KRAS和EGFR檢測與臨床應用 匯報內容 KRAS和EGFR的簡介及臨床意義ARMS PCR的基本原理和技術特點等位特異性引物設計KRAS試劑盒開發簡介 KRAS和EGFR的簡介及臨床意義 KRAS背景 KRAS是一種原癌基因 長約35kb 位于12號染色體 是RAS基因家族成員之一 編碼的蛋白主要參與PI3K PTEN AKT和RAF MEK ERK信號通路的調控 EGFR在通路中位于KRAS上游 配體與之結合后可以激發其酪氨酸激酶活性 導致KRAS的活化和通路中信號傳導 KRAS是許多惡性腫瘤的常見突變基因 胰腺癌 65 90 結直腸癌 40 肺癌 20 卵巢癌 15 KRAS基因突變影響結直腸癌藥物療效 KRAS基因野生型的轉移性結直腸癌患者能從EGF抗體 西妥昔單抗 帕尼單抗 治療中獲益 而基因突變的患者治療效果很差 KRAS突變型患者對西妥昔單抗無應答 其總體生存期明顯低于KRAS野生型患者 KarapetisCS 2008 NEngJMed 結直腸癌患者檢測KRAS突變相關指南 歐洲藥品評估局 EMEA 2008 指出 KRAS野生型的進展期結直腸癌患者可能從帕尼單抗中受益 而突變型患者受益較少 美國臨床腫瘤學會 ASCO 2009 推薦 轉移性結直腸癌患者應檢測KRAS突變 如有KRAS12 13位突變 則不應進行EGFR單克隆抗體治療 美國FDA指南推薦 在使用靶向藥物西妥昔單抗和帕尼單抗治療轉移性結腸直腸癌前必須檢測KRAS基因的基因型 2012年7月6日批準第一個用于結直腸癌的基因檢測 Qiagen 以判斷西妥昔單抗是否有效 美國國立綜合癌癥網絡 NCCN 2014 指南說 轉移性結直腸癌患者均應進行RAS突變檢測 KRAS和NRAS 至少應檢測KRAS第二外顯子的突變情況 KRAS或NRAS突變型的病人不應采取西妥昔單抗或帕尼單抗治療 中國衛生部于2010年10月14日發表了 結直腸癌診療規范 2010版 明確指出在患者確定為復發或轉移性結直腸癌接受西妥昔單抗 帕尼單抗時 必須檢測腫瘤組織的K ras基因狀態 在晚期 轉移性結直腸癌化療中 在治療前檢測腫瘤K ras基因狀態 EGFR不推薦作為常規檢查項目 KRAS基因突變影響非小細胞肺癌藥物療效 KRAS基因野生型的非小細胞肺癌患者能從小分子酪氨酸激酶抑制劑 TKI 如吉非替尼 厄洛替尼 治療中獲益 而基因突變的患者易發生抵抗 KRAS突變型患者使用厄洛替尼聯合化療后 其無癥狀生存期和總生存期明顯低于野生型患者 圖中紅線所示 AndersonSM 2011 ExpertRev Mol DiagnEberhardDA 2005 JClinOncol 非小細胞肺癌患者檢測KRAS突變相關指南 美國國立綜合癌癥網絡 NCCN 2009 指出 KRAS突變與非小細胞肺癌患者TKI抵抗有關 KRAS基因測序有助于確定哪些病人適合TKI治療 當KRAS基因發生了突變 則不建議病人使用厄洛替尼進行分子靶向治療 KRAS主要突變位點 在結直腸癌中 KRAS突變主要發生于codon12 80 codon13 15 20 codon61和146 5 在肺癌中 約97 的KRAS突變發生于codon12 13 其余位于codon61和146 EGFR突變背景 EGFR基因位于染色體7p11 2 大小約200kb 是上皮生長因子 EGF 細胞增殖和信號傳導的受體 EGFR等蛋白酪氨酸激酶功能缺失或其相關信號通路中關鍵因子的活性或細胞定位異常 與腫瘤細胞的增殖 血管生成 腫瘤侵襲 轉移及細胞凋亡的抑制有關 非小細胞肺癌中EGFR突變率在北美和西歐為10 左右 而在東亞為30 50 其中在亞洲 女性 非吸煙 腺癌患者中EGFR突變率最高 達70 80 EGFR突變背景 研究發現EGFR突變與吉非替尼 厄洛替尼的療效密切有關 其中EGFR突變的患者對吉非替尼 厄洛替尼治療敏感 有效率在80 以上 而EGFR野生型的患者的有效率在10 以下 吉非替尼 厄洛替尼作為一線藥物治療非小細胞肺癌 相比傳統的化療可以取得更長的無進展生存期 PFS 且副作用相對較小 患者容易耐受 但總體生存期 OS 并未延長 EGFR TKI目前主要用于非小細胞肺癌一線 二線和維持治療 我國大部分醫生將其用于二線 69 4 治療 41 7 