細胞培養中的支原體污染的預防及處理Mycoplasma國內主要有三種譯名，醫學文獻譯為“支原體”（分枝原體，枝原體，類菌質體），動物醫學文獻譯為“霉形體”或“支原體”，臺灣、香港則譯為微漿菌。 支原體是目前已知一類能在無生命培養基上生長繁殖的最小的原核細胞型微生物。自然界分布廣泛，種類多，有80余種，分為兩個屬：一為支原體屬（Mycoplasma），有幾十個種；另一為脲原體屬（Ureaplasma），僅有一種。與人類感染有關的主要是肺炎支原體和解脲脲原體。 支原體無細胞壁，多呈不規則球狀、長絲狀，可分枝，營寄生共生或腐生。一般侵害對象為動植物，可造成多種疾病。 細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。國內外研究表明，95%以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和菜氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。 支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染（某些支原體在人體是正常菌群）、培養基的污染、被污染細胞造成的交叉污染、實驗器材的污染、制備細胞的原始組織或器官的污染，等等。 體外生長的細胞對微生物及一些有害有毒物質沒有抵抗能力，因此培養基應達到無化學物質污染、無微生物污染（如細菌、真菌、支原體、病毒等）、無其他對細胞產生損傷作用的生物活性物質污染（如抗體、補體）。對于天然培養基，污染主要來源于取材過程及生物材料本身，應當嚴格選材，嚴格操作。對于合成培養基，污染主要來源于配制過程，配制所用的水，器皿應十分潔凈，配制后應嚴格過濾除菌。 由于體外培養細胞自身沒有抵抗污染的能力，而且培養基中的抗生素抗污染能力有限，因而培養細胞一旦發生污染多數將無法挽回。支原體污染后，因為它們不會使細胞死亡可以與細胞長期共存，培養基一般不發生渾濁，細胞無明顯變化，外觀上給人以正常感覺，實則細胞手到多方面潛在影響，如引起細胞變形，影響DNA合成，抑制細胞生長等。 組織細胞培養工作中，可以從以下幾方面來預防支原體的污染：控制環境污染；嚴格實驗操作；細胞培養基和器材要保證無菌；在細胞培養基沖加入適量的抗生素。 抗生素主要用于消毒培養液，是培養過程中預防微生物污染的重要手段，也是微生物污染不嚴重時的“急救”方法。不同抗生素殺滅微生物不同，應根據需要選擇。 在細胞培養過程中如果發現破碎的細胞甚多，培養細胞需要頻繁改善營養環境才能支持長期傳代培養時，應該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養液也不渾濁。 支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有：抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。要注意的是：支原體沒有細胞壁，故作用于細胞壁生物合成的抗生素，如內酰胺類、萬古霉素等是不敏感的；對多粘菌素、利福平、磺胺藥物普遍耐火藥。對支原體最有抑制活性抗生素是四環素類、大環內酯類等，氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小的抑制作用。必要時更換所有培養用物。通常，濾過除菌的方法對支原體是沒有作用的。 由于一些微生物，如支原體，病毒等能通過濾膜，所以過濾藥品仍潛在被外源微生物污染的危險，近年來，60Co輻射滅菌技術在醫藥、食品等領域廣泛應用，由于輻射滅菌能夠徹底殺滅所有微生物。有試驗證實以2Mrad輻射處理的各培養基樣品達到了無菌要求，經多批培養試驗，輻射滅菌安全可靠；輻射滅菌的培養基營養性能不低于過濾組，證明輻射滅菌對培養基性能無不良影響；對血清的輻射滅菌試驗效果也表明60CO射線不影響培養效果。把干粉培養基經無菌操做定量分裝于滅菌容器內，輻射后以干粉原型貯藏，不但培養基的純凈性得到保障，而且營養性能較過濾后以水溶液形式保存更穩定，對谷氨酰胺等這類水溶液不穩定者特別合適。 目前，有專門做支原體檢測的試劑盒，可以用細胞滴片檢測。市場上已有了新一代支原體抗生素M-Plasmocin（InvivoGen公司），能有效的殺滅支原體，又不影響細胞本身的代謝，而且處理過的細胞不會重新感染支原體。另外，配合支原體檢測試劑盒（市場上有售，如美國ICN公司的產品），可以幫助盡快發現支原體的污染。 細胞培養中支原體污染的特點及檢驗 BIOX.CN 2005-6-3 19:47:34來源：生命經緯 支原體是一種大小介于細菌和病毒之間(最小直徑02um)并獨立生活的微生物約有1%可通過濾菌器。支原體無細胞壁形態呈高度多形性可為圓形、絲狀或梨形。 支原體形態多變，在光境下不易看清內部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構其中央有電干密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。