微生物學實驗報告實驗一 普通光學顯微鏡的使用及細菌染色與形態觀察第一部分：顯微鏡的使用一、目的要求1熟悉普通光學顯微鏡的構造、油鏡的使用原理和顯微鏡的維護方法。2學會正確使用油鏡觀察細菌的基本形態和特殊構造。3了解各種顯微鏡的主要特征。二、實驗原理（一）光學顯微鏡的構造微生物實驗室中最常用的是普通光學顯微鏡，它的構造可分為機械部分和光學部分。1、機械部分普通復式光學顯微鏡的機械部分通常包括以下幾個部分：目鏡、鏡筒、基座回轉器、物鏡、載物臺、光圈、聚光器、光源、鏡臂、細調節器、粗調節器等。2、光學部分：目鏡、物鏡、聚光器、光圈、光源。（二）放大倍數標本首先經物鏡放大，在目鏡的焦距平面上形成一個實像，再經過目鏡放大成最終的虛像。總的放大倍數是物鏡放大倍數與目鏡放大倍數的乘積。物鏡的放大倍數愈大，其工作距離（物鏡鏡頭到標本片之間的距離）愈短，這時光圈就要打開得愈大。顯微鏡的放大倍數放大倍數總的放大倍數低倍鏡高倍鏡油鏡物鏡1045100目鏡1010101004501000（三）分辨距離與分辨力顯微鏡的性能受物鏡的分辨距離或分辨力所限制。分辨距離即透鏡所能分辨的兩個物點之間的最小距離，分辨距離愈小，透鏡的分辨力愈高，物像也就愈清晰。因此常以分辨距離來衡量顯微鏡的分辨力。 R=0.61/N.A式中：R-分辨距離； -作用光的波長；N.A-數值口徑。一些介質的折射率介 質折射率空氣水玻璃香柏油113551.56三、實驗內容（一） 材料：顯微鏡，香柏油，擦鏡紙。（二） 方法：細菌很小，須使用油鏡方可觀察到。油鏡是顯微鏡上最重要的部件之一，觀察時與玻片非常接近，稍不小心即可壓碎玻片，更嚴重的是損壞鏡頭，故必須極其仔細地學習油鏡的使用方法：1、為使低倍鏡取得最適之光源，可將低倍鏡頭調節到離載物臺約1cm的高度，將聚光器提高，光圈完全打開，然后調節電壓旋鈕至視野最合適。2、 滴一滴香柏油，固定于載物臺上，用推動器調節到載物臺正中。在雙目側視下，下旋粗調節器，使油鏡頭浸入油中幾乎與標本片相接觸。然后眼睛從目鏡觀察（如光線不足，可適當增大電源電壓），徐徐上旋粗調節器至看到模糊物像之后，再用細調節器調節以使物像清晰。如鏡頭已離開油面還未看到物像，則再重新操作。3、 更換標本時應先提高油鏡頭，再更換玻片，切勿隨意移動顯微鏡的位置。4、 油鏡觀察完畢后，按“顯微鏡保護”中（6）項處理。5、 最后將油鏡各部分還原，聚光器下降，反光鏡垂直于鏡座，鏡頭轉成八字形，以免與聚光器發生碰撞。四、思考題1、使用顯微鏡時為何調節下列構造？反光鏡，光圈，聚光器，粗調節器，細調節器，鏡頭回轉器。答：聚光器的位置之升降可影響視野的明亮度，上升則視野明亮，下降則光線減弱。光圈的放大或縮小也可控制視野明亮程度。粗調節器和細調節器均是調節焦距的裝置。鏡頭回轉器為裝置物鏡和轉換物鏡之用。2、使用不同放大倍數的物鏡時，工作距離與光圈的關系。如何利用這一原理用好顯微鏡？答：物鏡的放大倍數愈大，其工作距離（物鏡鏡頭到標本片之間的距離）愈短。標本首先經物鏡放大，在目鏡的焦距平面上形成一個實像，再經過目鏡放大成最終的虛像。總的放大倍數是物鏡放大倍數與目鏡放大倍數的乘積。3、為何要選用與玻璃折射率相似的香柏油作為油鏡的介質？油鏡的原理是什么？答：香柏油只在使用油鏡頭時（100倍物鏡）使用，因為當鏡與裝片之間的介質為空氣時，由于空氣（n= 1.52）的折射率不同，光線會發生折射，不僅使進入物鏡的光線減少，降低了視野的照明度，而且會減少鏡口角。當以香柏油（n=1.515）為介質時，由于它的折射率與玻璃相近，光線經過載玻片后可直接通過香柏油進入物鏡而不發生折射，不僅增加了視野的照明度，更重要的是通過增加數值孔徑達到提高分辨率的目的。可見光的波長平均為0.55m。當使用數值孔徑為0.65的高倍鏡時，它能辨別兩點之間的距離為 0.42m；而使用數值孔徑為1.25的油鏡時，能辨別兩點之間的距離則為0.22m。