GM-CSF基因修飾的卵巢癌細胞NuTu-19/GM-CSF的構建作者：李奇靈,王英,王運萍,馮彩霞,高尚風單位：西安交通大學醫學院第一附屬醫院婦產科，陜西西安【摘要】目的 構建能分泌表達粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)的卵巢癌細胞NuTu-19/GM-CSF。方法 將T-h GM-CSF重組質粒轉化入感受態大腸桿菌中,篩選出耐藥性單克隆菌落送測序。利用PCR技術擴增出GM-CSF目的基因片段，將PCR產物連入pGEM-T easy載體，轉化入大腸桿菌中擴增，用SDS堿裂解法提取Teasy-GM-CSF重組質粒，用限制性內切酶酶切Teasy-GM-CSF重組載體，連入經相同酶酶切的pLXSN反轉錄病毒載體中。用磷酸鈣沉淀法轉染PA317包裝細胞系進行病毒包裝，用含有病毒的上清液感染卵巢癌NuTu-19細胞，經G418加壓篩選感染成功的NuTu-19/GM-CSF細胞，用免疫細胞化學和ELISA法檢測NuTu-19/GM-CSF分泌表達GM-CSF蛋白的情況。結果 T-h GM-CSF重組質粒測序結果與GenBank Accession#：NM_000758基因序列對比后確定為人類GM-CSF基因編碼序列；PCR產物酶切電泳在Mark 400-500 bp中有一條帶，符合GM-CSF基因序列長度；重組Teasy-GM-CSF質粒用EcoR、BamH限制性內切酶酶切后，電泳鑒定在400-500 bp之間有一目的條帶，重組反轉錄病毒質粒pLGM-CSFSN酶切電泳有目的條帶；G418加壓篩選感染后的NuTu-19細胞，14 d后慢慢形成單克隆繼續生長；免疫細胞化學檢測到感染成功的NuTu-19細胞膜表面有明顯的棕褐色顆粒沉淀，ELISA法檢測細胞培養上清液中GM-CSF的質量濃度為150 pg/mL。結論 成功構建了能分泌表達人GM-CSF蛋白的卵巢癌細胞NuTu-19/GM-CSF，為以后研究卵巢癌免疫治療提供必備、有效、可靠的工具基礎。 【關鍵詞】 NuTu-19細胞 粒細胞單核細胞集落刺激因子 卵巢腫瘤 免疫治療Construction of ovarian cancer cell NuTu-19/GM-CSFgenetically modified by GM-CSFLi Qiling, Wang Ying, Wang Yunping, Feng Caixia, Gao Shangfeng(Department of Gynecology and Obstetrics, the First Affiliated Hospital, Medical School of Xian Jiaotong University, Xian 710061, China)ABSTRACT: Objective To construct NuTu-19/GM-CSF ovarian cancer cells which can secrete and express granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF). Methods The T-h GM-CSF recombinant plasmid was transformed into competent Top109 Bacillus colis and the positive colonies were cultivated in soft agar medium. The T-h GM-CSF recombinant plasmid was used as models to amplify GM-CSF gene fragment by PCR. The certain fragment was linked with the pGEM-T easy vector and transformed into Top109 bacillus coil. SDS alkaline lysis was used to get T easy-GM-CSF recombinant plasmid with pLXSN retrovirus vector cut by the same enzymes. The pseudotype virus was packed after transfecting PA317 cells using calcium phosphate precipitation. The supernate fluid which contained virus to infect NuTu-19 cells was saved. The positive cells were harvested through pressurizing selected by G418. The GM-CSF protein secreted by NuTu-19/GM-CSF cells was tested by immunocytochemistry and ELISA. Results T-h-GM-CSF included the human GM-CSF gene fragment which contained 435 bp and signal peptide coding