題目：腎素血管緊張素系統(tǒng)免疫調(diào)節(jié)機(jī)制及其對腫瘤免疫的作用摘要：腫瘤通過免疫逃避機(jī)制引起T淋巴細(xì)胞凋亡和增生受抑，而組織腎素血管緊張素系統(tǒng)(RAS)對多種組織細(xì)胞的增生和凋亡有重要的調(diào)節(jié)作用。本課題從時間動力學(xué)角度，以T細(xì)胞激活誘導(dǎo)的凋亡（AICD）為重點，分析RAS在細(xì)胞免疫中的表達(dá)變化、RAS對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用及其作用機(jī)制，隨之初步探討干預(yù)RAS抑制腫瘤細(xì)胞引起的T淋巴細(xì)胞AICD的可能性。為細(xì)胞免疫和腫瘤免疫的調(diào)節(jié)提供新的思路。研究意義腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和消退取決于與機(jī)體免疫系統(tǒng)的相互作用，研究腫瘤免疫的機(jī)制和影響因素，對于明確腫瘤的發(fā)生，和發(fā)展合理的免疫治療方案均有重要意義。本項目旨在對于腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system, RAS）這一調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增生和凋亡等多種重要功能的系統(tǒng)，研究其免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，并初步研究RAS對于腫瘤免疫的作用。本項目的思路如圖：機(jī)體對腫瘤的免疫反應(yīng)主要是T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)，雖然多種腫瘤特異和腫瘤相關(guān)抗原已經(jīng)分離鑒定，腫瘤免疫反應(yīng)的先決條件已經(jīng)具備，但在大多數(shù)情況下，機(jī)體對腫瘤的免疫反應(yīng)是無效和微弱的。主要原因是腫瘤在與機(jī)體的對抗和選擇過程中發(fā)展的免疫逃避和免疫抑制機(jī)制：1）腫瘤低表達(dá)MHC I，不表達(dá)MHC II和共刺激分子配基如B7; 2)腫瘤抗原的喪失和遮蔽；3)腫瘤分泌免疫抑制因子如TGF-beta,IL-6和IL-10；4）腫瘤誘導(dǎo)免疫耐受；5）腫瘤或者通過表達(dá)FasL，直接殺傷激活的T淋巴細(xì)胞，或者通過重定向細(xì)胞免疫（TH1-TH2）、激活NK1.1+/CD3+細(xì)胞等機(jī)制間接誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞通過AICD凋亡。雖然腫瘤的免疫豁免機(jī)制復(fù)雜多樣，最終結(jié)果是腫瘤特異性的T淋巴細(xì)胞的增生受抑和凋亡，從而導(dǎo)致對腫瘤的免疫無反應(yīng)性1。調(diào)節(jié)T細(xì)胞的增生凋亡是調(diào)節(jié)腫瘤免疫的一個重要靶點。腎素血管緊張素系統(tǒng)（renin-angiotensin system, RAS）是機(jī)體進(jìn)化過程中高度保守的內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，其對血壓和水鈉儲留調(diào)節(jié)的傳統(tǒng)的生物學(xué)功能已為人們所熟知，但愈來愈多的研究表明RAS具有廣泛的生物學(xué)功能，而“組織”RAS在局部表達(dá)通過自分泌和旁分泌作用，對細(xì)胞分化、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)作用成為研究熱點2。RAS的促進(jìn)增殖和凋亡的作用已在包括心肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、嗜鉻細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及多種上皮來源細(xì)胞如血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞等細(xì)胞組織證實3。在細(xì)胞免疫中，T淋巴細(xì)胞已證實表達(dá)RAS的各組成成分，組織RAS起作用的先決條件已經(jīng)具備；血管緊張素II促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞自發(fā)增殖和在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中增殖4，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利抑制T淋巴細(xì)胞AICD和Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡, 在一些免疫介導(dǎo)的炎癥中起保護(hù)作用5，提示RAS對T淋巴細(xì)胞的增生和凋亡這兩種看起來截然相反的過程均有重要的促進(jìn)作用。在細(xì)胞免疫中，機(jī)體對免疫細(xì)胞的增生和凋亡的調(diào)節(jié)體現(xiàn)在克隆選擇和時間動力學(xué)控制上。正常的免疫反應(yīng)是一個多階段的過程，在免疫反應(yīng)中，T細(xì)胞通過抗原識別和TCR/CD3信號，通過JAK/STAT、calcineurin/NFAT、MAPK等多種信號傳導(dǎo)途徑，引起T淋巴細(xì)胞激活、增生和細(xì)胞因子分泌；同時，F(xiàn)as/FasL，CTLA-4等表達(dá)增加，Bcl2/Bax、FLIP等凋亡抑制因子下調(diào)，凋3亡敏感性逐步增加，使激活的T細(xì)胞發(fā)生凋亡6。在細(xì)胞周期中，TCR/CD3信號引起細(xì)胞周期的進(jìn)展和細(xì)胞激活增生，而進(jìn)入G1A但不能通過G1/S調(diào)定點的細(xì)胞將通過AICD凋亡7。機(jī)體通過對信號傳導(dǎo)通路和細(xì)胞周期的調(diào)控，使細(xì)胞的表型和細(xì)胞因子分泌、關(guān)鍵細(xì)胞蛋白發(fā)生有序變化，從而實現(xiàn)免疫細(xì)胞增生和凋亡的精確調(diào)控，既保證免疫反應(yīng)，又避免免疫反應(yīng)過度，保持免疫穩(wěn)態(tài)。(如圖：)： RAS能通過多條信號傳導(dǎo)通路發(fā)揮作用，在T淋巴細(xì)胞可能影響calcineurin/NFAT途徑4。RAS信號傳導(dǎo)與TCR/CD3信號的相互作用（拮抗和協(xié)同/相加）和其作用時T細(xì)胞所處的狀態(tài)，將決定RAS調(diào)節(jié)凋亡和增生的方向。我們設(shè)想RAS對免疫的調(diào)節(jié)作用，不在于它能調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的增生還是凋亡，而在于RAS調(diào)節(jié)增生和凋亡作用是否和正常免疫反應(yīng)的動力學(xué)相吻合，從而決定RAS起促進(jìn)或抑制作用。