118 十 體外哺乳動物細胞基因突變試驗十 體外哺乳動物細胞基因突變試驗 In Vitro Mammalian Cell Gene Mutation Test 1 范圍范圍 本規范規定了體外哺乳類細胞基因突變試驗的基本原則 要求和方法 本規范適用于檢測化妝品原料及其產品的致突變性 2 規范性引用文件規范性引用文件 OECD Guidelines for Testing of Chemicals No 476 1997 3 試驗目的試驗目的 該測試系統用于檢測化妝品原料及其產品引起的突變 包括堿基對突變 移碼突變和缺 失等 從而評價受試物引起突變的可能性 4 定義定義 正向突變 Forward mutation 從原型至突變子型的基因突變 這種突變可引起酶和功 能蛋白的改變 突變頻率 Mutant frequency 所觀察到的突變細胞數與存活細胞數之比值 5試驗原理試驗原理 在加入和不加入代謝活化系統的條件下 使細胞暴露于受試物一定時間 然后將細胞再 傳代培養 突變細胞在含有 6 硫代鳥嘌呤 6 thioguanine 6 TG 或三氟胸苷 trifluorothymidine TFT 的選擇性培養液中能繼續分裂并形成集落 基于突變集落數 計 算突變頻率以評價受試物的致突變性 6 試驗方法試驗方法 6 1 試劑和受試物制備 6 1 1 受試物 6 1 1 1 受試物的配制 固體受試物需溶解或懸浮于溶劑中 用前稀釋至適合濃度 液體受 試物可以直接加入試驗系統 或用前稀釋至適合濃度 受試物應在使用前新鮮配制 否則就必 須證實儲存不影響其穩定性 6 1 1 2 溶劑的選擇 溶劑必須是非致突變物 不與受試物發生化學反應 不影響細胞存活 和 S9 活性 首選溶劑是水或水溶性溶劑 二甲基亞砜 DMSO 也是常用溶劑 但使用時濃 度不應大于 0 5 6 1 1 3 受試物濃度設置 6 1 1 3 1 最高濃度的選擇 決定最高濃度的因素是細胞毒性 受試物在試驗系統中的溶解 度以及 pH 或滲克分子濃度 osmolality 的改變 6 1 1 3 2 細胞毒性的確定 應使用指示細胞完整性和生長情況的指標 在活化系統存在或 不存在兩種條件下確定細胞毒性 例如相對集落形成率或相對細胞總生長情況 total growth 應在預試驗中確定細胞毒性和溶解度 6 1 1 3 3 劑量設置 119 至少應設置 4 個可供分析的濃度 當有細胞毒性時 其濃度范圍應包括從最大毒性至幾 乎無毒性 通常濃度間隔系數不大于 10 如最高濃度是基于細胞毒性 那么該濃度組的細胞相對存活率 相對集落形成率 或相 對細胞總生長情況應為 10 20 不低于 10 對于那些細胞毒性很低的化合物 最高濃度應是 5 L mL 5mg mL 或 0 0lmol L 對于相對不溶解的物質 其最高濃度應達到或超過在細胞培養狀態下的溶解度限值 最 好在試驗處理開始和結束時均評價溶解度 因為由于 S9等的存在 試驗系統內在暴露過程中 溶解度可能發生變化 不溶解性可用肉眼鑒別 但沉淀不應影響觀察 6 1 2 對照 在每一項試驗中 在代謝活化系統存在和不存在的條件下均應設陽性對照和陰 性 溶劑 對照 6 1 2 1 陽性對照 當使用代謝活化系統時 陽性對照物必須是要求代謝活化 并能引起突 變的物質 在沒有代謝活化系統時 陽性對照物可使用甲磺酸乙酯 ethyl methanesulfonate EMS 甲磺酸甲酯 methyl methanesulphonate MMS 乙基亞硝基脲 ethyl nitrosourea ENU 等 在有代謝活化系統時 可以使用 3 甲基膽蒽 3 methylcholanthrene 環磷酰胺 cyclophosphamide N 亞硝基胍 N nitroso dimethylamine 7 12 二甲基苯蒽等 也可使用 其他適宜的陽性對照物 6 1 2 2 陰性對照物 陰性對照 包括溶劑對照 除不含受試物外 其他處理應與受試物相 同 此外 當不具有實驗室歷史資料證實所用溶劑無致突變作用和無其他有害作用時 還應 設空白對照 6 1 3 細胞 HPRT 位點突變分析常用中國倉鼠肺細胞株 V 79 和中國倉鼠卵巢細胞株 CHO TK 位點突變分析常用小鼠淋巴瘤細胞株 L5178Y 和人類淋巴母細胞株 TK6 6 1 4 培養液 應根據實驗所用系統和細胞類型來選擇適宜的培養基 對于 V 