CD40分子在B細胞發育分化中的作用國外醫學免疫學分冊2000年第23卷第1期蘇州醫學院免疫學研究室，江蘇蘇州 215007 周照華摘 要 B淋巴細胞在胚肝及骨髓中生成并經過一定階段的分化發育，再遷移至外周免疫器官（包括淋巴結、脾臟及扁桃體）作為成熟的slgD+slgM+B細胞,亦稱幼稚B細胞；在抗原特異性免疫反應中，B細胞經一系列連鎖事件而成為分泌Ig的漿細胞或記憶性B細胞，這些事件包括特異性抗原識別、激活、擴增、體細胞突變、同種型轉換和分化等。這些抗原依賴性事件發生在次級淋巴器官及非淋巴器官的不同區域，同時，B細胞必須與抗原以及T細胞、DCs等其他細胞發生接觸及相互作用。這種相互作用是通過一系列不同的細胞膜表面分子及細胞因子來實現。其中最關鍵的膜分子之一是CD40分子。本文就B淋巴細胞的發育與分化過程中CD40分子可能的作用及其機制研究進展作一綜述。關鍵詞：CD40分子B淋巴細胞發育分化1 CD40分子對B淋巴細胞的增殖效應 抗CD40單抗因其能與IgM抗體或佛波脂（phorbol csters）共刺激使純化的B細胞擴增而著名1。1991年Banchereau等報道了“CD40系統”。所謂CD40系統，就是在培養體系中加入轉染了人的Fc（CD32）的鼠纖維母細胞以及CD40活化型單抗。由于FcR與CD40單抗的Fc部分共價結合，從而使CD40單抗發生交聯，繼而培養體系中B細胞膜表面CD40分子交聯，從而使擴增效應大為提高。CD40系統能導致B細胞（input b cells）擴增35倍，如果常規培養基足夠豐富，這種培養系統可保持3周。該系統能使各種B細胞亞群（包括sIgD+,sIgM+幼稚B細胞，生發中心CD38+sIgD+B細胞，CD38-sIgD-記憶B細胞以及CD5-及CD5-B細胞）擴增。用抗Ig抗體或SAC（金黃色葡萄球菌）共激發抗原受體導致更高的增殖效應。在CD40系統中培養的B細胞，如果加入IL-4或IL-13將導致其長期增殖和正常B細胞系或B細胞克隆呈因子依賴性長期生長。CD40系統與IL-4共培養的細胞表達CD19、CD20、CD40、sIg，高表達CD23以及HLA class 抗原2。IL-10能提高CD40激活的B細胞增殖，并且在早期培養中幾乎與IL-4樣有效。IL-4與IL-10聯用導致額外的細胞增殖，單用IL-2很少會增加抗CD40激發B細胞的增殖作用。因IL-10上調抗CD40激發的B細胞上CD25/Tac的表達時加入IL-2會強烈提高B細胞的增殖效應3。在IL-10作用下，B細胞可形成凝集（aggregation），并能形成漿母細胞(Plasmabaasts)。用CD40L來替代CD40單抗研究發現，IL-13+CD40L引起扁桃體及脾臟B細胞增殖，但不能引起外周血B細胞增殖（可能由于外周血B細胞增殖通常需要更強的刺激）；但IL-13+CD40L能阻止外周B細胞凋亡，這是因為IL-13+CD40L，引起外周血B細胞高表達BCL-2家族基因成員BCL-XL及MAL-1，BCL-XL在保持靜止及激發后的B細胞存活中起關鍵作用，而MAL-1在調節靜止B細胞存活中起作用。但BCL-XL及MAL-1是否對IL-13+CD40L抑制的外周B細胞凋亡是必須的，還須經基因敲除技術才能直接證實4。2 CD40分子對外周及生發中心B細胞的分化效應 CD40分子的激發與不同細胞因子協同可對B細胞的分化產生不同的效應。在CD40系統中與SAC顆粒共培養的人B細胞不但增殖強烈，而且令人驚異地產生大量的IgM、IgG和IgA，但無IgE產生5.。因為幼稚sIgD+ sIgM+B細胞只分泌IgM,而sIgD-sIgM-B細胞分泌IgG和IgA及一些IgM，提示：sIg和CD40的雙刺激導致B細胞分化。在以上的培養條件下，B細胞分泌大量的IL-6和IL-10，而IL-6和IL-10的拮抗劑能導致Ig的分泌抑制。另外，CD40與B細胞抗原受體（BCR）雙刺激信號在體外實驗中引起靜止期B淋巴細胞表達生發中心（GC）細胞表型，包括CD38、CD95（FAS/APO-1）及羧肽酶M（CPM），其中發生中心表型CPM的出現是依賴BCR刺激的，而這些活化的B細胞，在去除CD40或BCR刺激后20小時后出現存活率降低現象6。