支原體多吸附或散在于細胞表面和細胞之間。橫斷面與細胞微絨毛相似，但微絨毛電子密度比支原體小，且中央無顆粒群 或中央束。 支原體代謝需固醇類物質、部分種類需要精氨酸、O2或葡萄糖，每一種支原體都有自身持點。多數支原體適合于偏堿條件下生存(PH7680)，對酸耐受性差。對熱比較敏感，對一般抗生素不敏感。 支原體污染細胞后培養液可不發生混濁多數情況下細胞病理變化輕微或不顯著，細微變化也可由于傳代、換液而緩解因此易被忽視。但個別嚴重者，可致細胞增殖緩慢甚至從培養器皿脫落。 為確定有無支原體污染可做如下檢酗： 相差顯微境檢測：將細胞按種于事先放置于培養瓶內的蓋玻片上，24h后取出，用相差油鏡觀察支原體呈暗色微小顆粒位于細胞表面和細胞之間。 熒光染色法：熒光染色用能與DNA特異性結合的熒光染料Hoechst33258，可使支原體內含有的DNA著色，染色后用熒光顯微鏡觀察。具體方法如下：首先將細胞接種蓋玻片上，在細胞未長滿前取出玻片，用不合酚紅的Hanks液漂洗一下，用l：3醋酸甲酵固定10Min，然后用生理鹽水漂洗置于用生理鹽水配濃度為50pgml的Hoechst33258中染色10min。染色后用蒸溜水洗12min向細胞面滴加pH55磷酸緩沖液數滴，然后置熒光顯微鏡下觀察。鏡下支原體為散在于細胞同圍或附于細胞膜表面的亮綠色小點。 電鏡檢查；用掃描電鏡方法簡便快速也可以利用透射電鏡。 DNA分子條文檢查或支原體培養等方法：檢出率高但方法較為復雜 支原體是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生物，大小一般在0.3-0.5um之間，呈高度多形性，有球形、桿形、絲狀、分枝狀等多種形態。它不同于細胞，也不同于病毒。支原體用普通染色法不易著色，用姬姆薩染色很淺，革蘭染色為陰性。支原體可在雞胚絨毛尿囊膜上或細胞培養中生長，營養要求比細菌高。細胞培養（特別是傳代細胞）被支原體污染是個世界性問題。在細胞培養中支原體感染發生率達到63%，支原體感染發生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過可視法對其進行檢測，而且它對細胞的生長率影響較小，不易引起注意。國內外研究表明，95以上是以下四種支原體：口腔支原體（M.orale）、精氨酸支原體（M.arginini）、豬鼻支原體（M.hyorhinis）和萊氏無膽甾原體（A.laidlawii），為牛源性。以上是最常見的污染細胞培養的支原體菌群，但能夠污染細胞的支原體種類是很多的，國外調查證明，大約有二十多種支原體能污染細胞，有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。支原體污染的來源包括工作環境的污染、操作者本身的污染（一些支原體在人體是正常菌群）、培養基的污染、污染支原體的細胞造成的交叉污染、實驗器材帶來的污染和用來制備細胞的原始組織或器官的污染。組織細胞培養工作中，主要從以下幾個方面來預防支原體的污染：控制環境污染；嚴格實驗操作；細胞培養基和器材要保證無菌；在細胞培養基中加入適量的抗生素。支原體污染細胞后，特別是重要的細胞株，有必要清除支原體，常用方法有抗生素處理、抗血清處理、抗生素加抗血清和補體聯合處理。支原體最突出的結構特征是沒有細胞壁，一般來講，對作用于細胞壁生物合成的抗生素，如 -內酰胺類、萬古霉素等完全不敏感；對多粘菌素（polymycin）、利福平、磺胺藥物普遍耐藥。對支原體最有抑制活性及常用于支原體感染治療的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮；其他類抗生素如氨基糖苷類、氯霉素對支原體有較小抑制作用，所以常不用來作為支原體感染的化學治療劑。InvivoGen公司研究開發的新一代支原體抗生素M-Plasmocin能有效地殺滅支原體，不影響細胞本身的代謝，并且用M-Plasmocin處理過的培養細胞，不會重新感染支原體。對于支原體污染的細胞，可以采取補救措施：1 抗生素排除法：可以用5-10倍于常用量的沖擊法，加入高濃度抗生素后作用24-48小時，再換入常規培養液，有時可能有效。推薦用量：慶大霉素 200ug/ml ,四環素10ug/ml ，卡那霉素50ug/ml 。對于支原體污染抗生素應用，預防性應用比污染后使用好。2 加溫除菌：根據支原體耐熱性能差的特點。將受支原體污染的細胞置于41度中作用5-10小時可以殺滅支原體。但由于41度對培養細胞本身也有較大的影響，故處理前，應先進行預試驗，確定出最大限度殺傷支原體而對細胞影響較小的處理時間。細胞支原體污染一般情況及預防措施信息來源：本站原創更新時間：2004-10-19 2:28:00 細胞株若受到細菌、真菌、支原體、或是特定病毒等之污染時，會嚴重的影響實驗的結果。而細菌、真菌等之微生物污染時，較易自培養基等的外觀變化察覺。