的醫生將其用于一線治療 27 8 的醫生將其作為維持治療藥物 EGFR突變影響肺癌藥物療效 研究表明EGFR突變型患者使用吉非替尼的療效要優于卡鉑與紫杉醇組合治療 而在野生型患者中則相反 使用吉非替尼的療效不如卡鉑與紫杉醇組合治療 MokT S 2009 NEngJMedMaemondoM 2010 NEngJMed EGFR突變檢測相關指南 美國國家綜合癌癥網絡 NCCN 2011版的癌癥治療指南中明確指出 EGFR突變 尤其是外顯子19的缺失突變和外顯子21的L858R突變 與腫瘤對TKIs如吉非替尼治療敏感性有重要關系 而部分EGFR TKI初始治療有效的患者后期會發生耐藥 與EGFR外顯子20突變密切相關 美國臨床腫瘤學會 ASCO 在JCO上發表報告 EGFR TKI是攜帶EGFR突變型的非小細胞肺癌病人的一線治療藥物 有益于進展期非小細胞肺癌患者的個體化治療 歐洲EMEA指出 易瑞沙 吉非替尼 僅對攜帶EGFR突變型的非小細胞肺癌患者有效 平均無進展生存期延長3 5月 美國FDA 2013 批準對擬采用阿法替尼 厄洛替尼等EGFR TKI治療的患者進行EGFR突變檢測的試劑盒 therascreenEGFRRGQPCRKit和cobas EGFRMutationTest 我國 非小細胞肺癌臨床實踐指南 中也明確指出EGFR突變 尤其是19號外顯子缺失突變與腫瘤對酪氨酸激酶抑制劑 TKIs 的敏感度有重要關系 對腺癌 大細胞癌 非小細胞肺癌等肺癌組織學類型 EGFR檢測為一類推薦 EGFR突變位點 常規檢測29個 EGFR突變與EGFR TKI藥物療效關系 ADxEGFR試劑盒突變結果檢測 ARMS PCR的基本原理和技術特點 ARMS PCR原理 ARMS是AmplificationRefractoryMutationSystem 擴增阻礙突變系統 的縮寫 根據PCR過程中要求引物和模板間的嚴格互補配對來實現對突變位點的檢測 當引物3 末端出現錯配時 產物將不能延伸 因此設計兩條上游 或下游 引物 使其3 末端分別與突變位點堿基匹配和錯配 共用下游 或上游 引物 分別擴增野生型和突變型目的片斷 ARMS PCR原理 TwoAllele Specific AS primers oneforeachalleleofaSNParedesigned TheASprimerscontainoneoftwopolymorphicnucleotidesattheprimer3 end Twosetsofprimers eitherforwardorreverseprimerscanbedesigned IfacommonreverseorforwardprimerisusedinaPCRreaction thereactioniscalledallele specificPCR AS PCR YouF M 2008 BMCBioinformatics PCR產物檢測 RealtimePCR 每個PCR循環檢測熒光信號 不同PCR產物 不同熒光信號相比凝膠電泳 更快 可定量 無PCR產物污染信號產生方法 Scorpion Qiagen 雙環探針 廈門艾德 Taqman Molecularbeacons Sybrgreen Yo pro Figure2ThesensitivityofQuanTAS PCRforquantifyingJAK2mutantalleles ZapparoliG V 2013 BMCCancer 應用于Realtime PCR的ARMS PCR ARMS技術特點 優點 靈敏度高 0 1 1 操作簡便周期短不產生PCR產物污染適用樣本類型多 如FFPE 精確突變類型 缺點 方法建立需時較長僅能檢測已知突變 測序法與ARMS法相比較 操作流程及數據解讀 檢測流程與質量控制 標本準備 DNA抽提 突變檢測 分析報告 標本種類標本量 SOPOD260 280 新鮮組織 qPCR FFPE SOP陽性及陰性對照問題及解決 SOP報告標準判讀形式及檢查 使用ARMS的KRAS突變檢測試劑盒 使用ARMS的EGFR突變檢測試劑盒 等位特異性引物設計 KRAS基因序列和常見突變 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag常見突變 