當(dāng)然，此設(shè)想過于簡化，但是，從時間動力學(xué)角度，分析RAS在細(xì)胞免疫反應(yīng)的不同階段，尤其是在細(xì)胞激活增生階段和AICD凋亡階段的作用，將對正確理解RAS免疫調(diào)節(jié)作用有重要意義。而最新研究血管緊張素II促進(jìn)小鼠脾細(xì)胞自發(fā)增殖，和在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中增殖，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利抑制T淋巴細(xì)胞AICD和Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡，提示RAS信號和正常的免疫反應(yīng)CD3/TCR信號和時間動力學(xué)能起協(xié)同作用。本項目1）以人周圍血T淋巴細(xì)胞為實驗對象，以CD3/TCR信號刺激T細(xì)胞激活增殖、和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）兩階段為主，從時間動力學(xué)角度，力圖從總體上把握RAS對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用。2）重點分析RAS對T細(xì)胞AICD的調(diào)節(jié)作用，初步分析RAS對腫瘤介導(dǎo)的T細(xì)胞AICD這一重要免疫逃避機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。從動力學(xué)角度分析RAS對T淋巴細(xì)胞增生和凋亡的調(diào)節(jié)作用，有助于真正明確RAS的免疫調(diào)節(jié)作用和機(jī)制，從而為發(fā)展新的免疫調(diào)節(jié)手段開辟途徑。由于包括胃癌和肝癌等多種腫瘤組織低表達(dá)或不表達(dá)RAS8,多種成熟的和高特異性的RAS干預(yù)手段和藥物的存在，預(yù)示著調(diào)節(jié)RAS在調(diào)節(jié)腫瘤免疫和腫瘤免疫治療方面的廣泛前景。國內(nèi)外的研究現(xiàn)狀RAS在心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞等多種組織和細(xì)胞的增生和凋亡調(diào)節(jié)作用及其信號傳導(dǎo)通路已進(jìn)行了深入研究，證明RAS對細(xì)胞增生和凋亡起重要調(diào)節(jié)作用。近兩年來RAS對免疫的調(diào)節(jié)作用逐漸引起重視，目前已經(jīng)證明：1）T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞表達(dá)RAS各組成成分；2）血管緊張素II能通過AT1受體促進(jìn)T細(xì)胞增殖 ，敲除小鼠AT1受體能阻斷ANGII的作用；3）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑卡托普利抑制T淋巴細(xì)胞AICD和Fas/FasL介導(dǎo)的凋亡；4）血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對免疫性炎癥有保護(hù)作用; 5)RAS參與T細(xì)胞的calcineurin/NFAT信號傳導(dǎo)通路。但尚有幾個關(guān)鍵問題沒有解決：1）大多數(shù)實驗結(jié)果來源于動物實驗；2）大部分研究局限于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑，而未對RAS進(jìn)行系統(tǒng)性的研究。3）雖然提示RAS對T細(xì)胞的增生凋亡均有促進(jìn)作用，但未闡明RAS如何調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞增生和凋亡這兩種看起來相反的作用，以及RAS對細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的最終效果；4）未闡明RAS調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞功能的信號傳導(dǎo)通路和細(xì)胞周期的調(diào)控機(jī)制。RAS在腫瘤免疫方面的研究國內(nèi)外尚是空白。 3 三、研究方案1. 研究目標(biāo)、研究內(nèi)容和擬解決的關(guān)鍵問題研究目標(biāo)1） 檢測RAS各組成成分在淋巴細(xì)胞的mRNA和蛋白表達(dá)。2） 從時間動力學(xué)角度，以T細(xì)胞激活增殖、和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）兩階段為主，在免疫反應(yīng)的包括：靜止-激活（細(xì)胞因子分泌）-增生/分化-免疫下調(diào)（細(xì)胞凋亡和記憶細(xì)胞形成）過程中的不同階段，分析 RAS的表達(dá)變化，分析RAS對T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、增生和凋亡（AICD）的影響。3） 探討RAS對T淋巴細(xì)胞AICD調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制。4） 檢測RAS在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，初步探討RAS對腫瘤介導(dǎo)的T細(xì)胞AICD這一重要免疫逃避機(jī)制的調(diào)節(jié)作用。研究內(nèi)容1） 收集健康志愿者新鮮周圍血PBMC，采用CD3單克隆抗體刺激T細(xì)胞，輔以IL-2，制作T細(xì)胞多克隆激活免疫反應(yīng)和AICD的模型。根據(jù)T細(xì)胞的表型（phenotype：包括細(xì)胞因子分泌情況和表面分子marker的表達(dá)）對免疫反應(yīng)進(jìn)行分期。2） 分析 RAS對于T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、增生和凋亡的影響，明確RAS免疫調(diào)節(jié)作用的時間動力學(xué)。在T細(xì)胞激活增殖、和激活誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（AICD）兩階段：a) 定性和定量測定RAS組成成分（血管緊張素原、AngII和AT1受體）的表達(dá)及其變化情況。b) 采用AngII、ACEI(包括Captopril和Enalapril)和AT1受體特異阻斷劑（Losartan）在不同層次上對RAS進(jìn)行干預(yù)，分析 RAS對于T細(xì)胞細(xì)胞因子分泌、增生和凋亡的影響。