但是若受到支原體之污染時，細胞之外觀較無明顯變化，但是其污染會造成細胞之生長速率緩慢、細胞產生病變之型態改變等等變化。各國細胞庫支原體污染的統計表，如下：國家 受支原體污染(%) 報告年度USAFDA 15 1993(past 30 years)USAATCC 15-20 1992Japan(IFO，RIKEN，JCR) 803022 1981 1987-19931998GermanyDSM 36 1990-1994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原體高污染率的原因為： 1.支原體size 0.10.8 um，無細胞壁，可透過一般過濾膜（0.22-0.45 um） 2.支原體污染時，沒有明顯的肉眼或一般光學顯微鏡可觀察到的特征變化 3.過去缺乏簡單、快速且可靠的檢測方式 4.細胞流通間缺乏品管，造成實驗室間的相互污染 5.研究或操作人員忽略污染問題 而支原體污染了來源: 1.已受污染的細胞 2.操作人員的疏失 3.已受污染的培養基、血清 4.操作環境不良、實驗器具不潔等 由于支原體為人體口腔中之正常菌叢，實驗室之操作人員的污染亦可能為污染源，須十分注意。而萬一細胞已受支原體污染時，最佳的處理原則為將細胞高壓滅菌后丟棄，以免污染其它潔凈的細胞株。但是若是堅持要作去除支原體污染，有以下幾種方法，只不過結果會與原始的細胞特性有差異。去除支原體污染： 1. 抗生素處理：BM-cyclin（Roche），MRA（mycoplasma removal agent，ICN），Ciprofloxcin（Bayer），Enrofloxacin（Bayer） 2. Nucleic acid metabolites：5-bromouracil，Hoechst 33258，bromodeoxyuridine 3. Anti-sera 預防與控制方面可從以下各點加強注意：G 設備方面： 1.使用已作支原體測試ok之細胞株 2.于另一隔離之區域操作未知是否有支原體污染之細胞 3.使用不添加抗生素的培養基培養細胞 G 檢測方面：定期以標準的支原體檢測方法檢測細胞、培養基、血清、ddH2O有否被支原體污染。G 實驗操作人員之無菌觀念與無菌操作技術之要求 有關支原體污染之問題與回答：o 應如何避免細胞污染？細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原體。 主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。 嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。o 如果細胞發生微生物污染時， 應如何處理？直接滅菌后丟棄之。o 支原體 (mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？不能。 除極有經驗之專家外， 大多數遭受支原體污染的細胞株， 無法以其外觀分辨之。o 支原體污染會對細胞培養有何影響？支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為 mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。o 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。 支原體之檢測：*直接培養法 *原理：直接培養支原體于培養基中，觀察其生長及菌落生成。 特點：是目前最直接與靈敏之步驟，亦是用來評估其它偵測新步驟之標準步驟。 缺點：培養時間長，須35星期才能判斷。有些支原體不能在培養基培養出來 (例如M. hyorhinis)。需同時培養支原體株作為正反應對照組，可能會造成污染。 材枓：dextrose、L-arginine HCl、Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast extract solution (autoclaved)、Bacto agar、無菌有蓋螺旋試管(autoclaved)、無菌培養皿60x15mm、L-玻棒、37培養箱、厭氧缸（厭氧缸長期培養易有污染，所以厭氧包應用無菌水，每次打開厭氧缸后，用70% ethanol擦拭內壁。） 培養基制備：基本配方為Difco PPLO broth(60%), 馬血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock solution (10%)。由于培養時間長，可加入penicillin(50u/ml)至10x stock solution或加入thallium acetate (1：2000)至培養基中以防止其它細菌污染。 10x stock solution (1 liter) ：稱取50 g dextrose，10 g L-arginine HCl，溶于1 liter蒸餾水中。