在CD40激發的B細胞中增加IL-4或IL-13，IgM及IgG產量稍有增加，并且緊隨同種型轉換有IgE的分泌；在CD40被激發的B淋巴細胞中增中IL-10，結果有除IgE以外的相當量的IgM、IgG及IgA的產生，這是分化到漿細胞的結果，IL-10能誘導CD40被激發的扁桃體B細胞分泌IgG1、IgG2及IgG3；CD40被激發的幼稚sIgD+sIgM+B細胞主要分泌IgM，但加IL-10后亦有IgG1及IgG3分泌，提示IL-10可能是某些IgG亞群的轉換因子7.。CD40被激發的幼稚sIgD+sIgM+B細胞加IL-10培養后產生低水平IgA，如同時增加TGF會誘導大量的IgA阻止IgM及IgC的產生8。因而，激活B細胞上的CD40啟動了其同種轉移機制，其特異性最終由細胞因子決定。最近有學者報道，CD70（轉基因細胞）通過B細胞上CD27分子亦能阻止IL-10介導的B細胞凋亡。在與細胞因子的共同作用下，刺激B細胞抗原受體或激發其CD40分子，結果導致CD27分子表達，并得出結論：CD40/CD154相互作用發生在B細胞活化的早期相，并導致某個記憶B細胞池的擴增。然后記憶B細胞通過活化的TH細胞經由CD27/CD70途徑及一些細胞因子如IL-2、IL-10等分化成漿細胞8。3 CD40分子對B淋巴祖細胞的激發作用 可溶性抗CD40抗體既不激發正常的CD19+CD10+前體B細胞（BCP）增殖，亦不改變這群細胞已知的生長信號，IL-4+CD40系統亦不能使CD19+CD10+ bCP生長。然而IL-3+CD40系統能使CD19+CD10+ bCP生長。激活的CD4+T細胞克隆表達的CD40L能激發BCP上的CD40誘導其擴增9。用抗CD40單抗能阻斷這種T細胞依賴性BCP擴增，高IgM綜合征病人T細胞克隆因表達非功能性CD40L，表明這個由CD40L提供的信號在B細胞分化中具有重要作用。但在上述兩培養體系中BCP并沒有分化成熟為sIg+B細胞。有趣的是，CD40的激發能導致BCP膜表面高水平的CD23表達。CD23分子涉及髓細胞的生成(myelopoiesis)及T細胞個體發生（ontogeny）。另外前體B細胞對CD40刺激的反應可能擴展到骨髓前體細胞，因其均高表達CD4010，在患有性聯高IgM綜合征的病人中經常觀察到嗜中性白細胞減少癥（neutropenia）11，提示，在骨髓前體細胞上的CD20可能是功能性的。所以研究在骨髓微環境能否檢測到CD40L表達細胞以便最終證明CD40依賴的BCP激活的生理機制具有重要意義。4 CD40分子介導信號的有關分子機制 CD40是分子量48KD的細胞表面受體，表達于很多細胞類型，包括B細胞及抗原遞呈細胞，是型跨膜糖蛋白，其基因定位于20q11，屬神經生長因子受體（NGFR）/腫瘤壞死因子受體（TNFR）超家族。該家族成員還有Fas（CD95）、CD27、CD30、OX40等，該家族被認為在淋巴細胞抗原選擇方面起關鍵作用，這種作用具有雙向性，可以維持細胞存活，也可以誘導其凋亡12。在抗原特異性反應中，T輔助細胞通過CD40配體激發生發中心細胞的CD40分子，使生發中心細胞免于凋亡。與此相反，經由FAS/APO-1的信號導致細胞凋亡。Fas缺陷型小鼠患有自身免疫性綜合征，就是因為不能清除自身反應性淋巴細胞13。在生發中心，B細胞CD40分子的激發引起Fas分子的表達，而經由CD40及Fas的信號具有雙向協同作用，其作用的方向性由BCR調節；外源性抗原對其對應BCR的強烈刺激，導致該B細胞克隆擴增；相反，自身抗原對其對應BCR的慢性刺激，導致該B細胞克隆凋亡；在親和力成熟過程中，BCR不能與抗原接觸的B細胞克隆亦將凋亡14。近年來，有關CD40信號傳導的分子機制研究發展非常迅速，其研究主要是基于對惡性B淋巴細胞CD40分子激活后信號傳導途徑的研究。由于惡性細胞是正常細胞在某一分化階段惡變的結果，因此研究結果也就模擬了體內正常B細胞的行為15。對非何杰金氏淋巴瘤（NHL）的研究表明，經CD40活化后的NHL，上調性表達CD80和CD86以及其它一些粘附分子，成為功能性抗原遞呈細胞（APC），類似于正常活化的B細胞16。