3） 從細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制明確RAS的對T細(xì)胞凋亡和AICD的調(diào)節(jié)機(jī)制。檢測T細(xì)胞兩條主要凋亡通路的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)分子：Bcl-2(線粒體/細(xì)胞色素C凋亡途徑)，F(xiàn)LIP（AICD，F(xiàn)as/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑），分析RAS調(diào)節(jié)何種T細(xì)胞凋亡通路，及其在傳導(dǎo)通路上的調(diào)節(jié)作用點。4） 收集同一腫瘤患者的PBMC和腫瘤切除標(biāo)本中的腫瘤細(xì)胞并培養(yǎng)，定性定量測定腫瘤細(xì)胞的RAS組成成分表達(dá)。制作MHC限制的腫瘤細(xì)胞免疫抑制和腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞AICD模型，分析RAS對腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞AICD的調(diào)節(jié)作用。擬解決的關(guān)鍵問題：1） 明確RAS在免疫反應(yīng)不同階段的作用，在免疫反應(yīng)過程中的免疫調(diào)節(jié)作用的動力學(xué)，以及RAS免疫調(diào)節(jié)作用的綜合效果。2） 明確RAS對T細(xì)胞AICD調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞信號傳導(dǎo)機(jī)制。3） 制作MHC限制的腫瘤細(xì)胞免疫抑制和腫瘤誘導(dǎo)T細(xì)胞AICD模型。4） 合理選用RAS干預(yù)手段，調(diào)整RAS調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)腫瘤免疫。42. 擬采取的研究方法、技術(shù)路線、實驗方案及可行性分析研究方法a) 細(xì)胞生物學(xué)方法：腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)；人周圍血T淋巴細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和激活。b) 分子生物學(xué)方法：免疫組化、RT-PCR、western blot、Northern Blot定性定量測定c) 免疫學(xué)方法：流式細(xì)胞儀測量細(xì)胞周期、雙染色測定細(xì)胞凋亡；H3攝入測定細(xì)胞增生活性，JAM-Test定量測定細(xì)胞凋亡；免疫熒光法測定Caspase3活性。腫瘤細(xì)胞/淋巴細(xì)胞混合培養(yǎng)。技術(shù)路線分為兩部分，兩部分有交叉5實驗方案說明：可行性分析本課題思路明確，技術(shù)路線可行，課題組成員均參加過省部級項目研究，具備相關(guān)實驗技術(shù)和方法；已熟練掌握課題中所需要的細(xì)胞分子生物學(xué)技術(shù)，免疫學(xué)技術(shù)，流式細(xì)胞術(shù)，而且大部分技術(shù)在以往或正在進(jìn)行的項目中使用；本課題組具有治療普外科腫瘤包括胃癌、肝癌的豐富臨床經(jīng)驗，在胃癌的免疫治療方面較有心得。以上情況說明我們有能力在此領(lǐng)域開展深入研究。本項目的創(chuàng)新之處：1. 率先開展對組織腎素血管緊張素系統(tǒng)對細(xì)胞免疫的調(diào)節(jié)作用的深入研究，結(jié)合細(xì)胞滿意動力學(xué)分析明確RAS的免疫調(diào)節(jié)作用，并深入研究起作用的信號傳導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制。目前尚未發(fā)現(xiàn)對RAS免疫調(diào)節(jié)作用較為系統(tǒng)的研究及相關(guān)文獻(xiàn)。2. 率先開展RAS對腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用的探討，本研究可能的RAS干預(yù)方法機(jī)制調(diào)節(jié)腫瘤免疫。目前國內(nèi)外在此方面尚是空白。4. 年度研究計劃及預(yù)測進(jìn)展20XX年1月20XX年12月：收集胃癌、肝癌組織標(biāo)本。測定腫瘤組織RAS表達(dá)與正常組織的差別。20XX年1月20XX年5月：人周圍血淋巴細(xì)胞RAS表達(dá)的檢測20XX年3月20XX年7月：完成Northern Blot、western Blot、RT-PCR等檢測技術(shù)、CD3抗體/IL-2激活淋巴細(xì)胞、增生和凋亡檢測等的技術(shù)考核。20XX年8月20XX年3月：完成RAS對免疫細(xì)胞增生、凋亡和細(xì)胞因子分泌的作用檢測。20XX年4月20XX年5月：階段總結(jié)，合理調(diào)整思路，準(zhǔn)備對RAS調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。20XX年5月20XX年12月：RAS免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路的研究。20XX年1月20XX年5月：RAS免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞周期調(diào)控的研究。20XX年6月20XX年9月：RAS對腫瘤免疫調(diào)節(jié)的初步研究。20XX年10月20XX年12月：統(tǒng)計數(shù)據(jù)，結(jié)合分析得出結(jié)論。5. 預(yù)期研究成果1）明確RAS在T淋巴細(xì)胞表達(dá)情況。2）明確腫瘤細(xì)胞RAS表達(dá)的變化。3）明確RAS在免疫反應(yīng)不同階段和過程中的免疫調(diào)節(jié)作用的動力學(xué)。4）與正常細(xì)胞免疫動力學(xué)結(jié)合分析，得出RAS免疫調(diào)節(jié)作用的綜合效果。5）采用合理的RAS干預(yù)手段，能調(diào)節(jié)RAS調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫。6）采用合理的RAS干預(yù)手段，能調(diào)節(jié)RAS調(diào)節(jié)腫瘤免疫。填寫提綱一、立項依據(jù)：與選題直接相關(guān)的國內(nèi)外現(xiàn)狀、水平和發(fā)展趨勢；選題的理論和實踐依據(jù)；研究目的、意義；本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會經(jīng)濟(jì)效益和應(yīng)用推廣前景。二、科研假說或技術(shù)構(gòu)思，主要研究內(nèi)容、關(guān)鍵技術(shù)、目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)），技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。