分離培養及鑒定骨髓間充質干細胞的方法探析論文 骨髓間充質干細胞（BMSCs）也被稱為間質祖細胞，由于其巨大的增殖和多向分化潛能，被認為是再生醫學、基因治療和細胞治療的理想種子，已被廣泛進行研究1-3.目前，BMSCs在動物實驗和臨床應用上取得了巨大的成果，在骨、軟骨、肌腱、神經膠質修復、心臟疾病、心肌梗塞、肝臟損傷等方面取得了重大突破4-6,并且可避免胚胎干細胞和異基因干細胞治療所涉及的倫理道德和免疫排斥問題，有利于細胞移植。但是骨髓中的BMSCs含量極少，約占骨髓全細胞的0.001%0.010%7;因此，需要在體外分離純化、培養擴增來滿足臨床應用和實驗研究。研究表明，不同分離方法和首次換液方式對BMSCs的增殖培養有很大的影響8.本試驗通過觀察2種不同分離方法和不同首次換液時間對兔BMSCs生物活性的影響，旨在建立一種有效的分離培養及鑒定BMSCs的方法，以便獲得大量、高純度、高活性、培養周期短的BMSCs,為下一步研究和臨床實驗提供基礎。 1材料與方法 1.1實驗動物1月齡雄性新西蘭大耳白兔1只，由河南省實驗動物中心提供。 1.2主要試劑和儀器胎牛血清（北京四季青）；DMEM-F12（Gibco）；胰蛋白酶（北京拜爾迪生物公司）；DMSO（Gibco）；紅細胞裂解液（北京賽馳生物技術有限公司）；生物素標記山羊抗兔IgG、HRP標記鏈霉親和素、DAB顯色試劑盒、改良型蘇木素（北京華肽先鋒）；兔抗兔CD34、CD44、CD99抗體（北京博奧森）；封閉山羊血清（北京博奧森）。 HF151UV型CO2培養箱（HealForce）；倒置顯微鏡（Leica）;800型離心機、85-2恒溫磁力攪拌器：金壇市大地自動化儀器廠；數碼相機：日本佳能IXUS980IS;電子天平：METTLERTOLEDOAL104;超凈工作臺：AIRTECH;FX101-2型電熱鼓風干燥箱：上海樹立儀器儀表有限公司；pH計：上海雷磁儀器廠。 1.3BMSCs的提取用陸眠寧（846）將1月齡新西蘭大耳白兔麻醉，腿部去毛消毒，無菌條件下分離股骨、脛骨，剔除脂肪和肌肉，PBS液反復沖洗，剪斷兩側干骺端，盡量多保留干骺端，DMEM-F12培養液反復沖洗骨髓腔于A、B兩個10mL的離心管內，直至骨髓腔發白，1000r/min離心5min,棄上清。 1.4全骨髓貼壁法A管用PBS重懸細胞，1000r/min離心5min洗滌2次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1100雙抗）培養液重懸細胞，接種至3個25cm2培養瓶，補足培養液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37、5%CO2條件下培養。以后每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳代培養。先棄去舊培養液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以12的比例傳代培養，每3d換液1次。每天在倒置顯微鏡下觀察細胞形態。 1.5紅細胞裂解法B管加入1mL紅細胞裂解液重懸細胞，靜置13min,待液體由紅色變為白色后，加入5mLPBS液，1000r/min離心2次，5min/次，棄上清。吸取3mL含10%FBS的DMEM-F12（1100雙抗）培養液重懸細胞，接種至3個25cm2培養瓶，補足培養液至5mL,輕柔吹打均勻。置于37、5%CO2條件下培養。 2d后首次換液，以后每3d換液1次，待細胞生長融合至80%時傳代培養。先棄去舊培養液，PBS液浸洗。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA,37條件下孵育3min,含血清的DMEM-F12終止消化。以12的比例傳代培養，每3d換液1次。每天倒置顯微鏡下觀察細胞形態。 1.6兔BMSCs細胞活性檢測及生長曲線繪制培養48h時，各取一瓶細胞，棄去培養基，用PBS沖洗2遍，倒置顯微鏡下觀察細胞。0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化后，0.4%臺盼藍染色，血球計數板計數活細胞（未著色）和死細胞（著色細胞）。分別計算出2種不同分離方法的細胞活性。上述試驗重復3次。 選取生長良好的P1、P3和P8代細胞，以2.0104個/孔，接種于24孔培養板中，每孔1mL,每3d換液1次，每隔1d取3孔，消化后計數，取其平均值為當天的細胞數，連測8d,以培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標，繪制細胞生長曲線。 1.7首次換液時間對兔BMSCs的影響將用紅細胞裂解法分離得到的兔BMSCs按首次換液時間隨機分為4組：12h換液組、24h換液組、48h換液組、72h換液組，以后每3d換液1次，記錄傳代前各組03代各代培養時間，各代細胞均保留3瓶。 1.8細胞免疫組化鑒定兔BMSCs收集紅細胞裂解法的P3代細胞，制備細胞爬片，常規SABC免疫組織化學方法檢測表面抗原CD34、CD、CD45、CD90的表達。 1.9統計學處理所得數據以均數標準誤表示，應用SPSS16.0統計學軟件進行處理，采用單因素方差分析（one-wayANOVA），用MicrosoftExcel軟件作圖。 2結果 2.1不同分離方法對兔BMSCs形態和生長的影響 剛接種時，2種不同分離方法所得的原代細胞在倒置顯微鏡下觀察細胞呈圓形，大小一致，折光性強，不容易區分。培養48h后，A、B兩組細胞均可看見有圓形、短梭形、多角形細胞貼壁。 B組貼壁細胞較A組細胞多（圖1）。臺盼藍染色檢測細胞活性全骨髓貼壁法（A組）為90%,紅細胞裂解法（B組）為96%.隨著培養的繼續，大量細胞貼壁，并出現典型的BMSCs細胞集落，緊密排列。 A組細胞生長較緩慢，所得細胞純度較低；B組細胞生長較快，純度較高。原代細胞達到傳代的時間A組為10.2d,B組為7.2d,差異顯著（P0.05）。B組細胞P3代細胞呈旋渦狀或放射狀生長，細胞形態大小均一（圖2）. 2.2兔BMSCs生長曲線繪制 通過細胞計數法繪制細胞生長曲線，對兔BMSCs的生長特性進行鑒定。結果顯示，P1、P3、P8代細胞培養過程中，細胞生長具有相似的特點：12d細胞處于潛伏期；36d細胞處于對數生長期；68d生長逐漸減慢，開始進入平臺期（圖3）。傳代細胞生長相對穩定，隨著傳代次數的增加，細胞會出現衰老的特征，增殖速度減慢。 2.3兔BMSCs的鑒定 結果顯示，CD44、CD90抗原表達陽性，CD34抗原表達