79 或 CHO 細 胞 常用 MEM Eagle 培養基加入 10 胎牛血清和適量抗菌素 對于 L5178Y 或 TK6 細胞 常用 RPMI 1640 培養基加入 10 馬血清和適量抗菌素 6 1 5 活化系統 同體外哺乳類細胞染色體畸變試驗 6 1 6 選擇劑 6 硫代鳥嘌呤 6 TG 建議使用終濃度為 5mg mL 三氟胸苷 TFT 建 議使用終濃度為 3mg mL 6 2 試驗步驟 6 2 1 HPRT 位點突變分析 6 2 1 1 試驗前 1d 接種細胞于培養瓶中 置于 37 C 孵箱培養 6 2 1 2 試驗時吸去培養瓶中的培養液 加入一定濃度的受試物 S9 mix 不加入 S9 mix 的 樣品 用培養液補足 及一定量的不含血清培養液 置孵箱中處理 3h 6h 后 吸去培養液 用 Hank s 液洗細胞三次 加入含胎牛血清的培養液 6 2 1 3 在受試物與細胞作用后當天和第 3d 將細胞按低密度分種 在第 7d 接種細胞 每個 劑量 3 瓶 7d 后染色以測定細胞存活率 另將一定數量細胞接種于每個培養瓶中 每個劑 量 8 瓶 3h 后加入 6 TG 終濃度為 5mg mL 10d 后染色 計數突變細胞集落 6 2 1 4 試驗結果用 x 檢驗進行統計分析 6 2 2 TK 位點突變分析 L5178Y 細胞 96 孔板法 6 2 2 1 處理 取生長良好的細胞 調整密度為 5 105 mL 按 1 體積加入受試物 37 震 搖處理 3 小時 離心 棄上清液 用 PBS 或不含血清的培養基洗滌細胞 2 遍 重新懸浮細胞 于含 10 馬血清的 RPMI 1640 培養液中 并調整細胞密度為 2 105 mL 120 6 2 2 2 PE0 0 天的平板接種效率 測定 取適量細胞懸液 作梯度稀釋至 8 個細胞 mL 接種 96 孔板 每孔加 0 2 mL 即平均 1 6 個細胞 孔 每個劑量作 1 2 塊板 37 5 CO2 飽和濕度條件下培養 12d 計數每塊平板有集落生長的孔數 6 2 2 3 表達 步驟 6 2 2 1 所得細胞懸液作 2d 表達培養 每天計數細胞密度并保持密度在 106 ml 以下 6 2 2 4 PE2 第 2d 的平板接種效率 測定 第 2d 表達培養結束后 取適量細胞懸液 按步 驟 6 2 2 2 作梯度稀釋并接種 96 孔板 培養 12d 后計數每塊平板有集落生長的孔數 6 2 2 5 TFT 抗性突變頻率 MF 測定 第 2d 表達培養結束后 取適量細胞懸液 調整細 胞密度為 1 104 mL 加入 TFT 三氟胸苷 終濃度為 3 g mL 混勻 接種 96 孔板 每孔 加 0 2 mL 即平均 2000 個細胞 孔 每個劑量作 2 4 塊板 37 5 CO2 飽和濕度條件 下培養 12d 計數有突變集落生長的孔數 6 2 2 6 計算 6 2 2 6 1 平板效率 PE0 和 PE2 ln EW TW PE 1 6 式中 EW 為無集落生長的孔數 TW 為總孔數 1 6 為每孔接種細胞數 6 2 2 6 2 相對存活率 RS PE0 處理 相對存活率 RS PE0 對照 100 6 2 2 6 3 突變頻率 MF ln EW TW n MF 10 6 PE2 式中 EW 為無集落生長的孔數 TW 為總孔數 n 為每孔接種細胞數 2000 7 結果評價結果評價 在下列兩種情況下可判定受試物在本試驗系統中為陽性結果 1 受試物引起突變頻率具有統計學意義 并與劑量相關的增加 2 受試物在任何一個劑量條件下 引起具有統計學意義 并有可重復性的陽性反應 陰性結果的判定需在 RS 達 20 即已產生明顯細胞毒性 的情況下未見突變頻率顯 著增加時方可作出 在評價時應把生物學和統計學意義結合考慮 陽性結果表明受試物可引起所用哺乳類細胞的基因突變 可重復的陽性劑量 反應關系 意義更大 陰性結果表明在本試驗條件下 受試物不引起所用哺乳類細胞的基因突變 8 試驗報告試驗報告 試驗報告應包括以下內容 1 受試物名稱 有關的理化性狀 所用溶劑及其配制 劑量選擇 應說明受試物對細 胞毒性的測定方法 溶解情況等 2 細胞株名稱 3 實驗條件和方法 代謝活化系統 制備 S 時所用的誘導劑 動物品種和來源 S mix 的配方 對照物 陽性對照物名稱和使用濃度 陰性 溶劑 對照物名稱及使用濃度 培養液 所用培養液名稱 血清類別和使用濃度