三、研究試驗方法及技術(shù)路線（工藝路線）。四、現(xiàn)有工作條件和基礎(chǔ)：開展本項研究的技術(shù)優(yōu)勢，現(xiàn)有的主要儀器設(shè)備及應(yīng)用合格實驗動物的基本條件等；已有工作基礎(chǔ)，預(yù)試驗情況。五、計劃進(jìn)度：根據(jù)總的研究期限、年度計劃進(jìn)度，分別列出具體的目標(biāo)和進(jìn)度的考核指標(biāo)。六、參加（協(xié)作）單位意見及具體分工（附協(xié)議書）。七、經(jīng)費(fèi)概算（包括其他部門的撥款、貸款、自籌記憶取得的自主）和核算依據(jù)，以及分年度使用計劃。填寫說明一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂整齊后按申報要求上報。二、填寫提綱所列內(nèi)容，要全面詳細(xì)、如實填寫。三、封面上“登記序號”“項目編號”請勿填寫。1、 立項依據(jù)1.1 研究目的、意義骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）又稱退行性關(guān)節(jié)病，以關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生彌漫性龜裂、纖維化和脫失及因骨組織增生性變化為特征的一組臨床征候群，是多見于中年以后的慢性進(jìn)行性關(guān)節(jié)疾患。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前2億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎4500萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?0%，在老年人中所占比例更高，50歲以上人群中，OA的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。在我國，根據(jù)流行病學(xué)調(diào)查顯示，5564歲的人群中發(fā)病率達(dá)40%，而65歲以上人群的患病率達(dá)60%90%。隨著計劃生育政策的長久實施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國已進(jìn)入老齡化社會，OA的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負(fù)擔(dān)。同時世界其他國家也面臨著同樣的問題，因而OA引起了國際、國內(nèi)醫(yī)學(xué)界的相當(dāng)重視。近年來對OA的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。西藥治療OA的主要手段是非甾體藥，但存在副作用大、作用單一及有較多禁忌癥等缺點。雖然中藥治療OA也取得了一些經(jīng)驗，但對其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療OA的療效在國際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。1.2 國內(nèi)外現(xiàn)狀水平和發(fā)展趨勢近十年來，國內(nèi)外對OA進(jìn)行了較深入地研究，大致歸納如下：1.2.1 流行病學(xué)研究已廣泛開展在近100種不同類型的關(guān)節(jié)疾病中，OA是影響人類健康最常見的關(guān)節(jié)疾患之一，沒有明顯的種族和地域差異，本病的患病率隨年齡增加而增高，故隨著人類平均壽命的延長，患病率也有增高的趨勢。Felson等報道70歲以下人群膝OA患病率為7%（男6.4%，女11.4%），80歲以上為11.2%（男5.4%，女15.8%）；而放射學(xué)膝OA70歲以上為27.4%（男30.4%，女25.1%），80歲以上為43.7%。Butter等報道，44歲以下、4559歲、60歲以上人群中，放射血OA 患病率各為6.2%、21.6%和42.0%。國內(nèi)陳順樂等隊13541名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性O(shè)A患病率2.2%；無癥狀性O(shè)A患病率53%，其中3039、4049、5059歲患病率各為11%、27%和62%。汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院統(tǒng)計551例，結(jié)果40歲以下、4049、5059和60歲以上各占12.2%、17.4%、26.1%和44.3%。另外不同關(guān)節(jié)OA易感性不同。美國在衛(wèi)生統(tǒng)計中心調(diào)查結(jié)果，OA患病率以手最高，以下依次為足、膝、髖。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果OA是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。本病性別差異在脊柱差別不大，但手、膝、髖OA均以女性較多，且女性骨關(guān)節(jié)炎的遺傳易感性較男性高。在Framingham的研究中，F(xiàn)elaon等發(fā)現(xiàn)女性體重減少11磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險相應(yīng)減少50%。 Saase等調(diào)查結(jié)果，膝OA患病率男、女峰值分別為24.7%和54.6%。根據(jù)1994年統(tǒng)計，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為155億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的3倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在我國雖未作全國大范圍的普查，但隨著老齡化社會進(jìn)程的不斷加快，OA的發(fā)病率會越來越高，這必將給家庭、社會帶來沉重負(fù)擔(dān)。1.2.2 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是OA的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對OA關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。骨內(nèi)高壓持續(xù)增高存在下關(guān)節(jié)滑液pH值下降，成分改變，干擾并破壞了軟骨細(xì)胞的正常代謝導(dǎo)致細(xì)胞變性壞死，膠原纖維解聚，蛋白多糖分解，軟骨下骨破壞、修復(fù)，最終產(chǎn)生骨性關(guān)節(jié)炎。自由基學(xué)說：認(rèn)為自由基對軟骨細(xì)胞DNA和PG的合成具有抑制作用。