選用香柏油是因為它的折射率是1.5154、顯微鏡有哪幾種？各自的主要特征是什么？答：光學顯微鏡中除明視野顯微鏡外，還有暗視野顯微鏡、相差顯微鏡和熒光顯微鏡；除光學顯微鏡外，還有電子顯微鏡。暗視野顯微鏡：在普通光學顯微鏡載物臺下安裝一個暗視野聚光器即成暗視野顯微鏡。相差顯微鏡：相差顯微鏡成像的原理和普通光學顯微鏡一樣，所不同的是相差顯微鏡包括有環狀光闌、裝有相板的相差物鏡和全軸調整望遠鏡三個特殊部分。熒光顯微鏡：熒光顯微鏡的主要特征是以紫外線為光源，當照射到用熒光素標記的細菌時，熒光素吸收了紫外線的能量后，再發射出可見的橙、黃、淺綠色熒光。由于用熒光素標記的菌體各種結構中的溶解、吸附或化合情況不一，于是發出不同色調和亮度的熒光，從而可以觀察細菌的不同結構。電子顯微鏡：電子顯微鏡的基本結構和工作原理與普通光學顯微鏡非常相似，不同的是用電子流代替光線，用電磁圈代替透鏡聚焦。第二部分：細菌形態學檢查方法一、目的要求1、 了解不染色標本檢查法，用懸滴法觀察活細菌及其動力。2、 熟悉染色標本的制備過程，掌握革蘭氏染色法及其結果判斷，了解革蘭氏染色法原理。3、 了解其它常用染色法。二、實驗原理檢查細菌形態的主要工具是顯微鏡，可根據不同目的將細菌染色或不染色進行鏡檢。常用的堿性染料有結晶紫、美藍、堿性復紅等。染色法又分單染色法和復染色法兩大類。單染色法即僅用一種染料著色，所有的細菌均被染成一種顏色，無鑒別細菌的作用。復染色法又稱鑒別染色法，通常用二種或二種以上的染料著色，由于不同種類的細菌或同種細菌的不同組成結構對染料有不同的反應性而被染成不同的顏色，從而有鑒別細菌的作用。2、 最常用的細菌復染色法是革蘭氏染色法（Gram stain）。通過革蘭氏染色法操作，可把細菌分成兩大類：革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌。凡能使第一種染料結晶紫保留藍色的細菌叫革蘭氏陽性細菌，凡被灑精脫色后染上對比顏料沙黃或稀釋復紅而呈紅色的細菌叫做革蘭氏陰性細菌。三、實驗內容（一）染色標本的制備及觀察1、復染色法（革蘭氏染色法）材料：葡萄球菌瓊脂培養物 1支大腸桿菌瓊脂培養物 1支革蘭氏染液一套：結晶紫、95%酒精、路哥氏碘液、稀釋復紅各1瓶。玻片，接種環，酒精燈，吸水紙等。方法：（1）涂片 用葡萄球菌和大腸桿菌混合涂片。 取玻片一塊，拭凈。 用無菌接種環取生理鹽水一滴，放在玻片中央（如被檢材料是液體，可不加生理鹽水）。 左手斜持菌種試管，右手將菌種試管棉塞稍加轉動，以便拔下。 右手持接種環，經火焰滅菌后，用右手小拇指拔開菌種試管棉塞，試管口通過火焰，將接種環插入試管中取菌少許（切不可多，更不可將培養基刮下）。 試管口再通過火焰，塞好棉塞。 將接種環上的細菌加入玻片上之水滴內，磨勻，涂成直徑為1cm大小的薄菌膜。 接種環經火焰滅菌。.（2）干燥 涂片置于空氣中，使其自然干燥。（3）固定 干燥后將涂片在火焰上緩緩通過三次，此為“固定”。目的是使細菌粘于玻片上，染色和水沖時不易脫落；且細菌為蛋白質，被熱凝固可保持完整形態。（4）染色 初染媒染脫色復染 加結晶紫染液于標本上，使其覆滿標本，染12分鐘。 細水沖洗。 加路哥氏碘溶液經1分鐘。 水洗。 加95%酒精于玻片上來回流動，傾去酒精。如此重復23次（約30秒鐘）。 水洗。 加稀釋復紅染液，染約1分鐘。 水洗，用吸水紙吸干。（5）鏡檢 革蘭氏陽性菌在結晶紫著色后不易被酒精脫色，故仍為深藍色或紫色；革蘭氏陰性菌在結晶紫著色后易被酒精脫色，故經稀釋復紅復染后成紅色。三、實驗記錄革蘭氏染色過程：取玻片一塊，在玻片上滴三小滴水（有一定的距離），分別用接種環取EC（大腸桿菌）和BS（金黃色葡萄球菌）與兩邊的水滴上，并混勻，灼燒接種環后再分別取EC和BS于中間的水滴上混勻（即中間水滴是兩種菌的混合物），并在酒精燈下灼燒至干（小心不要將玻片炸裂），用結晶紫進行初染，細水沖洗后，加路哥氏碘液進行媒染，水洗后加酒精脫色23次，水沖洗后加稀釋復紅染液復染一分鐘，水洗，并用吸水紙吸干。