動物微生物及免疫學(實踐教學) 開題報告 病豬肝臟中大腸桿菌與沙門氏桿菌的分離鑒定 班 級： 動物醫學2009-1 聯系方式： 1528352XXXX 指導教師： XXX 時 間： 2011-6-20 動物微生物及免疫學(實踐教學) 開題報告組長XXX成員XXX XXX班級動醫2009-1課題名稱病豬肝臟中大腸桿菌與沙門氏桿菌的分離鑒定聯系電話1528352XXXX電子郵箱XXXXXXXXXXXX163.com立題依據大腸桿菌（E.coli）和沙門氏菌(Salmonella)同屬腸桿菌科，分別為埃希氏菌屬和沙門氏菌屬的代表菌。大腸桿菌為革蘭氏陰性的直桿菌，兩端成對，散在或成對，大多數以周生鞭毛運動。堿性染料對本菌有良好的染色，菌體兩端偶爾略深染。兼性厭氧。在瓊脂培養基上生長24h后，形成圓形凸起、光滑、潤濕、半透明、灰白色菌落;麥康凱瓊脂上形成紅色菌落；在伊紅美藍瓊脂上產生黑色帶金屬閃光的菌落在SS瓊脂上一般不生長或生長較差，生長著呈紅色。本菌能夠發酵多重碳酸化合物產酸產氣。大多數菌能夠迅速發酵乳糖。大腸桿菌可分為致病性大腸桿菌和非致病性大腸桿菌兩類。其血清型比較多：而沙門氏菌作為一種重要的生化特性和抗原結構相似的人畜共患的腸道病原菌。迄今為止已經發現了2523個血清型。沙門氏菌革蘭氏陰性，兼性厭氧。通常都以周生鞭毛運動。絕大多數發酵葡萄糖產酸產氣。在三塘鐵（TSI）上產生硫化氫。在腸道桿菌選擇或鑒別培養基上，大多數菌因為不發酵乳糖而呈無色菌落。麥康凱瓊脂上典型菌落呈透明、無色，有時帶有暗色中心。絕大多數沙門氏菌對人和動物有致病性，能引起人和動物多種臨床表現的沙門氏菌病，并未人類食物中毒的主要病原之一。根據兩種菌在腸道桿菌分離鑒定培養基上的生長特征，本次實驗我們將以病豬肝為菌源設計實驗對兩者進行分離培養，再利用生化實驗進一步鑒定。實驗目的病豬肝中的大腸桿菌和沙門氏桿菌的分離培養及鑒定實驗用品一、器械：顯微鏡，載玻片，擦鏡紙，高壓蒸汽滅菌器，恒溫箱，電爐，天平，酒精燈，量筒，燒杯，玻璃棒，三角瓶，漏斗，培養皿，試管，接種環，膠頭滴管，PH試紙，紗布，試管塞，扎繩，火柴，吸水紙，無菌操作臺等。二、藥品材料：病豬肝臟，各種培養基制備所需化學藥品，革蘭氏染色化學藥品，顯微鏡油鏡用油和擦鏡的二甲苯試液三、培養基及制備1、普通瓊脂培養基的制備稱取：牛肉膏3g，NaCl 5g，瓊脂20g，蛋白胨10g，蒸餾水1000ml稱重，加熱煮沸，補水，調節PH值7.47.6，分裝入三角瓶包裝，滅菌。待適宜溫度（5060）后，倒入平皿，每平皿1015ml，將皿蓋蓋上。并將培養皿于桌面上輕輕旋轉，使培養基平鋪于皿底，制成普通瓊脂平板。2、麥康凱瓊脂培養基的制備稱取：NaCl 0.5g，瓊脂2.53.0g，蛋白胨2g，乳糖1g，膽鹽0.5g，1%中性紅水溶液0.5ml，蒸餾水1000。除中性紅水溶液外，其余各成分混合于鍋內加熱溶解，調節PH7.07.2，煮沸，以脫脂棉花過濾。加入中性紅水溶液搖勻。121滅菌15min，待冷卻50時，傾成平板。等平板內培養基充分凝固后，置溫箱內烘干表面水分。實驗用品1g，氯化鈉5g，硫代硫酸鈉0.3g，瓊脂12g，0.4%酚紅水溶液6.3ml，水1000ml。以上成分置于水中煮沸溶解，調節PH7.4，分裝直徑15mm的試管，每管10ml，在121中滅菌10min.趁熱做成底層部分約2.5cm高的高層斜面3、三糖鐵培養基的制備稱取牛肉浸膏3g，蛋白胨20g，枸櫞酸鐵0.3g，乳糖10g，蔗糖10g，酵母膏3g，葡萄糖1g，氯化鈉5g，硫代硫酸鈉0.3g，瓊脂12g，0.4%酚紅水溶液6.3ml，水1000ml。以上成分置于水中煮沸溶解，調節PH7.4，分裝直徑15mm的試管，每管10ml，在121中滅菌10min.趁熱做成底層部分約2.5cm高的高層斜面。4、尿素瓊脂培養基制備基礎成分：蛋白胨 1g、氯化鈉 5g、葡萄糖 1g、磷酸二氫鉀2g、酚紅溶液0.012g、瓊脂15g、蒸餾水900ml濃尿素：尿素20g、蒸餾水100ml、調整pH值至6.86.9。過濾除菌方法：溶解15g瓊脂與水內，加入其他成分，121高壓滅菌15分鐘。冷至5060，再加100ml濃尿素。混勻后，分裝滅菌試管內。培養基做成斜面或高層。方法和步驟1、肝組織取樣,然后用小刀在組織上劃一小口2、將接種環伸入肝組織小口內接觸取樣，再接種到兩個麥康凱平板，37培養24h。3、疑似菌落篩選：分A、B兩組培養1)A組準備三糖鐵和普通瓊脂斜面，分別挑去疑似大腸桿菌菌落3-5個接種，37培養24h。；2)B組準備三糖鐵、尿素瓊脂及普通瓊脂斜面，分別接種疑似沙門氏菌，37培養24h。注意：接種的菌落幾個培養基要一一對應并標記，保證后續試驗順利進行。TSI預期結果：斜面底層產氣硫化氫沙門氏菌-+/-+大腸桿菌+/-4、初步鑒定：A組中，對符合大腸桿菌TSI菌落特征的細菌制片G染色，鏡檢。不符合者停止鑒定；B組中，對符合沙門氏菌TSI菌落特征和尿素分解陰性的細菌進行后續鑒定。不符合者停止鑒定。5、生化實驗：取A、B組中合格菌對應的普通瓊脂平板上的細菌進行生化實驗，每種生化發酵管均37培養24h，然后觀察記錄結果。注：生化實驗預期結果葡萄糖乳糖蔗糖麥芽糖甘露醇肌醇MRVPC尿素硫化氫大腸桿菌黃色氣柱黃色氣柱黃色或紫色黃色氣柱黃色紫色紅色黃色淡綠色黃色淡黃色沙門氏菌黃色氣柱紫色紫色黃色氣柱黃色黃色紅色黃色深藍色黃色黑色6、分析得出最終鑒定結果。注意事項1、嚴格遵守各項實驗操作，如無菌操作，以避免結果的偏差； 2、最好按實驗計劃準時操作，或有所推遲，以確保每次培養都能達到規定時間，如24h；3、操作人員應注意安全。如酒精使用燈、有毒藥物使用的安全； 4、實驗前后應注重個人衛生，穿實驗服、實驗后吸收等，避免有毒菌感染；5、每日操作及觀察結