自由基作用軟骨細(xì)胞后，引發(fā)膜脂質(zhì)過氧化，使脂質(zhì)過氧化代謝產(chǎn)物丙二醛增多，丙二醛可與DNA發(fā)生交聯(lián)，自由基也可直接攻擊軟骨細(xì)胞DNA即合成DNA所需的酶，使DNA鏈斷裂、堿基損傷從而影響了DNA的合成，也造成前列腺（PG）合成障礙。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作用能釋放大量O2-和H2O2；細(xì)胞因子學(xué)說：細(xì)胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素-1（IL-1）、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子（TNF）等在OA中水平明顯增高。IL-1具有刺激軟骨細(xì)胞分泌一氧化氮、前列腺E和IL-6的作用，引起滑膜炎癥和疼痛，同時IL-1也是軟骨基質(zhì)降解的主要驅(qū)動因子；軟骨酶降解學(xué)說：OA軟骨細(xì)胞的基質(zhì)降解酶類的合成與分泌率明顯增加，并與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。酸性和中性蛋白酶可以降解蛋白多糖的核心蛋白。基質(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。在滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1和TNF的作用下，軟骨細(xì)胞以酶原的形式分泌大量的基質(zhì)金屬蛋白酶，而對金屬蛋白酶組織抑制劑無影響，使二者失衡從而增加對軟骨主要成分型膠原和蛋白聚糖合成的抑制作用，使軟骨進(jìn)行性破壞；一氧化氮學(xué)說：NO是一種細(xì)胞間信使分子，可介導(dǎo)許多生物學(xué)現(xiàn)象。NOS可催化重要炎性介質(zhì)NO的產(chǎn)生，OA患者血清、滑液中NO含量明顯高于正常。NO可通過抑制軟骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡，改變蛋白多糖和膠原蛋白的合成與分泌功能，同時使軟骨細(xì)胞分泌透明質(zhì)酸減少，滑膜粘蛋白解聚，抑制軟骨細(xì)胞合成軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨細(xì)胞糖酵解，使軟骨破壞。細(xì)胞凋亡學(xué)說：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。凋亡小體存在于軟骨細(xì)胞小孔或間隙內(nèi)，其產(chǎn)生的焦磷酸鹽能從溶液中沉積鈣，有NTPPH（nucleosid triphosphate pyrophos phohydrolase）和堿性磷酸酶作用,造成余下軟骨細(xì)胞修復(fù)過程失敗，而逐漸發(fā)展成關(guān)節(jié)軟骨的完全丟失。OA軟骨細(xì)胞凋亡主要通過兩種相互獨立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑,由NO介導(dǎo);另一種是同滑膜炎癥相關(guān)的途徑,由Fas介導(dǎo)。典型的OA不存在明顯的炎癥反應(yīng),此時軟骨細(xì)胞凋亡以NO途徑為主;當(dāng)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)時,則通過as途徑加劇軟骨細(xì)胞凋亡和關(guān)節(jié)破壞。NO通過兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。一是高濃度的NO能抑制多種與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及檸檬酸循環(huán)有關(guān)的酶,從而抑制線粒體呼吸,造成組織損傷;二是NO與超氧化陰離子2-反應(yīng),生成氧化亞硝基陰離子ONOO-,在酸性條件下(如病理條件)迅速分解為OH-和NO2自由基,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性,可造成組織細(xì)胞損傷。在OA患者中,受損區(qū)軟骨細(xì)胞的凋亡比例明顯高于未受損區(qū)。Fas表達(dá)的結(jié)果與其相符,OA受損區(qū)的Fas表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū),提示Fas表達(dá)可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。除NO途徑和Fas途徑外,還有一些因素可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞凋亡、關(guān)節(jié)破壞,如IL-1、IL-8、TNF-、PGE2、Aggrecan G1區(qū)等。1.2.3 治療方面有了不少新方法目前中西醫(yī)治療OA的藥物較多，西藥治療OA主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響，OA多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運(yùn)動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療OA的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問世。關(guān)節(jié)清理術(shù)、膝關(guān)節(jié)置換術(shù)，適應(yīng)癥較少，費(fèi)用高，創(chuàng)傷大，病人難以接受。中哦藥治療OA的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：多屬臨床經(jīng)驗，無對照組，特別是西藥對照組觀察，處方不固定。缺乏用客觀的最新的國際公認(rèn)的、量化的臨床觀察指標(biāo)及療效判斷標(biāo)準(zhǔn)為手段來尋找治療OA的中藥。未針對OA發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動物試驗從生化、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來探討中藥的藥物作用機(jī)理。缺乏高效的、作用綜合、副作用小的新藥。中醫(yī)認(rèn)為OA屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為OA的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。周尊謙等人在傳統(tǒng)中醫(yī)理論基礎(chǔ)上，闡述了膝OA骨內(nèi)高壓血瘀證氧自由基之間的密切關(guān)系；謝林等論述了膝OA與血瘀證之間的內(nèi)在聯(lián)系，旨在為運(yùn)用活血化淤藥治療OA提供理論依據(jù)。