大腸桿菌為革蘭氏陰性菌，染色后呈紫紅色。普葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，染色后呈現藍紫色。以下為實驗觀測圖：四、思考題1染色法在微生物學上有何實際意義？染色法可以更方便的觀察細菌的具體形態，更方便觀察細菌，革蘭氏染色法有更重要的意義，可以鑒別細菌，把眾多的細菌分為兩大類，革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌，在實驗方面，可以通過殺死陽性或陰性菌而得到目的菌。2比較復染色法與單染色法的優缺點。答：單染色法：優點：僅用一種染料著色，所有的細菌均被染成一種顏色，簡單方便，可用來觀察細菌的形態和排列方式。缺點：但無鑒別細菌的作用。復染色法：優點：用二種或二種以上的染料著色，由于不同種類的細菌或同種細菌的不同組成結構對染料有不同的反應性而被染成不同的顏色，從而有鑒別細菌的作用。缺點：使用試劑較多，過程較單染色法更復雜繁瑣。3以革蘭氏染色法為例，說明它至少要涉及幾種試劑？各起何作用？答：至少用到4種試劑。結晶紫溶液進行初染，路哥氏碘液進行媒染，95%酒精進行脫色，稀釋復紅染液進行復染。4要確證一個未知細菌的革蘭氏染色性質，你可用什么方法來說明你的結果是可靠的？答：通過在顯微鏡下的菌體被染的顏色可以判斷，凡能使第一種染料結晶紫保留藍色的細菌為革蘭氏陽性細菌，凡被灑精脫色后染上對比顏料沙黃或稀釋復紅而呈紅色的細菌為革蘭氏陰性細菌。微生物學實驗報告實驗二 培養基的的制備滅菌及接種技術培養基的制備和滅菌一、目的要求掌握基礎培養基應具備的條件及其制備方法。二、實驗原理培養基是人工配制的供給細菌或其它微生物生長繁殖的營養基質。微生物的種類雖然繁多，但對基本營養物質如碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水分等的要求卻有共同性。這些營養物質的作用是：提供合成菌體和代謝產物的原料；提供生命活動必需的能量；調節代謝環境。作為培養基必須具備下列條件：含有適當的水分和一定配比的適宜的營養物質。具有合適的酸堿度（pH值）。有適當的物理狀態：液體培養基、固體培養基和半固體培養基。培養基必須經滅菌成為無菌狀態后方能使用。利用培養基對細菌等進行人工培養，在微生物學上有重要意義。例如，細菌純培養物的分離、培養，細菌生物學特性的研究、分類鑒定，菌種保藏等都需要利用培養基進行人工培養。同時在傳染病的診斷、生物制品的研制、發酵生產，以及利用細菌等作為工具進行的其它學科的研究中（如遺傳學、基因工程等），都離不開培養基的應用和細菌的人工培養。基礎培養基一般指的是營養肉湯培養基和營養瓊脂培養基，它通常由蛋白胨（主要作為氮源）、牛肉浸膏（作為碳源、氮源、維生素和無機鹽）、氯化鈉（無機鹽并具有維持一定的滲透壓的作用）和水所組成。基礎培養基含有大多數細菌生長繁殖所需要的營養物質。另外，根據培養基的組成和使用目的菌不同，還有加富培養基、選擇培養基、厭氧培養基等。三、實驗內容（一）馬丁培養基的配制：葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.0 g 、硫酸鎂(MgSO47H2O) 0.5 g、孟加拉紅33.4 mg、蒸餾水1000 mL、實驗中使用的是已經配制好的培養基粉，稱取36g，加入1000ml水，分裝在兩個500ml的錐形瓶中，包扎，置于高溫滅菌鍋中121 下滅菌30 min。滅菌后進行倒平板備用。四、思考題1液體培養基、固體培養基、半固體培養基各有何功用？答：液體培養基：組分均一，適宜各類微生物的營養生長。