熒光定量PCR檢測項目 HBV DNA定量乙肝基因分型乙肝拉米夫定耐藥HCV RNA定量病毒性腦炎 實時熒光定量PCR方法 TaqMan法 方法 TaqMan法TaqMan 水解型雜交探針 5 端標記有熒光報告基團 Reporter R 如FAM VIC等3 端標記有熒光淬滅基團 Quencher Q 探針完整 R所發射的熒光能量被Q基團吸收 無熒光 R與Q分開 發熒光Taq酶有5 3 外切核酸酶活性 可水解探針 5 3 5 5 3 5 ForwardPrimer ReversePrimer TaqMan Probe R Q Taqman實時PCR的反應過程 Displacement 5 3 5 5 3 5 ForwardPrimer ReversePrimer R Q Hydrolysis 5 3 5 5 3 5 Q R PolymerizationCompleted 5 3 5 5 3 5 R Q 每擴增一條DNA分子 釋放一個熒光信號 可以在循環過程中任一點檢測熒光 實時熒光定量PCR定義 在PCR反應體系中加入熒光基團 利用熒光信號累積實時監測整個PCR進程 最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法 實時熒光定量PCR原理實時原理 常規PCR技術 對PCR擴增反應的終點產物進行定量和定性分析無法對起始模板準確定量 無法對擴增反應實時檢測 實時定量PCR技術 利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化 通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析 實時熒光定量PCR原理定量原理 如何對起始模板定量 通過Ct值和標準曲線對起始模板進行定量分析 介紹三個概念 擴增曲線 熒光閾值 Ct值 擴增曲線 熒光閾值 熒光信號閾值 threshold 前15個循環信號作為熒光本底信號 baseline 即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值熒光域值的缺省設置是3 15個循環的熒光信號的標準偏差的10倍手動設置 原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值 同時要盡量選擇進入指數期的最初階段 并且保證回歸系數大于0 99真正的信號 熒光信號超過域值 Ct值 Ct值的定義 PCR擴增過程中 擴增產物的熒光信號達到設定的閾值時所經過的擴增循環次數 Ct值的重現性 Ct值的特點 相同模板進行96次擴增 終點處產物量不恒定 Ct值則極具重現性 定量原理 理想的PCR反應 X X0 2n非理想的PCR反應 X X0 1 Ex nn 擴增反應的循環次數X 第n次循環后的產物量X0 初始模板量Ex 擴增效率 定量原理 在擴增產物達到閾值線時 XCt X0 1 Ex Ct M 1 XCt 熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產物的量 在閾值線設定以后 它是一個常數 我們設為M方程式 1 兩邊同時取對數得 logM logX0 1 Ex Ct 2 整理方程式 2 得 logX0 log 1 Ex Ct logM 3 Log濃度與循環數呈線性關系 根據樣品擴增達到域值的循環數即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量 標準曲線 模板DNA量越多 熒光達到域值的循環數越少 即Ct值越小Log濃度與循環數呈線性關系 通過已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線 根據樣品Ct值 就可以計算出樣品中所含的模板量 確定未知樣品的C t 值通過標準曲線由未知樣品的C