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。獨活寄生湯是用于治療風(fēng)寒濕痹、關(guān)節(jié)疼痛和腦血管后遺癥的傳統(tǒng)固防，具有補(bǔ)肝腎、活血通絡(luò)之功，臨床常見本方加減治療OA，療效比較肯定。朱健兒以本方加味治療262例，總有效率94.7%。單文龍等用本方加減治療骨關(guān)節(jié)炎24例，有效率為87.5%。陸智報道用本方加減治療104例，總有效率91.3%。1.2.4 實驗研究方面有了較大的進(jìn)展隨著對OA發(fā)病機(jī)理的不斷深入認(rèn)識，對OA的實驗研究方面也開始了向多層次多角度的方向發(fā)展。動物實驗不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗，現(xiàn)已使用針對OA的動物實驗，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測。目前實驗研究內(nèi)容主要有以下幾個方面，研究最多的是OA的血液流變學(xué)、氧自由基及一氧化氮含量等，這些試驗一般均可通過建立骨關(guān)節(jié)炎的模型來完成，也可通過使用其它相似的模型檢測相關(guān)指標(biāo)來進(jìn)行，如可建立急性血淤模型來檢查血液流變學(xué)指標(biāo)，使用老齡動物通過檢測體內(nèi)SOD及MDA含量推斷藥物的抗氧自由基的能力等。在NO對OA影響的實驗中，一般采用硝酸還原酶法來測定NO含量，運(yùn)用PT-PCR技術(shù)測定NOS基因表達(dá)。IL-1、IL-6、TNF等細(xì)胞因子、軟骨降解酶尤其是基質(zhì)金屬蛋白酶、誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜炎癥的物質(zhì)如纖溶酶原/纖溶酶原激活物和前列腺素PGE2、軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡及增殖情況、性激素水平等也越來越多地被作為檢測指標(biāo)使用到實驗研究中來。1.3 選題的理論和實踐依據(jù)祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。我們認(rèn)為OA病人除了肝腎虧虛，寒濕痹阻外，一般OA病人體重超重較多，也即為痰濕偏盛之體，另外脾虛生濕及寒濕痹阻日久濕聚成痰，痰淤交阻是引起膝關(guān)節(jié)腫脹畸形、活動受限的重要因素，所謂頑癥怪病皆質(zhì)之于痰淤。基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對OA發(fā)病機(jī)理的深入研究，我們在補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于1995年即對備急千金要方中的獨活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于1999年采用痛痹顆粒的組方治療膝OA，方中以獨活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達(dá)四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。諸藥合用共起補(bǔ)肝腎、祛風(fēng)濕、化瘀痰之功，冀能消炎止痛，保護(hù)軟骨。通過36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。因此有必要對痛痹顆粒治療骨性關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制尤其是該方對軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡與增殖機(jī)理做進(jìn)一步的研究，冀能證實痛痹顆粒的臨床療效，明確其作用機(jī)制，并初步探討本病發(fā)病的可能機(jī)理，為新藥問世提供客觀的依據(jù)，所以進(jìn)行設(shè)計并立題。1.4本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會效益和應(yīng)用推廣前景1.4.1繼承和發(fā)揚(yáng)祖國醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實驗研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝OA模型，從發(fā)病機(jī)理探討本藥的作用機(jī)制。本實驗采用可靠地國際公認(rèn)的方法復(fù)制動物模型，并采用最新的檢測指標(biāo)IL-1、TNF、SOD、MDA、NO等，總之本研究基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對OA發(fā)病機(jī)制的最新研究成果，從生化、免疫等多個角度多個層次，系統(tǒng)觀察并進(jìn)行歸納總結(jié)，確保本課題不但可行而且先進(jìn)，冀能填補(bǔ)省內(nèi)外運(yùn)用中藥治療OA的空白，并希望以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步從細(xì)胞水平（包括本藥對軟骨細(xì)胞及細(xì)胞凋亡與增殖的影響）研究中藥對OA的長久作用及影響，從而達(dá)到擠身國際先進(jìn)水平的目的，讓中藥真正走向世界。1.4.2目前，中藥治療OA的方法頗多，但大多以臨床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機(jī)理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認(rèn)療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療OA的療效機(jī)理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。而痛痹顆粒是在中醫(yī)理論指導(dǎo)下選用千金要方中獨活寄生湯進(jìn)行加減所得，并采用可靠的實驗?zāi)Ｐ图白钚碌膰H公認(rèn)的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行實驗研究，觀察其對OA的確切療效及作用機(jī)理，這必將對OA的中醫(yī)理論產(chǎn)生較大影響，同時對臨床治療也起到更好的指導(dǎo)作用，從而產(chǎn)生較好的社會經(jīng)濟(jì)效益。