region, compared with the sequence of Genebank Accession#: NM-000758. Production of PCR was between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis, and had the same length with hGM-CSF gene. There was an electrophoretic strap between 400 bp and 500 bp and the sequence of the cutting fragment was completely correct after cutting T easy-GM-CSF recombinant plasmid by EcoR and BamH enzymes. It showed that the amplification ofthe GM-CSF gene fragment and the connection with T easy vector were successful. There was still the same strap between 400 bp and 500 bp in the agarose electrophoresis of pLGM-CSFSN after being cut by EcoR and BamH enzymes. The infected NuTu-19/GM-CSF cells cultivated in medium containing G418 continued to grow in the forms of monoclone 14 days later. There were some visible granules on the surface of the cellular membrane. The amount of GM-CSF in suspent liquid of cells culture was 150 pg/mL tested by ELISA. Conclusion The construction of NuTu-19/GM-CSF which can secret and express GM-CSF protein is successful, and offers effective and necessary basis for future study on ovarian cancer immunotherapy.KEY WORDS: NuTu-19 cell; granulocyte-macrophage colony-stimalating factor (GM-CSF); ovarian cancer; immunotherapy卵巢癌是女性生殖系統常見的惡性腫瘤之一,其主要特點是隱蔽性高，臨床不易被發現，易發生轉移。近20年來國際婦產聯盟(FIGO)提出-期卵巢癌患者5年生存率一直徘徊在15%-30%，病死率高居婦科腫瘤首位，其根本原因在于腫瘤的復發和轉移。在過去的20多年內，免疫治療是繼手術、放療、化療外的又一大腫瘤輔助療法。我們利用分子生物學技術構建了能分泌表達人粒細胞-單核細胞集落刺激因子(GM-CSF)蛋白的大鼠卵巢癌細胞NuTu-19/GM-CSF，為其用于卵巢癌免疫治療研究打好基礎。1 材料與方法1.1 材料 原發性大鼠卵巢上皮性腺癌NuTu-19細胞由原華西醫科大學王和教授惠贈本室保存。T-h GM-CSF重組質粒由中國醫學科學院中國協和醫科大學基礎醫學院陳松森教授饋贈。TOP109細菌由西安華廣生物有限公司提供，由本室保存，包裝細胞系PA317細胞、反轉錄病毒載體pLXSN購于美國Colontech公司，pGEM-T easy載體購于美國Promega公司。1.2 試劑 Taq DNA聚合酶及dNTPs、T4 DNA連接酶均為立陶宛Fermentas MBI公司。RPMI1640培養基購于美國Gibco公司，胎牛血清為杭州四季青公司產品，EcoR、BamH限制性內切酶購于華美生物有限公司，兔抗人GM-CSF多克隆抗體為武漢博士德公司產品，山羊抗兔二抗為美國Jacksonimmuno公司產品，ELISA檢測試劑盒購于北京中昊時代生物技術中心。1.3 實驗方法1.3.1 含有目的片段的反轉錄病毒載體的構造 將T-h GM-CSF重組載體轉入感受態TOP109大腸桿菌中，在Amp+瓊脂培養基中篩選出抗藥性單克隆，擴增、測序鑒定后，以此載體為模板設計引物，采用PCR方法擴增出GM-CSF編碼區。引物為：正向引物F鏈為5′-CGAATTCATGTGGCTGCAGAGCCAGC；反向引物R鏈為5′-CGGATCCTCACTCCTGGACTGGCTC，并分別引進EcoR酶BamH酶切位點。PCR擴增產物連入pGEM-Teasy載體中，用相同方法篩選出單克隆擴增后再次酶切電泳送測序鑒定。鑒定正確后用EcoR和BamH酶切Teasy-GM-CSF重組質粒，切出GM-CSF目的基因連入經相同酶酶切后的反轉錄病毒載體pLXSN中，酶切電泳鑒定后大量擴增，制備重組反轉錄病毒載體pLGM-CSFSN重組質粒。