t 值推算出其初始量 絕對定量 標本采集和運送 血液標本 用2ml真空采集管或1 5ml高壓滅菌離心管采集血液標本 血標本采集后在2小時內送達實驗室 HCV采用EDTA抗凝的血漿 離心 檢驗單與標本一道 后用一次性吸管吸取血清或血漿加入經消毒的1 5ml的離心管中 腦脊液 由臨床醫生采集后放入消毒的試管中及時送檢 用于臨床標本采集的容器如試管或離心管 均應使用前高壓滅菌和密封標本采集后 應盡可能快的送至實驗室 如運送時間需2小時以上 必須用冰盒送至實驗室 標本中如加入了適當的穩定劑 如用于RNA測定加入4mol L異硫氰酸胍鹽 GITC 的血清 漿 標本和用于DNA測定的EDTA抗凝血等 則可在室溫下運送或郵寄 注 RNA采用EDTA抗凝的全血標本 抗凝后6小時內分離血漿 如使用血清標本則盡快 2小時內 分離血清 嚴禁使用肝素抗凝 定量檢測的臨床意義 治療前進行病毒定量檢測 指導選擇抗病毒藥物 避免盲目用藥 治療后定量PCR直接準確地測定體內病毒數量 有助于療效的判斷 懷孕前進行定量PCR測定 有助于選擇有利的懷孕時機 HBV基因分型 HBV基因型是根據HBV病毒核酸異源性 8 進行分型分為A B C D E F G H等8種亞洲主要為B型以及C型感染HBV后的臨床經過與不同基因型有關 HBV基因型的臨床意義 HBV標志物清除與B基因型相比 C基因型有更高的HBeAg陽性率 分別為16 與53 基因型的自發性HBeAg清除要比C基因型早10年 并且在HBeAg清除后 肝臟生物化學指標持續正常 病毒致病性HBsAg陽性者中 C基因型比B基因型的肝功能異常更為常見 C基因型引起的臨床表現及組織學損傷更嚴重 乙型肝炎的病程及轉歸亞洲無癥狀HBV攜帶中 與B基因型比較 C基因型在肝硬化及50歲以上的肝細胞癌患者中比例較高 而B基因型與50歲以下 特別是35歲以下的肝細胞癌患者有關 藥物敏感性給予干擾素治療時 B基因型的完全應答率達到C基因型的3倍HBeAg陽性乙型肝炎患者使用拉米呋定治療時 發現B基因型患者的HBeAg HBeAb轉陰率達到C基因型的兩倍 HBV不同基因型比較 B型C型流行性低高HBeAg陽性率低高HBeAg自然清除時間短長HBVDNA載量低高致病性輕重HCC發生率低 低年齡組高 高 高年齡組高 干擾素治療完全應答率高低抗病毒治療效果好差肝癌手術治療預后好差癌栓栓塞治療效果好差 注意事項 在病毒定量 103時 檢測基因分型更有意義可能出現分型結果出現陰性 排除本身病毒量低的原因外 患者HBV基因型可能為非B C型 HBV 拉米夫定 拉米夫定 Lamivudine Heptodin 有效 核苷類高效抗乙肝病毒藥物 可迅速降低HBV DNA的滴度 改善肝臟組織的病變 還可能阻止纖維化的進程 終止肝硬化的發展 耐藥 長期服用 會引起HBV基因突變 造成HBV對藥物敏感性大大降低 從而血清中HBV復制恢復活躍 滴度升高 耐藥機理 HBV聚合酶中Y 酪氨酸 M 蛋氨酸 D 天門冬氨酸 D 天門冬氨酸 變異毒株的生物特性 對拉米夫定抗病毒效應的敏感性降低至1 300 DNA減少僅1 7 臨床癥狀 血清ALT水平暫時上升 HBV DNA的濃度上升 并有輕度乏力 惡心等肝臟炎癥損傷加劇等癥狀 I 異亮氨酸 V 纈氨酸 拉米夫定耐藥性 發生率 治療慢性乙型肝炎6個月后出現耐藥性 在亞洲慢性乙型肝炎病人用拉米夫定1年 對拉米夫定敏感性降低的病毒變異發生率達14 甚至可達39 定義 在持續治療中血清HBVDNA再現耐藥差異 檢測靈敏度基礎病毒水平是否多次 多種抗病毒治療 拉米夫定耐藥的臨床意義 耐藥后的臨床情況 發生耐藥變異后1 4個月內雖都有病毒再現 病人的情況也有可能大不相同 無癥狀變異病毒攜帶部分病人可能只是病毒再現 血清轉氨酶持續正常 所以繼續服藥仍能抑制HBV野生毒株 攜帶變異毒株因其生活力低 因此并不會發病 野生毒株轉換有一部分病人停用拉米夫定3 4個月后 變異