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入WTO與國際接軌的進(jìn)程的不斷完善，祖國醫(yī)學(xué)國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中發(fā)掘出的治療OA的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進(jìn)行研究總結(jié)，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。2.科研假說或技術(shù)構(gòu)想：主要內(nèi)容、技術(shù)關(guān)鍵目的，技術(shù)特征及創(chuàng)新之處，開發(fā)項目應(yīng)說明開發(fā)規(guī)模。2.1主要內(nèi)容2.1.1探討OA的病因病機(jī)，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。2.1.2運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，開展實驗研究，從分子生物學(xué)、免疫學(xué)、生理生化學(xué)等多方面來探討“痛痹顆粒”治療膝OA的療效機(jī)制及藥理毒理作用。2.2主要技術(shù)關(guān)鍵2.2.1膝OA模型的復(fù)制目前所使用的OA動物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo)OA產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動物自發(fā)OA，如C57黑鼠等。在選擇動物模型時一般應(yīng)考慮動物的種屬（包括其生活習(xí)性、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)、組織學(xué)及病理學(xué)特征）、不同方法的造模機(jī)制和OA模型的特點，并應(yīng)參照研究目的加以選擇。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復(fù)制出較成功較高的OA模型，且操作較為簡單。具體的造模機(jī)制在于低應(yīng)力可以造成軟骨厚度減少，SO染色變淡，水分增加，蛋白聚糖聚集度損傷等變化，木瓜蛋白酶作為一種蛋白水解酶會引起關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復(fù)制動物模型。用于動物模型的動物一般有狗、兔、鼠等，我們選用大鼠做OA模型，因為該模型關(guān)節(jié)軟骨退變的組織學(xué)特征與人類相似，且動物來源較廣泛，且經(jīng)濟(jì)。2.2.2關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)基于來源廣泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)所得。軟骨需在嚴(yán)格無菌的條件下分離，經(jīng)過一系列的漂洗、消化等工作后獲取軟骨細(xì)胞。目前還沒有專門用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有199、1640、F12、改良Eagle等，國內(nèi)的有199、1640、DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占15%），一般以使用DMEM培養(yǎng)液居多。在培養(yǎng)液中還含有一些輔助添加劑，包括25mmol/L Hepes、1mmol/L 丙酮酸鈉、2mmol/L 谷氨酰胺、50umol/L 二硫基乙醇以及10萬單位/L的青霉素和10萬單位/L的鏈霉素，PH7.4。培養(yǎng)過程中一般使用5%CO237的恒溫培養(yǎng)箱。2.2.3采用的檢測手段及指標(biāo)在病理組織形態(tài)學(xué)的檢查中，一般采用以下幾個觀察指標(biāo)：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；HE染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；Masson三色染色觀察膠原的變化；Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學(xué)評分，評分方法按Mankin法；電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。在細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)檢測中，我們采用MTT法檢測軟骨細(xì)胞的增殖能力，用全自動生化分析儀對檢測總蛋白含量，使用細(xì)胞流式儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的測定，對iNOS、NO含量的測定則使用分型NOS試劑盒和NO試劑盒。2.3目標(biāo)（達(dá)到的主要技術(shù)指標(biāo)或技術(shù)經(jīng)濟(jì)指標(biāo)）、技術(shù)特征及創(chuàng)新之處。現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合，深入研究中醫(yī)藥治療OA的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更加科學(xué)有利的客觀依據(jù)，發(fā)揮中醫(yī)藥治療OA的特色和優(yōu)勢，為臨床常見、嚴(yán)重影響人類健康的OA研究出有效、安全、便于推廣應(yīng)用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，大大減輕病人痛苦，降低膝骨關(guān)節(jié)炎的致殘率和復(fù)發(fā)率，且副作用小的簡、便、廉、驗的中藥制劑問世。治療膝OA的新藥生產(chǎn)及對其在治療中所起作用機(jī)制的深入探討，既符合國情又能夠走向世界，產(chǎn)生較大的社會和經(jīng)濟(jì)效益，這必然形成高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)入高新領(lǐng)域，對促進(jìn)科技進(jìn)步，發(fā)展中醫(yī)藥，有著積極的作用，同時這也是中藥現(xiàn)代化研究的發(fā)展方向和新的探索。3.實驗研究方法及技術(shù)路線。3.1對實驗性大鼠骨性關(guān)節(jié)炎的防治作用 OA模型的制備：（1）取SD雄性大鼠50只，體重200220g，固定，常規(guī)備皮消毒，沿髕韌帶內(nèi)側(cè)緣切口，切斷雙后肢內(nèi)側(cè)副韌帶及膝前內(nèi)側(cè)筋膜擴(kuò)張部，并在斷端處修剪去除約2mm，造成雙后肢膝外翻畸形。術(shù)后第二天放造模大鼠于拖箱內(nèi)每天趕其行走30m。（2）取SD雄性大鼠50只，體重200220g，4%木瓜蛋白酶溶液與0.03mol/L半胱氨酸溶液1：1混置0.5小時后，分別在第1、3、5、7天于實驗大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入混合液20ul。