廣泛應用于實驗研究及大規模工業生產中，有利于廣泛獲得大量菌體或代謝產物。固體培養基： 瓊脂固體培養基廣泛應用于微生物的分離培養、菌種鑒定和保藏。半固體培養基：用于觀察細菌的運動、菌種鑒定及測定噬菌體的效價等。2細菌的人工培養需要哪些條件，在微生物學上有何重要意義？答：需要基本營養物質：如碳源、氮源、能源、無機鹽、生長因子和水分等。細菌純培養物的分離、培養，細菌生物學特性的研究、分類鑒定，菌種保藏等都需要利用培養基進行人工培養。同時在傳染病的診斷、生物制品的研制、發酵生產，以及利用細菌等作為工具進行的其它學科的研究中（如遺傳學、基因工程等），都離不開培養基的應用和細菌的人工培養。微生物學實驗報告實驗三 自然界中微生物的分離與純化一、目的要求1、學習并掌握從自然界中分離微生物的方法。2、掌握細菌、放線菌、酵母菌、霉菌的分離純化方法；二、基本原理土壤是微生物生活的大本營，是尋找和發現有重要應用潛力的微生物的主要菌源。不同土樣中各類微生物數量不同，一般土壤中細菌數量最多；其次為放線菌和霉菌。一般在較干燥、偏堿性、有機質豐富的土壤中放線菌數量較多；酵母菌在一般土壤中的數量較少，而在水果表皮、葡萄園、果園土中數量多些。本次實驗從土壤中分離細菌、放線菌和霉菌；自面肥或酒曲或果園土分離酵母菌。從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。常用的是平板分離法和劃線分離法，純化該微生物，直至得到純菌株。平板分離法是將待測樣品經適當稀釋，使其中的微生物充分分散成單個細胞，取一定量的稀釋樣液接種到平板上，經過培養，由每個單細胞生長繁殖而形成肉眼可見的菌落，即一個單菌落應代表原樣品中的一個單細胞。該法雖然操作繁瑣，但可獲得活菌的信息，所以被廣泛用于生物制品檢驗（如活菌制劑），以及食品、飲料和水等的含菌指數或污染程度的檢測。三、實驗材料（一）菌源1、土樣：選定采土地點后，鏟去表土層23 cm，取310 cm深層土壤10 g，裝入已滅過菌的牛皮紙袋內，封好袋口，并記錄取樣地點、環境及日期。土樣采集后應及時分離，凡不能立即分離的樣品，應保存在低溫、干燥條件下，盡量減少其中菌相的變化。（二）培養基（制平板）1、馬丁培養基：葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 1.0 g 硫酸鎂(MgSO47H2O) 0.5 g、孟加拉紅33.4 mg、蒸餾水1000 mL、121 30 min滅菌。（三）無菌水配制無菌水，分裝于250 mL錐形瓶，每瓶裝99 mL），每瓶內裝44粒玻璃珠。分裝試管、每管裝9 mL（每組4支），121滅菌20min。（四）其他物品：無菌培養皿、無菌移液管、無菌玻璃涂棒、稱量紙、藥勺、橡皮頭、10酚溶液。四、操作步驟（一）稀釋涂布平板分離法（1）制備土壤稀釋液稱取土樣10 g，放入到盛有99 mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，置搖床振蕩1020 min，使土壤均勻分散成土壤懸液（101）。用1 mL的無菌移液管從中吸取1mL土壤懸液，移入到分裝有9 mL無菌水的試管中，吸吹3次，振蕩均勻（102）。用同樣方法依次制成102104的土壤稀釋液（為避免稀釋過程誤差，進行微生物計數時，最好每一個稀釋度更換一支移液管）。（2）涂布法分離依前法向無菌培養皿中傾倒已融化的培養基，待平板冷凝后，用無菌移液管分別吸取上述10-1、10-2、10-3、10-4四個稀釋度菌懸液0.2 mL，依次滴加于相應編號已制備好的培養基平板上，用無菌玻璃涂棒涂勻（一定要多涂幾遍，涂到菌液均勻分布為止，切忌用力過猛將菌液直接推向平板邊緣或將培養基劃破）。將平板倒置于恒溫箱中進行培養，觀察結果。（二）平板菌落形態及個體形態觀察從不同平板上選擇不同類型菌落用肉眼觀察