大多數全內反射熒光顯微鏡主要有兩種基本類型 棱鏡型和物鏡型 或無棱鏡型 棱鏡型 全內反射熒光顯微鏡結構 全內反射熒光顯微鏡結構 物鏡型使用高數值孔徑 NA 1 4 的物鏡作為熒光信號的接受器 同時又作為發(fā)生全內反射的光學器件 樣品的放置非常方便 并且可與多種技術聯(lián)用 例如納米操縱 光鑷技術 原子力顯微鏡等 該系統(tǒng)的關鍵是高數值孔徑物鏡的使用 由于細胞的典型折射率為1 33 1 38 因此要實現全內反射 物鏡的NA必須大于1 38 表達式為 NA nsi