方法：將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（維骨力組）、治療組，另設(shè)正常對照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù)7周。七周后將動物麻醉后，立即將大鼠以仰臥位固定，頸總?cè)⊙尤朐嚬苤校?000rmp15min離心獲取含藥血清；切開關(guān)節(jié)囊，進(jìn)行大體觀察后，然后以銳利刀片切取膝關(guān)節(jié)前正中部分的滑膜組織，作HE染色，電鏡下觀察。再用銳利刀片切取股骨內(nèi)倮軟骨使其呈2mm1mm全層軟骨標(biāo)本，2.5%戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。所余之股骨內(nèi)倮連同軟骨下骨一并切下，10%福爾馬林溶液固定24小時以上，分別作HE、沙紅-O及Masson三色染色后光鏡檢查，取樣后即可將動物處死。觀察指標(biāo)：大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況；HE染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化；Masson三色染色觀察膠原的變化；Sanfranin-O即沙紅O染色用于組織學(xué)評分，評分方法按Mankin法（附評分等級表如下）；電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。評分等級.結(jié)構(gòu)正常 0表面結(jié)構(gòu)微小不規(guī)則 1表面結(jié)構(gòu)中等不規(guī)則 2表面結(jié)構(gòu)嚴(yán)重不規(guī)則 3過渡層出現(xiàn)裂隙 4輻射層出現(xiàn)裂隙 5鈣化層出現(xiàn)裂隙 6過渡層消失 7輻射層消失 8鈣化層消失 9結(jié)構(gòu)完全破壞 10.細(xì)胞1. 切線的區(qū)域正常 0細(xì)胞腫脹 1細(xì)胞消失 22. 過渡和輻射的區(qū)域正常 0少量的細(xì)胞增多 1中等量的細(xì)胞增多 2大量的細(xì)胞增多 3少量的克隆 4中等量的克隆 5大量的克隆 6少量的細(xì)胞減少 7中等量的細(xì)胞減少 8大量的細(xì)胞減少 9細(xì)胞消失 10.變異標(biāo)記 完整 0多層 1模糊 2血管的交叉 3.血管翳形成沒有 0少量 1中等量 2大量 33.2 對體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的影響 3.2.1 兔膝軟骨細(xì)胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關(guān)節(jié)，用刀片取關(guān)節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖液（PBS）的無菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，反復(fù)清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細(xì)切至不大于1mm3。切碎后將其裝入10u試管內(nèi)，按1：10量加入消化酶類進(jìn)行化學(xué)解離。先用0.25%胰酶消化30min，然后去除胰酶，加入0.2%膠原酶消化78小時后，1500rpm10min離心，棄上清，加入PBS，搖勻在同上離心棄上清，在加PBS反復(fù)三次，最后一次加含15%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻，200目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中， 5%CO237培養(yǎng)箱培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用0.25%胰酶消化傳代。3.2.2 對軟骨細(xì)胞增殖反應(yīng)的作用 將在培養(yǎng)瓶中長滿的細(xì)胞消化，接入96孔培養(yǎng)板中，100ul/孔， 待細(xì)胞長成單層后，將舊液棄去，用PBS輕輕蕩洗一遍，然后加入含藥血清，100ul/孔，每組4個復(fù)孔。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育72h后，取上清液。每孔加入MTT試劑20ul（5g/L）既無血清培養(yǎng)液100ul，再孵育4h。取上清，每孔加入200ul溶甲瓚液，以主波長570nm，參比波長690nm于酶標(biāo)儀上比色，讀取吸光度（A）值。3.2.3 對軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡的影響 單層細(xì)胞培養(yǎng)板制作同上，加入含藥血清，每組4個復(fù)孔，于5%CO237培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，棄去舊液，用0.25%胰酶消化待細(xì)胞有變圓趨勢即取出消化液，加入PBS，用吸管輕輕吹打，使成單個細(xì)胞懸液，移入離心管離心，1000rpm，5min，去掉上清液，約留0.5ml細(xì)胞懸液，用振蕩器使細(xì)胞分散，用細(xì)滴管或注射器將細(xì)胞迅速注入4冷乙醇中（乙醇終濃度為70%），用細(xì)胞流式儀檢測凋亡細(xì)胞數(shù)目，計算凋亡百分率。3.2.4 對軟骨細(xì)胞蛋白合成和NO含量的影響 同樣將各組含藥血清加入已長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h后，收集上清液，用全自動生化分析儀檢測總蛋白含量，用分型NOS試劑盒和NO試劑盒檢測各組iNOS、NO含量。3.2.5 拆方后對軟骨細(xì)胞的影響 進(jìn)行拆方實驗，篩選出補(bǔ)肝腎組方、祛風(fēng)濕組方和化瘀痰組方三組，對這三組及復(fù)方分別進(jìn)行體外的軟骨細(xì)胞實驗，設(shè)立陽性對照組（維骨力組）：細(xì)胞毒性實驗 將各組方藥液用培養(yǎng)基分別配成幾個待測濃度，加入已長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)，分別觀察24h、48h、72h細(xì)胞形態(tài)的變化，選擇細(xì)胞不發(fā)生變圓、萎縮、漂浮的最大濃度為藥物對細(xì)胞的最大無毒濃度，以便繼續(xù)實驗。對軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、增殖、NO含量及iNOS基因表達(dá)的影響 將各組方藥液分別配置成最大無毒濃度，加入已長成單層軟骨細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，具體檢測操作則同加入含藥血清的實驗。4.現(xiàn)有工作條件和基本條件本課