以0.22m無菌過濾膜過濾滅菌。分裝100 ml至瓶中，保存于 -70。 液體培養基 (1 liter) ：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red 于600ml蒸餾水中，加熱攪拌溶解之。滅菌121，15分鐘。待溫度降低至室溫后，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution，及100ml解涷之10x stock solution，混合均勻后，分裝至已滅菌之有蓋螺旋試管中，10ml/管。保存于4，期限1個月。 固體培養基 (1 liter )：稱取21 g之Difco PPLO broth，0.02 g phenol red，15g Bacto agar于600ml蒸餾水中，加熱溶解之。滅菌121，15分鐘。放在50水中浴中，待溫度降低至50時，于無菌操作臺內加入200ml馬血清，100ml之15% yeast extract solution 及100ml解凍之10x stock solution，混合均勻后，倒入60x50之無菌培養皿中，5ml/培養皿。保存于4，期限1個月。 步驟： 取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，接種于液體培養基中，置于37培養二周，觀察是否有混濁或是pH值改變之情形。培養一周及二周后，分別取0.1 ml液體培養液涂在agar plate上，將其倒放置于37厭氧箱培養，培養至少3星期，持續觀察是否有支原體之菌落出現。 另取1 ml細胞培養液或0.2ml細胞懸浮液，涂抹在agar plate上，37厭氧培養3星期，持續觀察是否支原體菌落出現。 另作正負反應對照組，正反應對照組為Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206) 與M. arginini (ATCC 23838)。負反應對照組為待測細胞之新鮮培養基。 結果判讀： 支原體生長較慢，所以先在液體培養基培養12周增殖后，再培養于agar plate上。需至少培養3星期后，才可斷定是否有支原體污染。所以整個測試需5個星期才知正確結果。 典型之支原體菌落類似荷包蛋(fried- egg like)，乃是由于支原體往agar下層生長所致，為圓形無色透明菌落，大小約10-55m。但是并非所有的支原體皆為似荷包蛋菌落，有些是圓形菌落或是類似粘菌類形態（slime）。 若要區分細胞或是氣泡造成的類似菌落，可將其自agar plate上切下，重新培養于液體培養基中，培養一星期后再種入agar plate，若是細胞則不會生長。 DNA螢光染色法 原理利用螢光染劑（bisbenzimide, Hoechst 33258）偵測支原體污染。此染劑會結合到DNA之Adenosine-Thymidine (A-T) rich區域，因為支原體之DNA中A-T含量占多數（5580%），所以可將其染色而偵測。被支原體污染之細胞經染色后，在細胞核外與細胞周圍可看到許多大小均一之螢光小點，即為支原體之DNA，證明有支原體之污染。 測試步驟用間接步驟，將待測細胞懸浮液或細胞培養液接種于指示細胞培養液中（indicator cell，例如Vero cell or 3T6 cell），然后培養指示細胞再作螢光染色。正負反應對照組亦可以接種于indicator cell內作為對照。 待測細胞亦可作直接測試，但需為吸附型細胞，培養后直接作螢光染色。有些細胞易有螢光背景，而干擾結果判讀，則建議使用接種于指示細胞之步驟。 特點簡單、經濟與靈敏，廣泛使用，可作為例行之偵測步驟。可以偵測不易培養之支原體，例如M. hyorhinis，較直接培養法快，約一星期即可知道結果。 缺點：有時仍會有螢光背景，影響判讀。 材料 Hanks balanced salt solution without NaHCO3 or phenol red (HBSS, GibcoBRL 21250-014、bisbenzimide (Hoechst No.33258, Sigma B-2883)、thimerosol (Sigma T-5125)、0.1M citric acid、02M disodium phosphate、glycerol、glacial acetic acid、methanol、strerile H2O、chamber slide (Nunc 177380)或chamber slide替代物：35 or 60mm sterile plate內放置無菌22x22mm蓋玻片浸于酒精內，使用前過火滅菌，一般吸附型細胞均能吸附在蓋玻片上。染色后取出蓋玻片，細胞面朝下放在玻片上觀察。 Indicator cells: Vero (African green monkey kidney, ATCC CCL-81 or CCRC 60013) or 3T6(mouse fibroblast, ATCC CCL-96 or CCRC 60070)，細胞須先測試無污染。