1.3.2 細胞培養及條件 PA317細胞、NuTu-19細胞均用含100 mL/L胎牛血清RPMI 1640培養基于37 50 mL/L CO2飽和濕度培養箱內培養。1.3.3 磷酸鈣沉淀法包裝病毒 PA317細胞傳代，在PA317細胞80%成片時棄上清液后加入新鮮培養液5 mL，后緩慢加入轉染液500 μL，輕輕混勻后置37 50 mL/L CO2飽和濕度培養箱內培養，顯微鏡下觀察細胞立體結構變模糊，胞膜胞內可見細小顆粒時換液為100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培養液，3 d后收病毒液。1.3.4 G418最佳藥物濃度的選擇 取6孔板加入未經轉染的NuTu-19細胞懸液(約1 000 cell/mL)，培養6 h后依次分別加入含有G418的培養液,質量濃度分別為50、100、200、400、600、800 μg/mL培養液培養細胞，3-5 d換液1次，14 d后確定最佳篩選濃度。1.3.5 制備GM-CSF修飾的NuTu-19/GM-CSF細胞 選對數生長期貼壁良好的NuTu-19細胞進行病毒轉染。細胞內加入5 mL含10 g/L polybrene病毒液輕輕混勻后，置37 50 mL/L CO2飽和濕度培養箱內培養，6 h后換液，反復轉染5次后換液培養。后加入G418 100 μg/μL，長滿培養瓶壁后撤去G418。1.3.6 免疫細胞化學方法檢測NuTu-19/GM-CSF細胞分泌表達GM-CSF蛋白 分2組：A組為未轉染的NuTu-19細胞，B組為轉染的NuTu-19/GM-CSF細胞，丙酮固定30 min，7.5 mL/L H2O2-PBS液37 孵育30 min后用PBS清洗。50 mL/L TritonX-100 37 下孵育30 min后再次PBS洗3遍，滴加山羊血清，室溫下孵育20 min后傾去殘留血清，滴加1200稀釋后的大鼠抗人GM-CSF一抗，37 下置濕盒內60 min后用PBS輕輕沖洗3次。滴加抗兔二抗(11 000稀釋)室溫下孵育2 h后，滴加新鮮配制的0.6 g/L DAB顯色液，室溫下濕盒內放置20 min后，用自來水洗5 min后顯微鏡下攝片。1.3.7 ELISA法檢測NuTu-19/GM-CSF細胞分泌表達GM-CSF蛋白 設標準孔8個，以未進行質粒轉染的細胞上清液作為空白對照，以反轉錄病毒載體pLXSN轉染組細胞的培養上清液為陰性對照，每個樣本做3個復孔，測定細胞轉染上清液中GM-CSF蛋白表達水平。結果用Bio-Rad Model680 Microplatereader于波長490 nm處測定吸光度(A)值表示，結果以實驗組/陰性對照組≥2.1判為陽性。2 結果2.1 含有目的片段的反轉錄病毒載體的構造 T-h GM-CSF重組質粒送測序結果與GenBank Accession#：NM-000758基因序列對比后確定為人類GM-CSF基因編碼序列，從ATG-TGA共435個堿基對，含有信號肽編碼區。T-h GM-CSF質粒序列正確。PCR擴增出目的片段經透析膜回收法回收，10 g/L瓊脂糖電泳后可見一條帶在400 bp-500 bp之間(圖1)；后連入T-easy載體中用EcoR和BamH酶切，鑒定結果有目的片段切出(圖2)，遂再次送測序，經軟件分析PCR擴增產物為GM-CSF目的片段，且成功連入T-easy載體中。用EcoR和BamH酶切出目的片段連入經相同酶切的pLXSN反轉錄載體擴增后酶切鑒定，可見目的片段切出(圖3)。2.2 轉染結果 PA317細胞轉染后第2天細胞部分死亡，3 d后收病毒上清液保存于-20 冰箱內。2.3 G418最佳藥物濃度的選擇 G418濃度篩選第8天時50、100 μg/μL培養孔內部分細胞死亡，200 μg/μL及以上孔內大部分細胞死亡，14 d后100 μg/μL孔內細胞全部死亡，50 μg/μL孔內細胞尚有一部分細胞貼壁存活，其余孔14 d前全部死亡，遂選100 μg/μL質量濃度為G418篩選抗性NuTu-19/GM-CSF細胞的篩選濃度。2.4 制備GM-CSF修飾的NuTu-19/GM-CSF細胞NuTu-19細胞重復病毒感染培養3 d后傳代并加入G418加壓篩選，14 d后絕大部分細胞死亡，瓶內形成單克隆細胞集落，后細胞集落開始生長成片，25 d后撤去G418，繼續培養細胞至貼滿瓶壁。2.5 免疫細胞化學結果 轉染的NuTu-19細胞胞膜表面有深棕褐色著色，與未轉染的NuTu-19細胞形成鮮明對比，胞質內較少見明顯褐色顆粒沉淀(圖4、圖5)。2.6 NuTu-19/GM-CSF細胞分泌表達GM-CSF蛋白檢測結果 pLGM-CSFSN轉染的NuTu-19細胞的培養上清ELISA檢測GM-CSF，其A值為1.267±0.07；空質粒pLXSN轉染的NuTu-19細胞培養上清其A值為0.32±0.02，實驗組/陰性對照組>2.1，表明pLGM-CSFSN轉染細胞后能夠表達GM-CSF，質量濃度約為150 pg/mL。3 討 論隨著腫瘤免疫學的不斷深入發展，腫瘤免疫治療也隨之發展并逐步成為人們研究治療腫瘤的新熱點。目前腫瘤免疫治療主要包括多肽類疫苗、基因疫苗、樹突狀細胞疫苗和腫瘤全細胞疫苗，其中腫瘤全細胞疫苗可以將所有可能與腫瘤相關的抗原加工提呈給抗原提呈細胞(APC)，從而激起體內有效的抗腫瘤免疫反應。考慮到腫瘤細胞的弱抗原性，許多研究者結合免疫佐劑、細胞因子或者與樹突狀細胞融合制備疫苗，使機體能將更多的腫瘤抗原提呈給T淋巴細胞，激起體內更強的抗腫瘤效應。