植物組織MDA含量測定一、目的要求1掌握植物組織MDA含量測定的原理及具體測量步驟；2深化理解MDA與逆境和衰老的關系，理解植物組織MDA含量測定的意義；3了解膜脂過氧化、氧自由基和MDA形成的關系；4能夠根據待測材料的具體情況設計實驗步驟測定MDA含量；5學習分光光度計，低溫離心機等儀器的使用方法。二、實驗原理植物遭受逆境脅迫或衰老時，體內會發生一系列生理生化變化，如核酸和蛋白質含量下降、葉綠素降解、光合作用降低，活性氧平衡失調及內源激素平衡失調等。活性氧代謝失調直接導致植物體內活性氧的大量積累，從而引發或加劇膜脂過氧化作用，造成細胞膜系統的損傷，嚴重時會導致植物細胞死亡。膜脂過氧化的產物有二烯軛合物、脂類過氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂過氧化最重要的產物之一，它的產生還能加劇膜的損傷。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一個常用指標，可通過測定MDA了解膜脂過氧化的程度，以間接測定膜系統受損程度以及植物的抗逆性。MDA在高溫及酸性環境下可與2-硫代巴比妥酸（TBA）反應，產生紅棕色的產物3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮（Trimetnine），又名三甲川，該物質在532nm處有最大光吸收，在600nm處有最小光吸收。由于TBA也可與其它物質反應，并在532nm處有吸收，為消除硫代巴比妥酸與其它物質反應的影響，同時測定600nm下的吸光度，利用532nm與600nm下的吸光度的差值計算MDA的濃度。即：A532A600CL式中，A532和A600分別表示532nm和600nm處的吸光度值，C是MDA濃度，L為比色杯厚度，=155Lmmol-1cm-1。TBA MDA 3,5,5-三甲基惡唑2,4-二酮需要指出的是，植物組織中糖類物質可能對MDA-TBA反應有干擾作用。可用下列公式消除由蔗糖引起的誤差。 C（molL-1）=6.45(A532A600) 0.56A450三、材料與設備1材料：四種菠菜樣品，即綠色和黃色葉片的高溫處理和室溫對照。2儀器：(1) 分光光度計；(2) 冷凍離心機；（3）水浴鍋；(4) 天平；(5) 研缽；(6) 剪刀；(7) 5ml刻度離心管；(9) 刻度試管(10ml)；(10) 鑷子；(11) 移液管(5ml、2ml、1ml)；（12）冰箱。3藥品(1) 0.05mol/L pH7.8磷酸鈉緩沖液；(2) 5三氯乙酸溶液：稱取5g三氯乙酸，先用少量蒸餾水溶解，然后定容到100ml；(3) 0.5的TBA溶液：稱取0.5g硫代巴比妥酸，用5三氯乙酸溶解，定容至100ml。四、實驗步驟1MDA的提取：取樣品0.5g（W），加入2ml預冷的0.05mol/L pH7.8的磷酸緩沖液，冰浴研磨成勻漿，轉移到5ml刻度離心試管，將研缽用緩沖液洗凈，清洗液也移入離心管中，最后用緩沖液定容至5ml。4500rpm，4度，離心10min，上清液即為MDA提取液，測量提取液的體積（V）。2MDA含量測定：吸2ml（V2）的提取液于刻度試管中（空白為2ml緩沖液），加入3ml 0.5的TBA溶液，將試管放入沸水浴中煮沸10 min（自試管內溶液中出現小氣泡開始計時）。到時間后，立即將試管取出并放入冰浴中。4500rpm，4度，離心10min，取上清液并量其體積（V1）。上清液于532nm、600nm波長下測定吸光度。3結果計算:MDA(nmolg-1)6.452(A532A600) 式中，V1為反應液總量（ml）；V2為反應液中的提取液數量(ml)；V為提取液總量（ml）； W為植物樣品重量(g)。五、實驗報告樣品處理重復A532A600MDA含量（nmolg-1）綠葉高溫處理123平均標準差室溫對照123平均標準差黃葉高溫處理123平均標準差室溫對照123平均標準差六、思考題1TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？2提取液與TBA的混合液為什么要加熱？為什么加熱時間又不能過長？3為什么要測定反應液在600nm下的吸光度？4如果可溶性糖含量影響MDA含量的測定，你有什么辦法消除其影響？5正常植物與衰老時相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。七、注意事項1可溶性糖與TBA顯色反應的產物在532 nm也有吸收（最大吸收在450 nm），當植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時可溶性糖含量會增高，必要時要