MEM with 10%FBS ( medium for Vero cell) 配制試劑: 無菌HBSS配制Hanks balanced salt solution，以0.22mm無菌過濾膜過濾滅菌。勿用高壓蒸汽滅菌。 Hoechst 33258 stock solution（100X）稱取5.0 mg bisbenzimide和10.0 mg thimersol溶于100 ml無菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml分裝至1.5ml小離心管中，貯存于-20。 Hoechst 33258 working reagent取1 ml Hoechst 33258 stock solution，加入sterile 100 ml HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以鋁箔紙包覆，避免光照，貯存于4。 mounting solution22.2 ml 0.1 M citric acid和27.8 ml 0.2 M Na2HPO4加入于50 ml glycerol中混合，以1 N NaOH調整pH至5.5（pH很重要），貯存于4。 固定溶液（fixative）冰醋酸與甲醇以13之體積比例混合，使用前才配制。 步驟： 培養Vero細胞： Vero細胞可作長期培養或制作多個冷凍保存管，測試前解凍培養。測試前一周培養Vero細胞。 在接種測試樣品前一日，以trypsin-EDTA溶液處理Vero細胞，制成細胞懸浮液，以12x104 cellsml培養于chamber slide中，每個well加入1ml細胞懸浮液，于37, 5CO2培養。隔日確定生長良好后，即可接種測試樣品。 接種測試樣品：樣品種類：1ml待測之培養基，1ml待測細胞培養液（可將細胞稍微刮下，0.050.1ml冷凍管之細胞懸浮液。 將測試樣品加入chamber slide內，培養5天后，進行Hoechst 33258的螢光染色觀察。 以Acholeplasma laidlawii ATCC 23206 感染Vero細胞作為正反應對照組或是已感染支原體之細胞培養液或冷凍細胞液，負反應對照組為Vero cell之新鮮培養基( MEM +10%FBS)。 DNA螢光染色檢測 取出培養5日之Vero細胞，吸除培養液。于每個well中加入2 ml 1:3混合的冰醋酸/甲醇固定液，靜置10 min后，吸除固定液。重復上述之步驟，風干10分鐘。 于每個well中，加入1 ml Hoechst 33258 working solution，室溫下靜置30 min。 吸掉Hoechst 33258染液后，以無菌水洗滌3次，風干后加入1滴的mounting solution，并以蓋玻片覆蓋之。 以100x-400x螢光顯微鏡觀察。打開水銀光源10 min后，以UV激發光束(330380 nm)之濾光鏡，觀察細胞核外是否有藍色螢光小點或是絲狀點之螢光物產生。 結果判讀若有支原體污染，在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點或是絲狀點。其形狀一致，與細胞殘片染成之不規則點狀物不同。其螢光可維持數星期。圖例 (A)為negative result : 螢光顯微鏡下，只觀察到Vero細胞的細胞核，測試樣品沒有支原體的污染。(為positive result : 在Vero細胞核外與細胞表面會出現藍色螢光小點和絲狀點，表示測試樣品有支原體的污染。 支原體感染發生后能改變細胞的DNA,RNA及蛋白表達，又不能通過可視法對其進行檢測，而且它對細胞的生長率影響較小，不易引起注意。在細胞培養過程中如果發現破碎的細胞甚多，培養細胞需要頻繁改善營養環境才能支持長期傳代培養時，應該懷疑支原體污染。支原體污染難以觀察特殊的外觀變化，培養液也不渾濁。由于支原體能夠透過濾膜，因此在使用一些通過過濾滅菌的試劑上，如果試劑本身帶有支原體污染，則很容易造成支原體污染的傳播。其中細胞培養接觸水源是支原體最容易傳播和交叉污染的地方，也是實驗室消毒最難處理的地方，這里包括細胞培養箱產生的氣霧、培養箱內專用水源以及水浴鍋等設備，AppliChem獨創了專業針對水池抗支原體污染的系列產品。用于容器表面的消毒, 以及二氧化碳培養箱蓄水槽, 各種水箱, 及清洗用水池的消毒。細胞培養中支原體污染的預防培養箱及水源支原體噴霧試劑Incubator-Clean (目錄號：A5230)產品轉為細胞恒溫培養箱及其他儀器表面支原體消毒，能有效預防真菌（及孢子）、細菌（及桿菌孢子）、支原體以及病毒污染（包括 HIV和乙肝病毒）。該試劑活性成分為四芐基胺化合物，試劑不含汞、甲醛、苯酚和乙醇等細胞毒物質，更重要的是，該消毒試劑對細胞無毒副作用，并且是生物可降解的，