神經生長因子受體家族胞漿外區高度同源，均有很多保守的半胱氨酸殘基，并且都顯著地表達于造血細胞。而胞漿內信號傳導部分相互差別很大。根據其胞內結構，可將該家族成員分成兩類，一類包括TNF-R1、Fas/APO-1、DR3、DR6、TRAIL-R1以及TRAIL-R2，其胞漿內包含有能激活caspase酶的“死亡區”（death domain）;另一類包括TNF-R2、CD40、LT-R、CD27，其分子胞漿內區段結構很小，缺乏固有的death domain及蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性。然而當CD40胞外部分被激活后，通過一系列分子與CD40胞漿區段相互作用，發生廣泛的蛋白酪氨酸磷酸化、絲/蘇氨酸特異性蛋白激酶以及磷酸肌醇的激活。現已證實，CD40分子的活化可能導致了內源性TNF的自分泌并通過與TNR-R1結合而導致信號的傳導17。首先在確認的兩個TNF受體相關蛋白TRAF1及TRAF2的基礎上，發現另外一系列與CD40相關的成員即TRAF3、TRAF5、TRAF6，其中較為明確的為TRAF3，又稱為CD40bp或CRAF118。TRAF2和TRAF3蛋白與CD40胞漿區段相關，對信號傳導非常重要。目前認為，這些蛋白分子主要介導兩類不同信號，一類由TRAF1/TRAF2及TRAF6介導，導致B細胞活化并產生抗凋亡信號；另一類信號由TRAF3介導，與凋亡相關。CD40分子信號傳導過程中一個可能的分子事件是：在CD40未被激發時，TRAF以單體（monomers）存在，而當CD40分子發生交聯后，TRAF發生多聚化(multimeriztion)。TRAF2和TRAF3蛋白的N末端鏈均包含一個鋅指狀基序（Zinc ring finger motif），這與其它DNA結合蛋白及轉錄調控予結構類似，由此推斷TRAF蛋白的多聚，結果將導致NF-KB或NF-KB類似的轉錄復合物的激活19。同時，在CD40信號傳導過程中胞內發生蛋白酪氨酸激酶（PTK）激活及絲/蘇氨酸磷酸化，并且與CD40相聯的TRAF的單體或多聚體是受絲/蘇氨酸激酶及CD40胞漿區磷酸化所調節。但TRAF多聚化與PTK激活之間相互作用機制尚未明確。對Burkitt淋巴瘤細胞株的轉基因研究表明，CD40介導的信號傳導途徑與EB病毒基因轉化產物LMPI介導的途徑有很多共同之處，為CD40傳導途徑的最終確定提供了重要參考手段20。業已證實，在B細胞發育所經歷的不同分化階段中，一些信號元件、抑制物和受體可能表達，亦可能消失，有的會保持某種形式的“永生性”。說明在不同分化階段，信號傳導及調節途徑各不相同。CD40的激發亦可能導致多種胞內信號途徑。而基因表達及調節的最終結果是直接涉及到細胞周期調控，如細胞周期依賴性激酶（cdk）基因等。在CD40介導的信號途徑中，涉及到Ig同種型轉換及T細胞活化有關的共刺激分子（如B7分子）的表達，因此B細胞中的CD40介導的信號最終直接誘導了NF-KB、NF-KB樣轉錄因子和AP-1、NF-AT等轉錄因子復合物的表達。而B細胞活化的其它途徑包括BCR和細胞因子受體及一系列其它B細胞表面蛋白的信號，也可能就在轉錄水平與CD40信號途徑整合，最終導致B細胞作出相應的反應。總之，B細胞的發育與分化是經歷多種途徑，而CD40介導的信號傳導途徑其細節仍待進一步探討，何種蛋白-蛋白相互作用是CD40信號路徑與其它B細胞表面分子信號途徑的樞紐，仍是研究者們面臨的挑戰。基金項目：國家自然科學基金資助課題（No.39600056）作者簡介：周照華（1968-），男（漢族），江蘇泰興人，蘇州醫學院講師，博士審校者：蘇州醫學院免疫研究室張學光參考文獻 1 Valle A et al .Eur J Immunol,1989;19:14632gabbert et al .J Immunol,1994;152:223fluckiger et al .J Exp Med,1993;178:14734lomo Jon et al .Blood,1997;89:44155defrance et al