一例規模豬場母豬正常分娩而死胎增加的病原診斷報告 夏 偉1，張宇輝1，馬迪楊1，危艷武2，劉長明2（1.哈爾濱維科生物技術開發公司，黑龍江 哈爾濱 150069；2.中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所豬傳染病研究室，黑龍江 哈爾濱 150001） 吉林省某規模豬場母豬存欄500多頭，2012年8月份向筆者反映豬場最近3個月以來經常出現正常分娩的母豬產仔死胎比例增加的現象，母豬未見任何異常癥狀，而且死亡的胎兒新鮮，體重較大，未見木乃伊化以及畸形；剖檢時發現死亡胎兒肺臟充血、出血、水腫、間質增寬；腎臟腫大,充血，臍帶出血等病理變化。為了確診該豬場母豬產仔死胎增加的病因，我們應用PCR,RT-PCR方法對常見的能夠引起母豬繁殖障礙的豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、偽狂犬病病毒(PRV)、細小病毒(PPV)、日本乙型腦炎病毒（JEV)進行了檢測，結果確診豬繁殖與呼吸綜合征變異毒株(HPPRRSV)，俗稱高致病藍耳病病毒是引起本場母豬產死胎增加的主要原因，關于高致病藍耳病病毒(HP-PRRSV)引起豬群母豬流產風暴和高熱性疾病的報道很多，但正常分娩而死胎增加為特征的病例報道較少，臨床上發病率較高而沒有引起普遍重視。因此本報告對高致病藍耳病病毒引起豬場群發性、持續性產死胎的臨床診斷具有重要的借鑒意義，我們將有關診斷報告如下。1 材料與方法1.1 病料來源采自吉林長春市某豬場死胎病料3頭（肺、腹淋、脾），剖殺斷奶消瘦仔豬2頭（脾、淋巴結）。編號后冷凍運送，-20 保存備用。1.2 酶和其他試劑PCR和RT-PCR擴增試劑盒、飽和酚、Taq DNA聚合酶、dNTPs、EB、DEPC水、TRIZOL(總RNA抽提試劑主要成分苯酚等）、DL 2000 Marker、TaKaRa RNA PCRKit（AMV）Ver.3.0 均購自寶生物工程（大連）有限公司。1.3 引物設計與合成 根據 GenBank 發表的 PRRSV（豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株）、CSFV（豬瘟病毒）、PCV2（圓環病毒2型）、PRV(偽狂犬病毒)、PPV（豬細小病毒）、JEV（豬乙型腦炎病毒）.用 Oligo6.0 軟件設計引物，擴增PRRSV的上游引物：5-ACCATGGAGGAGGATCTGCTAAAAC-3；下游引物：5-CTGGTAAGCAGACGTGTTGCG-3，擴增缺失株（高致病性PRRSV毒株）目的片段長度為843 bp；擴增PCV2的上游引物：5-CAGCAAGAAGAATGGAAGAAGCGGA-3，下游引物：5-CCAGGACTACAATATCCGTGTAACT-3，擴增目的片段長度為1 057 bp；擴增CSFV的上游引物：CSFV-F：5-CCTGACGCCACGATT-3，下游引物CSFV-R：5-GGGGACTCC（G） TTGCATATTTTT（T）-3，擴增目的片段長度為603 bp；擴增PRV的上游引物：gEl：5-CCGCGGGCCGTGTTCTTTGT-3和下游引物：gE2：5-CGTGGCCGTTGTGGGTCAT-3，擴增目的片段長度493 bp1；擴增PPV的上游引物P1：5-CGACGAAGCCTACGACAAATAC-3和下游引物P2：5-TGCTGGTAGTGTTCCTGG GTG-3擴增vp2基因的目的片段長1 255 bp2。擴增JEV的上游引物：5-AACAGCATGCAAATCGAAGAC-3，下游引物-CCAGAAACATCACCAGAAGG-3，引物擴增NS1基因的目的片段500bp3；以上引物均由寶生物工程（大連）有限公司合成。1.4 病料處理及核酸提取 將臨床病例的組織樣品利用研磨器充分研磨，利用MEM營養液進行10倍稀釋，然后利用DNA和RNA提取試劑盒進行核酸抽提。1.5 病毒核酸檢測1.5.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒的擴增 分別用BIOZOL總RNA提取試劑盒（博日公司）從病毒培養液提取總RNA為模板，采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）試劑盒進行RT-PCR擴增，反應條件RT: 50 30 min，94 2 min；PCR：（94 30 s，58 30 s，72 1 min）35個循環，72 延伸7 min，PCR產物經1.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.5.2 豬圓環病毒2型、偽狂犬病毒、細小病毒的擴增12 分別用天根生物科技有限公司DNA提取試劑盒，從病毒培養液提取DNA為模板，采用TaKaRa One Step DNA PCR Kit試劑盒進行PCR擴增，反應條件94 2 min；（94 30 s，55 30 s，72 1 min）35個循環，72 延伸10 min，PCR產物經1.