GM-CSF不僅促進骨髓造血細胞系的存活、生長、分化,而且還能促進成熟的巨噬細胞、粒細胞和樹突狀細胞的存活、生長、分化及功能活化1。它是由T細胞、單核細胞、上皮細胞和纖維細胞等多種細胞在受到免疫刺激時分泌的。盡管分泌具有局限性，但能通過旁分泌的作用來招募中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞來增強宿主的防御能力2。GM-CSF還可以通過活化Jak/STAT信號途徑抑制早期多核嗜中性淋巴細胞的自發性凋亡3。目前世界公認用GM-CSF生物制劑用于治療化療后白細胞減少是有效的，并廣泛應用于臨床。在腫瘤免疫治療的研究中，Dinc等4用二甲肼在大鼠體內造結腸癌腫瘤模型中研究發現GM-CSF能降低腫瘤的發生率。Dranoff等5比較TNF、GM-CSF等10種細胞因子基因的抗腫瘤作用，發現反轉錄病毒介導的GM-CSF最有潛力，它能引起持久的特異性抗腫瘤效應。此后GM-CSF被廣泛應用于腫瘤治療的研究中。GM-CSF做為抗腫瘤免疫治療佐劑的研究已相當成熟，并部分應用于臨床研究中。日本于1998年進行轉GM-CSF基因的自體腎癌細胞瘤苗對晚期患者行在體免疫治療的第一期臨床研究，受試對象為第IV期腎癌腫瘤患者伴肺轉移，結果表明基因修飾的瘤苗治療在體實驗無明顯的毒副作用，不僅有抑制腫瘤惡化進展的趨勢，且在腫瘤組織病檢中發現腫瘤組織中有大量的淋巴細胞浸潤，以CD8+細胞為主6。此外在前列腺癌、黑色素瘤中的治療研究中也得到相同的效應。無論動物實驗或者臨床實驗均未見到GM-CSF修飾的瘤苗在治療研究中會引起嚴重的不良反應，其大部分不良反應只包括頭疼、發熱、局部注射部位紅腫發熱等7。近期研究表明GM-CSF在正常卵巢組織中亦有少量表達，大部分由黃體組織合成分泌的，盡管GM-CSF不是卵巢生長所必需的，但它不僅對從卵泡期到黃體期轉變過程起重要作用，而且還可以通過活化黃體期卵巢組織中的巨噬細胞來調節體內類固醇激素的生成8。國內外對GM-CSF是否促進卵巢腫瘤細胞增殖也進行了許多研究，目前研究結果不支持GM-CSF有促進卵巢腫瘤細胞增殖的作用9。所以，GM-CSF是一種比較理想也比較成熟的免疫佐劑，安全有效且其本身具有一定的抗腫瘤效應。本實驗是利用分子生物學方法構建含有人GM-CSF基因的重組反轉錄載體pLGM-CSFSN，經包裝細胞PA317包裝病毒后感染NuTu-19細胞，經G418加壓篩選后獲得感染成功的NuTu-19/GM-CSF細胞，并從形態學方面檢測與未感染的NuTu-19細胞相比，感染后的NuTu-19/GM-CSF細胞分泌表達GM-CSF蛋白量明顯增多，且成功分泌表達到胞外，其分泌量約為150 pg/mL。免疫細胞化學結果發現轉染的NuTu-19細胞胞膜表面有深棕褐色著色，與未轉染的NuTu-19細胞形成鮮明對比。胞質內較少見明顯褐色顆粒沉淀可能一方面是GM-CSF本身攜有信號肽,是一種分泌性蛋白，合成之后在信號肽引導下穿胞膜分泌到細胞外上清液中，另一方面由于G418加壓篩選本身對細胞來說是一種損傷。 總之，本實驗將GM-CSF基因整合修飾卵巢癌細胞，使其穩定表達GM-CSF蛋白，為下一步動物實驗進行免疫治療研究奠定安全、可靠、有效的基礎。【參考文獻】 1Inaba K, Inaba M, Romani N, et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte-macrophage colony-stimulating factor J. J Exp Med, 1992, 176(6):1693-1702.2Shi Y, Liu CH, Robert AI, et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and T-cell responses: What we do and dont know J. Cell Res, 2006, 16(2):126-133.3Fortin CF, Larbi A, Dupuis G, et al. GM-CSF activates the Jak/STAT pathway to rescue polymorphonuclear neutrophils from spontaneous apoptosis in young but not elderly individuals J. Biogerontology, 2007, 8(2):173-187.4Dinc S, Ozbirecikli B, Kuru B, et al. Long term administration of granulocyte-macrophage colony stimulating factor decreases development of 1-2 dimethylhydrazine-induced colon cancer in rats J. J Surg Oncol, 2007, 95(1):12-21.5Dranoff G, Jaffee E, Lazenby A, et al. Vaccination with irradiated tumor cells engineered to secrete murine granulocyte-