三引物設計原理 YouF M 2008 BMCBioinformatics 三引物設計 Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 19nt 51 突變型引物 F 5 cttgtggtagttggagctA 3 19nt 49 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 25nt 54 三引物設計 下游引物設計 ATGACTGAATATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGAGTGCCTTGACGATACAGCTAATTCAGAATCATTTTGTGGACGAATATGATCCAACAATAGAGGATTCCTACAGGAAGCAAGTAGTAATTGATGGAGAAACCTGTCTCTTGGATATTCTCGACACAGCAGGTCAAGAG選擇序列 5 GACGAATATGATCCAACAATAGAGG 3 互補鏈 3 CTGCTTATACTAGGTTGTTATCTCC 5 下游引物 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 3 端增加錯配 如果3 端是弱錯配 C A或G T 則需要引入強的錯配 A G或C T 才可阻斷3 端的擴增 如果3 端是強錯配 A G或C T 則需要引入弱的錯配 C A或G T 或不需引入錯配即可阻斷3 端的擴增 當3 端是中度錯配 A A C C G G或T T 則需要引入中度的錯配 野生型引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTG 3 突變型引物 F 5 cttgtggtagttggagcCT 3 下游引物 R 5 CCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 四引物設計 四引物設計 Atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag內引物 F 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 內引物 R 5 ACTCTTGCCTACGCCACC 3 外引物 F 5 AtgactgaatataaaCT 3 外引物 R 5 CTCTTGACCTGCTGTGTCG 3 KRAS試劑盒開發簡介 KRAS突變探針和引物設計 KRAS序列 atgactgaatataaacttgtggtagttggagctggtggcgtaggcaagagtgccttgacgatacagctaattcagaatcattttgtggacgaatatgatccaacaatagaggattcctacaggaagcaagtagtaattgatggagaaacctgtctcttggatattctcgacacagcaggtcaagag1 5 CTTGTGGTAGTTGGAGCTTA 3 12GGT GAT2 5 AAACTTGTGGTAGTTGGAGCGGT 3 12GGT GTT3 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCTGC 3 12GGT GCT4 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCTA 3 12GGT AGT5 5 AACTTGTGGTAGTTGGAGCGT 3 12GGT TGT6 5 ATAAACTTGTGGTAGTTGGAGCCC 3 12GGT CGT7 5 GTGGTAGTTGGAGCTGGTAA 3 13GGC GAC8 參照引物 5 CTGAATATAAACTTGTGGTAGTT 3 9 下游引物 5 ACCTCTATTGTTGGATCATATTCGTC 3 TaqMan探針 5 FAM TCTGAATTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCT BHQ1 3 鎖核酸阻滯探針 野生型 5 TGGAGCTGGTG