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定。1.5.3 豬乙型腦炎病毒的擴增3 用提取病料總，溶于無核酸酶水，用反轉錄酶進行反轉錄，體系如下：， 緩沖液，反轉錄酶，。反轉錄，置于備用。以和為引物，用Taq進行 反應，體系如下：Taq， 和各，。反應參數為： ； ， ， ，個循環； ， ,產物經1.2瓊脂糖凝膠電泳鑒定。2 結 果：2.1 豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)檢測結果 進行RT-PCR擴增后,PCR產物用12瓊脂糖進行凝膠電泳后在凝膠成像系統中觀察，可見到843 bp的基因條帶，大小與HP-PRRSV預期基因相符(見圖1)。圖1：1:1#脾；2:1#肺；3：1#腹淋；4：2#脾；5:2#肺；6:2#腹淋；7:2000bp DNA marker；8:PRRSV陽性對照；9:3#脾；10:3#肺；11:3#腹淋；12：G1脾；13：G2脾2.2 豬圓環病毒2型（PCV2)檢測結果 進行PCR擴增后,PCR產物用12瓊脂糖進行凝膠電泳后在凝膠成像系統中觀察，可見到1057 bp的基因條帶，大小與PCV2預期基因相符（見圖2）圖2：1：1#肺：2：1#腹淋；3：1#脾；4：2#肺；5：2#腹淋；6：2#脾；7：3#肺；8：3#腹淋；9：3#脾；10：G1脾；11：G2脾；12：陽性對照；M：DNA Marker DL2000 2.3 豬瘟（CSFV)、偽狂犬（PRV)、豬細小病毒（PPV）和豬乙型腦炎（JEV)檢測結果 將PCR擴增產物用1.2瓊脂糖進行凝膠電泳，結果未見到目的基因。2.4 對死胎病料檢測結果：送檢的3頭死胎病料肺臟檢測出豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株核酸呈強陽性；判定引起死胎的原因主要病原為高致病性藍耳病病毒（HP-PRRSV)，結果（見表1）2.5 對剖殺2頭斷奶仔豬檢測結果：豬繁殖與呼吸綜合征病毒變異毒株核酸均呈強陽性反應（4+）；在保育豬G2脾還檢測出豬圓環病毒強陽性，表明該場斷奶后消瘦仔豬中有豬高致病性豬藍耳病病毒與圓環病毒2型混合感染的病例（見表1）。 表1：病原檢測結果統計如下編號樣品名稱豬圓環病毒PCV2豬細小病毒PPV豬偽狂犬病PrV豬瘟病毒CSFV高致病性藍耳病病毒HP-PRRSV豬乙型腦炎JEV1死胎1-肺-4+2死胎1-腹淋-3死胎1-脾-4+4死胎2-肺- 5死胎2-腹淋-6死胎2-脾-4+7死胎3-肺-4+8死胎3-腹淋-9死胎3-脾-10斷奶仔豬G1-脾-4+11斷奶仔豬G2-脾4+4+注釋：4+為強陽性，2+為中陽性，1+為陽性；為陰性。3、防控建議：根據該豬場流行的病原制定免疫防控措施。3.1母豬免疫：在配種前免疫哈獸研研制的豬高致病藍耳病弱毒疫苗（HuN4F112株）2頭份、豬圓環病毒2型疫苗（LG株）2毫升預防接種。3.2仔豬免疫：2周齡哺乳仔豬免疫哈獸研研制的豬圓環病毒2型疫苗（LG株）1毫升和豬喘氣病疫苗（輝瑞研制）2毫升，間隔3周加強免疫一次；仔豬3-4周齡免疫高致病性藍耳病弱毒疫苗（HuN4F112株）1頭份。4、討論與分析：根據流行病學特點、臨床癥狀、剖檢病變以及應用RTPCR檢測確診引起本場母豬正常分娩而死胎增加病原為高致病藍耳病病毒。推斷母豬妊娠后期感染高致病藍耳病病毒成為陽性帶毒者,病毒通過胎盤感染子宮內的仔豬導致死胎的肺臟、脾臟能檢測出高致病藍耳病病毒核酸；斷奶消瘦仔豬同樣存在高致病性藍耳病病毒,豬圓環病毒2型混合感染。據豬場技術人員反映豬場在2009年母豬群曾經普免過某進口藍耳病弱毒疫苗，但疫苗免疫后妊娠后期母豬群出現大面積流產、產仔延遲、全窩死胎、弱仔等現象。疫情平息后至今從未注射過藍耳病疫苗，這期間母豬群產仔死胎現象一直存在，豬場經常采用中藥保健的方式來降低死胎比例，但今年連續幾個月死胎比例顯著增加，從而引起豬場老板的高度重視。通過調查、檢測和分析建議豬場應該避免在母豬妊娠后期注射藍耳病活疫苗，藍耳病病毒經胎盤感染胎兒致死，以及新生仔豬帶毒已經得到證明。哈爾濱獸醫研究所吳東來研究員4,1999年試驗證明，3頭妊娠母豬產前70-90天鼻腔接種PRRSV CH-1a株105TCID50通過胎盤可感染胎兒，并在9頭死胎和2頭新生仔豬脾臟和肺臟檢測出藍耳病病毒抗原，與本診斷結果基本一致。但一些豬場對本病認識不清，有許多人認為豬場一旦發生高致病藍耳病就會產生自然免疫力，該場就不會有藍耳病發生。這種觀點已被這幾年慘痛教訓證明是錯誤的，近幾年有許多豬場因此倒閉。高致病性藍耳病之所以在國內傳播如此迅猛，與此觀點造成的誤導關系甚大。另外豬場在發生產死胎和斷奶仔豬消瘦癥狀增多時切記不要草率診斷，應盡早采取血清和病料到權威部門診斷，及早結合病原診斷確立防控方案，以免貽誤疫情。1張超范，劉長明，危艷武，I劉霓虹等，致病性豬偽狂犬病病毒PRVJF株的分離與鑒定J.中國預防獸醫學報，2008，30（3）：212-215.2張超范，崔尚金，戚亭，陳長木，苗嵐